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Kapitel 6. Anhang

6.1 Zellen und Plasmide

Es folgt eine Übersicht über die in dieser Arbeit verwendeten vorhandenen oder neu konstruierten Plasmide, Vektoren, Bakterien- und Hefestämme:

6.1.1 Bakterienstämme

Als Wirtsstämme für Plasmidkonstrukte wurden entweder der E. coli-Stamm XL-1 blue (Stratagene) oder DH5 (Hanahan, 1983) verwendet. Für die in vitro Mutagenese wurde der Stamm JM109 (Promega) benutzt.

6.1.2 Vektoren

Vektor	Charakteristika	Herkunft oder Referenz
pSEY8	2µm, URA3, AmpR	Emr, S.D. et al., 1986
pALTERTM-1	TetR, ampS	„Altered SitesTM in vitro Mutagenesis System“, Promega
pBluescript	AmpR, lacZ mit MCS	Stratagene
pUC19	AmpR, lacZ mit MCS	GenBank # X02514
pGEM-T	AmpR, lacZ mit MCS, in der MCS linearisierter Vektor mit überhängenden T-Enden zur Klonierung von PCR-Produkten	Promega
pRS414	ARS/CEN, TRP1, AmpR	Sikorski und Hieter, 1989
pRS415	ARS/CEN, LEU2, AmpR	Sikorski und Hieter, 1989
pRS416	ARS/CEN, URA3, AmpR	Sikorski und Hieter, 1989
pRS424	2µm, TRP1, AmpR	Sikorski und Hieter, 1989
pRS425	2µm, LEU2, AmpR	Sikorski und Hieter, 1989
pRS426	2µm, URA3, AmpR	Sikorski und Hieter, 1989
pF1	AmpR, GAL10 (1,5 kb-EcoRI Fragment mit dem GAL10-Promotor, kloniert in die EcoRI Schnittstelle des Vektors pUC19.)	M. Manske
pF1M	AmpR, GAL10 (Deletion eine 12 bp-PstI/XbaI_Fragmentes aus der MCS des Vektors pF1 resultiert in einer unikalen SalI-Schnittstelle des Vektors pF1M.)	C. Volkwein T.A. Rapoport

Plasmide, die eine ARS/CEN-Region oder einen 2µm-ori tragen, können als Shuttle Vektoren zwischen E. coli und Hefe eingesetzt werden. ARS/CEN-Plasmide liegen in einer Kopienzahl von 1 - 2 pro Zelle, 2µm-Plasmide in einer Kopienzahl von 2 - 100 pro Zelle vor.

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6.1.3 Plasmide

Plasmid	Vektor	Insert	Wirts- stamm	Herkunft oder Referenz
pSEC61VII (später pSSH1)	pSEY8 (2µm, URA3)	3545 bp-Insert: SSH1-Gen aus Saccharomyces cerevisiae mit natürlichem Promotor		isoliert aus genomi-scher pSEY8-Hefe-Bank; E.Hartmann
pS61-II (später pSBH2)	pSEY8 (2µm, URA3)	Klon 11/87, enthält das SBH2-Gen aus Saccharomyces cerevisiae		isoliert aus genomi-scher pSEY8-Hefe-Bank; E.Hartmann, K.Finke
HCS12	pSEY8	SEC61-Gen aus Saccharomyces cerevisiae		isoliert aus genomi-scher pSEY8-Hefe-Bank
bsHIS	pBluescript	BamHI-Fragment mit HIS3-Gen aus YEP6		Dr. W. Seufert
pUC-HIS	pUC18	SacI/SalI-Fragment mit HIS3-Gen aus bsHIS		Dr. W. Seufert
bsLEU	pBluescript	SmaI/PstI-Fragment mit LEU2-Gen aus pUC-LEU		Dr. W. Seufert
pASZ11	pUC19	ARS-CEN-Plasmid mit ADE2-Gen		Stotz und Linder, 1990
pKF1	pUC19	ca. 2,4 kb HindIII-Fragment aus HCS12 mit dem S.c. SEC61-Gen	XL-1 blue	diese Arbeit
pKF2	pUC19	1671 bp-PstI/SnaBI-Fragment aus pSEC61VII mit dem vollständigen SSH1-Gen, kloniert in die PstI/SmaI-Schnittstelle von pUC19	XL-1 blue	diese Arbeit
pKF3	pBluescript	1755 bp-NheI/SnaBI-Fragment aus pSEC61VII mit dem vollständigen SSH1-Gen, kloniert in die XbaI/EcoRV-Schnittstelle des pBluescript-Vektors	XL-1 blue	diese Arbeit
pKF4	pUC19	1755 bp-NheI/SnaBI-Fragment aus pSEC61VII mit dem vollständigen SSH1-Gen, kloniert in die XbaI/SmaI-Schnittstelle von pUC19	XL-1 blue	diese Arbeit
pKF5	pBluescript	knock-out-Allel des SSH1-Gens, hergestellt durch Deletion des größten Teiles der kodierenden Region (1171 bp-EcoRV/EcoRI-Fragment aus pKF3) und Insertion eines ca. 1,9 kb-SmaI/EcoRI-Fragmentes aus dem Plasmid pUC-HIS, resultierend in ssh1::HIS3	XL-1 blue	diese Arbeit

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Plasmid	Vektor	Insert	Wirts- stamm	Herkunft oder Referenz
pKF6	pUC19	Vorläuferkonstrukt für pKF7: Insertion eines BamHI-Linkers in die EcoRV-Schnittstelle von pKF4	XL-1 blue	diese Arbeit
pKF7	pBluescript	knock-out-Allel des SSH1-Gens, hergestellt durch Deletion des größten Teiles der kodierenden Region (649 bp-BamHI/BglII-Fragment aus pKF6) und Insertion eines 2243 bp BglII-Fragmentes aus dem Plasmid pASZ11, resultierend in ssh1::ADE2	XL-1 blue	diese Arbeit
pKF8	pGEM-T	PCR-Produkt 945/411: C-Terminus des SSH1-Gens (Nukleotide 1206 - 1484) mit Myc-Epitop (sequenziert)	XL-1 blue	diese Arbeit
pKF9	pGEM-T	PCR-Produkt 1264/411: C-Terminus des SSH1-Gens (Nukleotide 948 - 1484) mit Myc-Epitop (sequenziert)	XL-1 blue	diese Arbeit
pKF10	pGEM-T	PCR-Produkt 1263/411: C-Terminus des SSH1-Gens (Nukleotide 741 - 1484) mit Myc-Epitop (sequenziert)	XL-1 blue	diese Arbeit
pKF11	pALTER	ca. 1,2 kb-EcoRI-Fragment aus pSEC61VII, kloniert in pALTER für in-vitro-Mutagenese	JM109	diese Arbeit
pKF12	pALTER	wie pKF11 mit KpnI-Schnittstelle 5´ vom Stopcodon des SSH1-Gens, eingeführt durch stumme Mutagenese	JM109	diese Arbeit
pKF13	pSEY8 (2µm, URA3)	Substitution des 1,2 kb-EcoRI-Fragments in pSEC61VII durch das 1,2 kb-EcoRI-Fragment aus pKF12 mit der KpnI-Schnittstelle 5´ vom Stopcodon des SSH1-Gens	DH5	diese Arbeit
pKF14	pSEY8 (2µm, URA3)	Insertion eines Linkers aus zwei komplementären Oligonukleotiden (1098 und 1099) in die neu-eingeführte KpnI-Schnittstelle von pKF13 resultierte in einem SSH1-Allel mit Myc-Epitop am C-Terminus: SSH1MYC	XL-1 blue	diese Arbeit
pKF15	pRS414 (ARS/CEN TRP1)	ca. 2,5 kb-SmaI/SalI-Fragment aus pKF14 mit SSH1MYC	XL-1 blue	diese Arbeit
pKF16	pRS414 (ARS/CEN TRP1)	ca. 2,5 kb-SmaI/SalI-Fragment aus pSEC61VII mit dem SSH1-Gen	XL-1 blue	diese Arbeit

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Plasmid	Vektor	Insert	Wirts- stamm	Herkunft oder Referenz
pKF17	pGEM-T	PCR-Produkt 1763/1764: ein 232 bp-Fragment der 5´ flankierenden Region des SBH2-Gens (Nukleotide -215 bis +17) mit einer XbaI-Schnittstelle am 5´-Ende und einer BamHI-Schnittstelle am 3´-Ende (sequenziert)	XL-1 blue	diese Arbeit
pKF18	pGEM-T	PCR-Produkt 1765/1766: ein 411 bp-Fragment der 3´ flankierenden Region des SBH2-Gens (Nukleotide +227 bis +637) mit einer BamHI-Schnittstelle am 5´-Ende und einer EcoRI-Schnittstelle am 3´-Ende (sequenziert)	XL-1 blue	diese Arbeit
pKF19	pBluescript	das 232 bp-Fragment aus pKF17 und das 411 bp-Fragment aus pKF18, kloniert in die XbaI/EcoRI-Schnittstelle des pBluescript-Vektors	XL-1 blue	diese Arbeit
pKF20	pBluescript	Insertion eines 2,2 kb-BglII-Fragmentes aus pASZ11 in die BamHI-Schnittstelle von pKF19, resultierend in sbh2::ADE2.	XL-1 blue	diese Arbeit
pKF21	pBluescript	Insertion eines 1,7 kb-BamHI-Fragmentes aus pUC-HIS in die BamHI-Schnittstelle von pKF19, resultierend in sbh2::HIS3.	XL-1 blue	diese Arbeit
pKF22	pGEM-T	PCR-Produkt 401/404: C-Terminus des S.c. SEC61-Gens (Nukleotide 1192 bis 1765) mit Myc-Epitop vor dem Stop-Codon (sequenziert)	XL-1 blue	diese Arbeit
pKF23	pUC19	Substitution des 363 bp- StyI/AflII-Fragments in pKF1 durch das 392 bp StyI/AflII-Fragment aus pKF22, resultierend in einem SEC61-Allel mit Myc-Epitop am C-Terminus: SEC61MYC	XL-1 blue	diese Arbeit
pKF24	pGEM-T	PCR-Produkt 94/95: ein 410 bp-Fragment der 5´ flankierenden Region des SBH1-Gens (Nukleotide -387 bis +23) mit einer XbaI-Schnittstelle am 5´-Ende und einer BamHI-Schnittstelle am 3´-Ende (sequenziert)	XL-1 blue	diese Arbeit
pKF25	pGEM-T	PCR-Produkt 154/97: ein 361 bp-Fragment der 3´ flankierenden Region des SBH1-Gens (Nukleotide +224 bis + 584) mit einer BamHI-Schnittstelle am 5´-Ende und einer EcoRI-Schnittstelle am 3´-Ende (sequenziert)	XL-1 blue	diese Arbeit

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Plasmid	Vektor	Insert	Wirts- stamm	Herkunft oder Referenz
pKF26	pGEM-T	PCR-Produkt 94/97: das 971 bp-Fragment enthält das SBH1-Gen (Nukleotide -387 bis + 584) mit einer XbaI -Schnittstelle am 5´-Ende und einer EcoRI-Schnittstelle am 3´-Ende (2 Klone (15 und 21), teil-sequenziert)	XL-1 blue	diese Arbeit
pKF27	pGEM-T	PCR-Produkt 140/141: das 359 bp-Fragment enthält den kodierenden Bereich des SBH2-Gens (Nukleotide +1 bis + 359) flankiert durch eine SalI- und eine NcoI-Schnittstelle am 5´-Ende und eine KpnI-Schnittstelle am 3´-Ende (sequenziert)	XL-1 blue	diese Arbeit
pKF28	pGEM-T	PCR-Produkt 142/143: das 374 bp-Fragment enthält den kodierenden Bereich des SBH1-Gens (Nukleotide +1 bis + 374) flankiert durch eine SalI-Schnittstelle am 5´-Ende und eine KpnI-Schnittstelle am 3´-Ende (sequenziert)	XL-1 blue	diese Arbeit
pKF29	pBluescript	das 410 bp-Fragment aus pKF24 und das 361 bp-Fragment aus pKF25, kloniert in die XbaI/EcoRI-Schnittstelle des pBluescript-Vektors	XL-1 blue	diese Arbeit
pKF30	pBluescript	Insertion eines 1,7 kb-BamHI-Fragmentes aus pUC-HIS in die BamHI-Schnittstelle von pKF29, resultierend in sbh1::HIS3.	XL-1 blue	diese Arbeit
pKF31	pRS415 (ARS/CEN LEU2)	ca. 1,8 kb-BamHI/HindIII-Fragment aus pEKF4 mit dem SSS1-Gen unter Kontrolle des induzierbaren GAL-Promotors: GAL-SSS1.	XL-1 blue	K. Finke
pKF32	pRS416 (ARS/CEN URA3)	ca. 2,5 kb-HindIII-Fragment aus pKF23 mit SEC61MYC.	XL-1 blue	K. Finke
pKF33	pRS426 (2µm, URA3)	ca. 2,5 kb-HindIII-Fragment aus pKF23 mit SEC61MYC.	XL-1 blue	K. Finke
pTX73	pUC19	knock-out-Allel des SSH1-Gens, hergestellt durch Deletion des größten Teiles der kodierenden Region (649 bp EcoRV/BglII-Fragment aus pKF4) und Insertion eines ca. 2,2 kb-BamHI/SmaI-Fragmentes aus bsLEU, resultierend in ssh1::LEU2	XL-1 blue	C. Volkwein K. Finke

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Plasmid	Vektor	Insert	Wirts- stamm	Herkunft oder Referenz
pTAR1	pGEM5Z	1521 bp EcoRV/SnaBI-Fragment aus pSEC61VII, das bis auf die ersten 24 Nukleotide die gesamte kodierende Region des SSH1-Gens beinhaltete, kloniert in die EcoRV-Schnittstelle des Vektors pGEM5Z.		C. Volkwein T.A. Rapoport
pTAR2	pGEM5Z	Insertion eines Linkers aus zwei komplementären Oligonukleotiden (1379/1380) in das mit SalI und EcoRV aufgeschnittene Plasmid pTAR1. Rekonstitution derStartregion des SSH1-Gens durch den Linker unter Einführung einer SalI-Schnittstelle unmittelbar vor dem Startcodon und Zerstörung der EcoRV-Schnittstelle durch stumme Mutagenese.		C. Volkwein T.A. Rapoport
pTX75	pF1M	1588 bp ApaI/SalI-Fragment aus pTAR2 kloniert in die SalI-Schnittstelle des Vektors pF1M, so daß das SSH1-Gen unter Kontrolle des GAL10-Promotors war: GAL-SSH1.		C. Volkwein T.A. Rapoport
pTX88	pRS416 (ARS/CEN URA3)	2792 bp-EcoRV/BamHI-Fragment aus pTX75 mit GAL10-SSH1-Fusion, kloniert in den SmaI/BamHI-geschnittenen Hefevektor pRS416.		C. Volkwein T.A. Rapoport

6.1.4 Hefestämme

Stamm	Genotyp	Bemerkungen	Herkunft oder Referenz
YFP338	mat , sec 61-2, leu 2-3,-112, ura 3-52, ade 2-3, pep 4-3		Rose et al., 1989
YTX69	mat a/, homozygot his 3-11,-15, leu 2-3,-112, trp 1-1, ura 3-1, ade 2-1, can 1-100		Hartmann et al., 1994
YTX77	mat a/, sss1::ADE2/SSS1 homozygot his 3-11,-15, leu 2-3,-112, trp 1-1, ura 3-1, ade 2-1, can 1-100	entstanden aus YTX69	Hartmann et al., 1994
YTX80	mat a, sss1::ADE2, pGALSEC61, his 3-11,-15, leu 2-3,-112, trp 1-1, ura 3-1, ade 2-1, can 1-100	entstanden aus YTX77 durch Transformation mit pGALSEC61 nach-folgender Tetradendissektion	Hartmann et al., 1994

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Stamm	Genotyp	Bemerkungen	Herkunft oder Referenz
YTX 83	mat a/, ssh1::LEU2/SSH1, homozygot his 3-11,-15, leu 2-3,-112, trp 1-1, ura 3-1, ade 2-1, can 1-100	entstanden aus YTX69 durch Transformation mit pTX73	T.Sommer C.Volkwein
YTX 84	mat , ssh1::LEU2, his 3-11,-15, leu 2-3,-112, trp 1-1, ura 3-1, ade 2-1, can 1-100	entstanden aus YTX83 durch Tetradendissektion	T.Sommer C.Volkwein
YTX 85	mat a, ssh1::LEU2, his 3-11,-15, leu 2-3,-112, trp 1-1, ura 3-1, ade 2-1, can 1-100	entstanden aus YTX83 durch Tetradendissektion	T.Sommer C.Volkwein
YTX86	mat a, his 3-11,-15, leu 2-3,-112, trp 1-1, ura 3-1, ade 2-1, can 1-100	entstanden aus YTX83 durch Tetradendissektion	T.Sommer C.Volkwein
YTX87	mat , his 3-11,-15, leu 2-3,-112, trp 1-1, ura 3-1, ade 2-1, can 1-100	entstanden aus YTX83 durch Tetradendissektion	T.Sommer C.Volkwein
YKF5	mat , sec 61-2, ssh1::ADE2, leu 2-3,-112, ura 3-52, ade 2-3, pep 4-3	entstanden aus YFP338 durch Transformation mit pKF7	K.Finke
YKF6	mat a/, ssh1::LEU2/ssh1::LEU2, homozygot his 3-11,-15, leu 2-3,-112, trp 1-1, ura 3-1, ade 2-1, can 1-100	entstanden durch Kreuzung von YTX84 und YTX85	K.Finke
YKF7	mat a/, sbh1::HIS3/SBH1, sbh2::ADE2/SBH2, homozygot his 3-11,-15, leu 2-3,-112, trp 1-1, ura 3-1, ade 2-1, can 1-100	entstanden aus YTX69 durch Transformation mit pKF20 und pKF30	K.Finke
YKF8	mat , sbh1::HIS3, his 3-11,-15, leu 2-3,-112, trp 1-1, ura 3-1, ade 2-1, can 1-100	entstanden aus YKF7 durch Tetradendissektion	K.Finke
YKF9	mat , sbh2::ADE2, his 3-11,-15, leu 2-3,-112, trp 1-1, ura 3-1, ade 2-1, can 1-100	entstanden aus YKF7 durch Tetradendissektion	K.Finke
YKF10	mat a, sbh1::HIS3, sbh2::ADE2, his 3-11,-15, leu 2-3,-112, trp 1-1, ura 3-1, ade 2-1, can 1-100	entstanden aus YKF7 durch Tetradendissektion	K.Finke
YKF11	mat a, sbh2:: HIS3, his 3-11,-15, leu 2-3,-112, trp 1-1, ura 3-1, ade 2-1, can 1-100	entstanden aus YTX69 durch Transformation mit pKF21 und nachfolgender Tetradendissektion	K.Finke
YKF12	mat , sbh2:: HIS3, his 3-11,-15, leu 2-3,-112, trp 1-1, ura 3-1, ade 2-1, can 1-100	entstanden aus YTX69 durch Transformation mit pKF21 und nachfolgender Tetradendissektion	K.Finke
YKF13	mat a, sbh1:: HIS3, his 3-11,-15, leu 2-3,-112, trp 1-1, ura 3-1, ade 2-1, can 1-100	entstanden aus YTX86 durch Transformation mit pKF30	K.Finke

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Stamm	Genotyp	Bemerkungen	Herkunft oder Referenz
YKF14	mat a, sbh1:: HIS3, his 3-11,-15, leu 2-3,-112, trp 1-1, ura 3-1, ade 2-1, can 1-100	entstanden aus YKF7 durch Tetradendissektion	K.Finke
YKF15	mat a, sbh2::ADE2, his 3-11,-15, leu 2-3,-112, trp 1-1, ura 3-1, ade 2-1, can 1-100	entstanden aus YKF7 durch Tetradendissektion	K.Finke
YKF16	mat , sbh1::HIS3, sbh2::ADE2, his 3-11,-15, leu 2-3,-112, trp 1-1, ura 3-1, ade 2-1, can 1-100	entstanden aus YKF7 durch Tetradendissektion	K.Finke
YKF17	mat a/, ssh1:: LEU2/SSH1, sbh2:: HIS3/SBH2, homozygot his 3-11,-15, leu 2-3,-112, trp 1-1, ura 3-1, ade 2-1, can 1-100	entstanden durch Kreuzung von YTX84 und YKF11	K.Finke
YKF18	mat a/, ssh1:: LEU2/SSH1, sbh2:: HIS3/SBH2, homozygot his 3-11,-15, leu 2-3,-112, trp 1-1, ura 3-1, ade 2-1, can 1-100	entstanden durch Kreuzung von YTX85 und YKF12	K.Finke
YKF19	mat , ssh1::LEU2, sbh2::HIS3, his 3-11,-15, leu 2-3,-112, trp 1-1, ura 3-1, ade 2-1, can 1-100	entstanden aus YTX84 durch Transformation mit pKF21	K.Finke
YKF20	mat a/, ssh1:: LEU2/SSH1, sbh1:: HIS3/SBH1, homozygot his 3-11,-15, leu 2-3,-112, trp 1-1, ura 3-1, ade 2-1, can 1-100	entstanden durch Kreuzung von YTX85 und YKF8	K.Finke
YKF21	mat a/, ssh1::LEU2/SSH1, sbh2::ADE2/SBH2, homozygot his 3-11,-15, leu 2-3,-112, trp 1-1, ura 3-1, ade 2-1, can 1-100	entstanden durch Kreuzung von YTX85 und YKF9	K.Finke
YKF22	mat a/, ssh1:: LEU2/SSH1, sbh1:: HIS3/SBH1, sbh2::ADE2/SBH2, homozygot his 3-11,-15, leu 2-3,-112, trp 1-1, ura 3-1, ade 2-1, can 1-100	entstanden durch Kreuzung von YTX85 und YKF10	K.Finke
YKF23	mat a/, ssh1::LEU2/SSH1, sbh2:: ADE2/SBH2, sbh1::HIS3/sbh1:: HIS3, homozygot his 3-11,-15, leu 2-3,-112, trp 1-1, ura 3-1, ade 2-1, can 1-100	entstanden durch Kreuzung von YKF25 und YKF10	K.Finke
YKF24	mat a, ssh1::LEU2, sbh1::HIS3, his 3-11,-15, leu 2-3,-112, trp 1-1, ura 3-1, ade 2-1, can 1-100	entstanden aus YKF20 durch Tetradendissektion	K.Finke
YKF25	mat , ssh1::LEU2, sbh1::HIS3, his 3-11,-15, leu 2-3,-112, trp 1-1, ura 3-1, ade 2-1, can 1-100	entstanden aus YKF20 durch Tetradendissektion	K.Finke

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6.2 Vergleich der Nukleotidsequenzen der beiden SEC61-Gene in Säugerzellen

Im folgenden werden die Nukleotidsequenzen der beiden SEC61-Gene aus vier Säugerspezies miteinander verglichen. Die Sequenzen der beiden humanen Gene HS-SEC61-I und -II (HS-1 und HS-2) stammen aus dem Screening einer cDNA-Bank aus HeLa-Zellen, die Sequenzen der Gene RN-SEC61-I und -II (RN-1 und RN-2) aus dem Screening einer cDNA-Bank aus Ratten-Leber und die Sequenzen der Gene CF-SEC61-I und -II (CF-1 und CF-2) aus dem Screening einer cDNA-Bank aus MDCK-Zellen (Madin-Darby-canine kidney-Zellen). Die Sequenzen der beiden Maus-Gene MM-SEC61-I und -II (MM-1 und MM-2) wurden im Zuge der in dieser Arbeit vorgestellten RT-PCR-Experimente ermittelt. Ergänzt werden sie durch Sequenzinformation aus ESTs (markiert durch Unterstreichung mit einer Wellenlinie), die in der GenBank des NCBI veröffentlicht sind (Marra, M. et al., Mouse EST Project; für MM-1: Acc.No. AA410008 und AA245328; für MM-2: Acc.No. AI006571).

Die Nukleinsäurereste der Sequenzen sind grundsätzlich in Großbuchstaben angegeben. Kleine Buchstaben markieren Basen, die nicht vollkommen eindeutig zu lesen waren; mit „x“ sind einzelne Basen bezeichnet, die nicht gelesen werden konnten. Fehlt die Sequenzinformation für mehrere Basen hintereinander, so wird dies durch eine Lücke in der Sequenz angezeigt.

Die Sequenzen sind so angeordnet, daß die vier SEC61-I-Gene bzw. die SEC61-II-Gene jeweils übereinander stehen und verglichen werden können (soweit die Sequenzen bekannt sind). Positionen, die in allen vier SEC61-I-Genen identisch sind, sind grün unterlegt. Positionen, die in allen vier SEC61-II-Genen identisch sind, sind pink unterlegt. Positionen mit identischen Basen in allen aufgeführten Sequenzen, schließlich, sind grau unterlegt.

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