Finke, Kerstin: Untersuchung paraloger SEC61-Gene und -Proteine in Eukaryoten
Untersuchung paraloger SEC61-Gene und -Proteine in Eukaryoten
D i s s e r t a t i o n

zur Erlangung des akademischen Grades
d o c t o r r e r u m n a t u r a l i u m
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von Diplom-Biologin Kerstin Finke ,
(geb. Voss)
geboren am 15. März 1965 in Bremen

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Dr. h.c. H. Meyer

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. J. P. Rabe

Gutachter:
Prof. Dr. Siegfried Prehn
Prof. Dr. Tom A. Rapoport
Prof. Dr. Wolfgang Lockau

Tag der mündlichen Prüfung: 26. April 1999

Zusammenfassung

Der Eintritt löslicher oder membranständiger Proteine in den Sekretionsweg beginnt mit dem Transport der Proteine durch die Membran des Endoplasmatischen Retikulums (ER). Die Translokationspore wird durch den heterotrimeren Sec61-Komplex gebildet. Homologe Membranproteine der alpha- und gamma-Untereinheit dieses Komplexes sind bislang in allen daraufhin untersuchten prokaryotischen und eukaryotischen Organismen gefunden worden. Es handelt sich somit um einen entwicklungsgeschichtlich hoch konservierten Mechanismus des Proteintransports durch Membranen. Zahlreiche Untersuchungen in den letzten Jahren haben uns mittlerweile ein komplexes Bild des Translokationsgeschehens vermittelt.

Die vorliegende Arbeit beleuchtet einen völlig neuen Aspekt der Proteintranslokation: Es zeigt sich, daß Gene, die für Komponenten des Sec61-Komplexes kodieren, in sehr unterschiedlichen eukaryotischen Organismen unabhängig voneinander dupliziert wurden und sich im folgenden nebeneinander weiterentwickelten. Die Untersuchung dieser sog. paralogen Gene und ihrer Genprodukte zum einen in Säugerzellen und zum anderen in der Hefe Saccharomyces cerevisiae ist Gegenstand der Arbeit.

In Säugerzellen finden sich zwei sehr ähnliche SEC61alpha-Gene (knapp 80% Identität auf Nukleinsäureebene, etwa 94% auf Aminosäureebene), deren Expression in verschiedenen Organen und Embryonalstadien der Maus analysiert wurde. In allen bislang getesteten Geweben wurden beide Gene exprimiert. Deutliche Unterschiede zeigten sich allerdings in der Stärke der Expression: Während die Expressionshöhe des bereits bekannten SEC61alpha-I-Gens relativ konstant war, variierte die des paralogen SEC61alpha-II-Gens zwischen den einzelnen Organen. Der selektive Vorteil zweier paraloger SEC61alpha-Gene für den Säugerorganismus liegt somit möglicherweise in der unterschiedlichen Regulierbarkeit ihrer Expression.

In Saccharomyces cerevisiae finden sich paraloge Proteine und dafür kodierende Gene sowohl für die alpha-Untereinheit Sec61p als auch für die beta-Untereinheit Sbh1p des heterotrimeren Sec61p-Komplexes. Der Grad der Identität liegt mit 32% zwischen Sec61p und Ssh1p (Sec sixty-one homolog 1) allerdings erheblich niedriger als in Säugerzellen. Sbh1p und Sbh2p (Sec sixty-one beta homolog 2) sind zu etwa 50% identisch. Für die gamma-Untereinheit Sss1p wurde kein paraloges Protein gefunden. Es konnte gezeigt werden, daß die beiden, hier neu beschriebenen Proteine Ssh1p und Sbh2p zusammen mit Sss1p einen eigenständigen, heterotrimeren Komplex, den Ssh1p-Komplex, bilden, der ebenfalls in der ER-Membran lokalisiert ist und eine Funktion beim Proteintransport durch diese Membran hat. Im Gegensatz zu SEC61 ist SSH1 nicht essentiell, wenn auch das Ssh1p für normale Wachstumsraten erforderlich ist. Die Deletion des SBH2-Gens zeigt keinen Phänotyp, was allerdings für die des SBH1-Gens ebenfalls gilt. Erst das Fehlen beider Proteine führt zu einem temperatur-abhängigen Wachstumsphänotyp und zu Defekten in der Translokation.

Der entscheidende Unterschied zwischen dem Sec61p- und dem Ssh1p-Komplex scheint darin zu bestehen, daß der Sec61p-Komplex modulartig einsetzbar ist: als trimerer Komplex bei der kotranslationalen Translokation und im heptameren Sec-Komplex beim posttranslationalen Proteintransport. Demgegenüber deuten die Untersuchungen des Ssh1p-Komplexes darauf hin, daß dieser nicht mit dem tetrameren Sec62p-Sec63p-Komplex zum heptameren Sec-Komplex assoziieren kann. Vielmehr läßt er sich in Assoziation mit membrangebundenen Ribosomen nachweisen, was auf eine ausschließliche Funktion des Ssh1p-Komplexes bei der kotranslationalen Translokation schließen läßt.

Schlagwörter:
Endoplasmatisches Retikulum, Proteintranslokation, Sec61, Eukaryoten

Abstract

Soluble or membrane proteins entering the secretory pathway are first translocated across the endoplasmic reticulum (ER) membrane. The proteins move through a channel formed by the heterotrimeric Sec61-complex. Homologues of the alpha- and gamma-subunit of this complex have been found in a wide variety of procaryotic and eucaryotic organisms indicating an evolutionary highly conserved mechanism for translocating proteins across membranes. Several recent investigations contributed to a complex understanding of this process.

The work presented here sheds light on a completely new aspect of protein translocation across the ER-membrane: Interestingly genes coding for components of the Sec61-complex are found to have been duplicated independently in diverse eucaryotic organisms giving rise to so called paralogous genes (= intraspecies homologues) co-evolving after duplication. These paralogous genes and their gene products in mammalian cells as well as in the yeast Saccharomyces cerevisiae have been analyzed in detail.

Mammalian cells possess two very similar SEC61alpha-genes (about 80% identity on nucleic acid level, about 94% on protein level). Their expression has been analyzed for several murine organs and embryonic stages. All tissues tested so far showed expression of both genes though the level of expression differed significantly: whereas expression of the already known SEC61alpha-I-gene seemed to be more or less constant across different tested organs, expression levels of the paralogous SEC61alpha-II-gene were not. Consequently the ability to differentially regulate the expression of the two paralogous SEC61alpha-genes may be of selective advantage for the mammalian organism.

In the yeast Saccharomyces cerevisiae paralogous proteins of the alpha-subunit Sec61p as well as for the beta-subunit Sbh1p of the heterotrimeric Sec61p-complex can be found. The paralogous alpha-subunits Sec61p and Ssh1p (Sec sixty-one homolog 1) are less well conserved (32% identity) than the mammalian paralogues. Sbh1p and Sbh2p (Sec sixty-one beta homolog 2) are 50% identical. No paralogous protein was found for the gamma-subunit Sss1p. Instead, it could be shown that the new proteins Ssh1p and Sbh2p together with Sss1p are found in a heterotrimeric complex, the Ssh1p-complex, which like the Sec61p-complex localizes to the ER-membrane and has a function in translocating proteins across this membrane. In contrast to Sec61p Ssh1p is not essential for cell viability but it is required for normal growth rates. Sbh1p and Sbh2p individually are also not essential, but cells lacking both proteins are impaired in their growth at elevated temperatures and show translocation defekts in vivo as well as in vitro.

The most intriguing difference between the Sec61p-and the Ssh1p-complex might be that the Sec61p-complex has a role in both co- and post-translational translocation pathways, as a separate entity and as part of the heptameris Sec-complex, respectively. However, there was no evidence for the Ssh1p-complex being part of an heptameric complex together with the tetrameric Sec62p-Sec63p-complex, but association of the trimeric Ssh1p-complex with membrane-bound ribosomes could be shown, making it likely that the Ssh1p-complex functions exclusively in the co-translational pathway of protein transport.

Keywords:
endoplasmic reticulum, protein translocation, Sec61, eucaryotes


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Inhaltsverzeichnis

TitelseiteUntersuchung paraloger SEC61-Gene und -Proteine in Eukaryoten
Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis
1 Zusammenfassung
2 Einleitung
2.1Proteintranslokationssysteme
2.2Proteintranslokation durch die Membran des Endoplasmatischen Retikulums
2.2.1Die kotranslationale Translokation
2.2.2Die posttranslationale Translokation
2.2.3Ko- versus posttranslationaler Transport
2.3Die Komponenten des Translokationsapparates
2.3.1Entwicklungsgeschichtliche Konservierung
2.3.2Der trimere Sec61p-Komplex
2.3.3Der heptamere Sec-Komplex
2.4Paraloge SEC61-Gene in Eukaryoten - Problemstellung
3 Ergebnisse
3.1Zwei SEC61alpha-Gene in Säugerzellen
3.1.1Vergleich der Nukleinsäure- und Proteinsequenzen
3.1.2Analyse der Expression beider SEC61alpha-Gene mittels RT-PCR
3.2SEC61-Paraloge in der Hefe S. cerevisiae
3.2.1Das Ssh1-Protein
3.2.1.1Lokalisierung des Ssh1p in der Membran des Endoplasmatischen Retikulums
3.2.1.2Deletion des SSH1-Gens
3.2.1.3Genetische Interaktion zwischen SSH1 und SEC61
3.2.1.4Einfluß der SSH1-Deletion auf die Akkumulation von Präkursoren
3.2.2Paraloge beta-Untereinheiten
3.2.2.1Deletion der SBH-Gene
3.2.2.2Beteiligung von Sbh1p und Sbh2p an der Proteintranslokation
3.2.3Der Ssh1p-Komplex
3.2.3.1Herstellung peptidspezifischer Antikörper gegen Ssh1p und Sbh2p und Immunoblot-Analyse diverser Deletionsstämme
3.2.3.2Der Ssh1p-Komplex in wt-Zellen
3.2.3.3Austauschbarkeit der beta-Untereinheiten
3.2.3.4Der Ssh1p-Komplex in der ts-Mutante sec61-2
3.2.3.5Ribosomenassoziation des Ssh1p-Komplexes
4 Diskussion
4.1Die paralogen SEC61alpha-Gene in Säugerzellen
4.2Der Ssh1p-Komplex - ein zweiter aktiver Translokations-komplex in der ER-Membran von S. cerevisiae
4.3Die Rolle der beta-Untereinheiten in der Translokation
5 Material und Methoden
5.1Allgemeine Methoden
5.2Methoden für die RT-PCR-Analyse der beiden SEC61alpha-Gene in Säugerzellen
5.2.1Ausgangsmaterial für die Gewinnung von RNA für die RT-PCRs
5.2.2Isolierung von RNA
5.2.3Reverse Transkription (RT)
5.2.4PCR
5.2.5Primerkombinationen für RT-PCR-Experimente
5.2.6´-race
5.3Methoden beim Arbeiten mit S. cerevisiae
5.3.1Wachstumsbedingungen und verwendete Medien
5.3.2Kreuzung, Sporulation und Tetradenanalyse
5.3.2.1Kreuzung von Hefestämmen
5.3.2.2Sporulation
5.3.2.3Tetradenanalyse
5.3.3Transformation von Hefezellen mit Plasmid-DNA
5.3.4Isolierung genomischer DNA aus Hefezellen
5.4Klonierung und Deletion der Gene SSH1, SBH1 und SBH2
5.4.1Klonierung des SSH1-Gens
5.4.2Deletion des SSH1-Gens
5.4.3Klonierung des SBH1-Gens
5.4.4Deletion des SBH1-Gens
5.4.5Klonierung des SBH2-Gens
5.4.6Deletion des SBH2-Gens
5.4.7Einbringen der Deletionskonstrukte in Hefezellen
5.5Immunfluoreszenz
5.5.1Epitop-Tagging des SSH1-Gens
5.5.2Zellen für die Immunfluoreszenz
5.5.3Antikörper für die Immunfluoreszenz
5.5.4Immunfluoreszenz von Hefezellen
5.6Analyse des Ssh1p-Komplexes
5.6.1Isolierung von Membranen aus Hefezellen
5.6.1.1Membranpräparationen in analytischem Maßstab
5.6.1.2Isolierung von Hefemikrosomen in präparativem Maßstab
5.6.2Herstellung von Digitoninextrakten aus Hefemikrosomen
5.6.3Präparation von RAMP-Fraktionen
5.6.4Antikörper
5.6.5Immunpräzipitationen
5.6.6Reinigung des Ssh1-Komplexes (nach S. Panzner)
5.7Akkumulation von Präkursor-Proteinen in mutanten Zellen
5.7.1Klonierung des SSH1-Gens unter Kontrolle des GAL10-Promotors
5.7.2Radioaktive Markierung der Zellen und Immunpräzipitation
6 Anhang
6.1Zellen und Plasmide
6.1.1Bakterienstämme
6.1.2Vektoren
6.1.3Plasmide
6.1.4Hefestämme
6.2Vergleich der Nukleotidsequenzen der beiden SEC61alpha-Gene in Säugerzellen
Bibliographie Literaturverzeichnis
Lebenslauf
Selbständigkeitserklärung
Danksagung

Tabellenverzeichnis

Tab. 1. Transportsysteme zur Proteintranslokation. Aufgeführt sind die Membranen durch die der Proteintransport stattfindet, sowie in Klammern Ausgangs- und mögliche Zielorte der transportierten Proteine (Einteilung nach Schatz und Dobberstein, 1996).
Tabelle 2. Vergleich der wichtigsten Komponenten für den Proteintransport durch die eukaryotische ER-Membran (Säugerzellen; S. cerevisiae) bzw. prokaryotische Zytoplasmamembran (E. coli; Archaebakterien). Homologe Komponenten finden sich in einer Zeile. Quellen: SRP/SRP-Rezeptor: Walter und Johnson, 1994 und darin zitierte Originalia; The Signal Recognition Particle Database (SRPDB, Larsen et al., 1998). Sec-Komponenten/TRAM/BiP: Rapoport et al., 1996 und darin zitierte Originalia; Pohlschröder et al., 1997; Daimon et al., 1997 (HTP1); H.A. Meyer und E.Hartmann, unveröffentlicht (Säuger-Sec63). Signalpeptidase: Meyer und Hartmann, 1997 und darin zitierte Originalia. Oligosaccharyltransferase: Silberstein und Gilmore, 1996 und darin zitierte Originalia; MacGrogan et al., 1996; Karaoglu et al., 1997; Smith et al., 1997; Zambrowicz et al., 1998.
Tabelle 3. GC-Gehalt der untersuchten Säuger-SEC61alpha-Gene
Tabelle 4. Konservierung der Sec61-Proteine aus Hefe und Säugerzellen bezüglich ihrer gemäß der putativen Membrananker vorhergesagten subzellulären Lokalisation. Zyt., zytoplasmatische Bereiche; Lum., luminale Bereiche; TM, Transmembranbereiche.

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1. Modell der kotranslationalen Translokation. Schematisch dargestellt sind das „Targeting“ (mit SRP-Zyklus) des Ribosoms und der naszierenden Kette an die ER-Membran sowie frühe Stadien der Translokation (nach Rapoport et al., 1996, modifiziert). (I) „Targeting“: Sobald die Signalsequenz der wachsenden Polypeptidkette das Ribosom verlassen hat, kann SRP sowohl an die Signalsequenz als auch an das Ribosom binden (Schritt 1). Im 2. Schritt bindet der Komplex aus Ribosom, naszierender Kette und SRP an die ER-Membran. Dies geschieht durch Wechselwirkungen sowohl zum SRP-Rezeptor (SR) als auch zum Sec61p-Komplex, der die Translokationspore bildet. Im folgenden kommt es zu einer kooperativen Bindung von GTP sowohl an SRP als auch an die alpha-Untereinheit des SRP-Rezeptors (SRalpha) (Schritt 3; Rapiejko und Gilmore, 1997). Daraufhin kann die Signalsequenz von SRP auf die alpha-Untereinheit des Sec61p-Komplexes (Sec61alpha) übertragen werden (Schritt 4). Damit ist das „Targeting“ abgeschlossen und die eigentliche Translokation der Polypeptidkette kann beginnen. Durch GTP-Hydrolyse sowohl durch SRP als auch SRalpha kann SRP sich vom SR lösen (Schritt 5). Aufgrund ihrer geringen Affinität zu GDP können SRP und SRalpha in ihren Nukleotid-freien Zustand zurückkehren (Schritt 6) und stehen damit für eine weitere „Targeting“-Runde zur Verfügung.
(II) Translokation: Schritt 7 zeigt die Insertion der naszierenden Kette in die Translokationspore. Dabei hat die Signalsequenz zum Sec61p-Komplex und zusätzlich zur Lipidschicht Kontakt. Das Ribosom ist in dieser Phase nur locker an den Sec61p-Komplex gebunden. Im weiteren nimmt das naszierende Polypeptid im Zuge der Kettenverlängerung eine Loop-Struktur an, und die Signalsequenz wird in einem Erkennungsschritt, in den der Sec61p-Komplex und das TRAM-Protein involviert sind, ein weiteres Mal überprüft. Bei funktioneller Signalsequenz resultiert nun die endgültige Insertion der naszierenden Kette in die Translokationspore: die Signalsequenz ist in Kontakt mit dem TRAM-Protein, das Ribosom ist fest an den Sec61p-Komplex gebunden, und die Translokationspore öffnet sich zum Lumen hin (Schritt 8). Schritt 9 zeigt die Phase der Translokation, in der die Signalsequenz bereits abgeschnitten ist, TRAMp befindet sich nicht länger in unmittelbarer Nähe zu der naszierenden Kette, die mittlerweile eine transmembrane Orientierung angenommen hat. Die wachsende Polypeptidkette wird durch einen kontinuierlichen, nach außen fest versiegelten Kanal aus Ribosom und Sec61p-Komplex durch die Membran transferiert (für weitere Einzelheiten und Referenzen, siehe Text).
Abbildung 2. Modell der posttranslationalen Translokation. Zytosolische Chaperone der Hsp70-Proteinfamilie binden im Zytosol an Präkursorproteine, die für den Transport durch die ER-Membran vorgesehen sind (Schritt 1). Die Signalsequenz wird in Abwesenheit von ATP von Sec61p erkannt und gebunden (Schritt 2). Die Insertion in den Translokationskanal erfolgt in einer Loop-Struktur, die Signalsequenz interkaliert dabei an der Grenzfläche zwischen Kanal und Lipiden zwischen die Transmembrandomänen 2 und 7 des Sec61p. Die Signalsequenz befindet sich dabei ebenfalls in unmittelbarer Nachbarschaft zu Sec62p und Sec71p, der C-Terminus des Präkursors zusätzlich noch zu Sec72p. Die eigentliche Translokation der Peptidkette wird in einer ATP-abhängigen Reaktion durch das luminale Hsp70-Protein BiP vermittelt (Schritt 3). Dafür ist eine Wechselwirkung des BiP-Proteins mit der DnaJ-homologen Domäne des Sec63p notwendig. (Schematische Darstellung unter Berücksichtigung der Ergebnisse von Plath et al., 1998)
Abbildung 3. Schema zur Verdeutlichung der Begriffe homolog, ortholog und paralog. Beispielhaft gezeigt ist ein Dendrogramm für fünf homologe Gene (und ggf. deren Genprodukte) aus vier Organismen. Der rote Querbalken markiert ein Genduplikations-ereignis. Die Gene 3a und 3b finden sich innerhalb eines Organismus und sind somit paralog zueinander. Gen 3a und Gen 3b sind jeweils ortholog zu den Genen 1, 2 und 4.
Abbildung 4. Übersicht über die zu Beginn der Arbeit vorliegenden Klone der beiden SEC61alpha-Gene aus drei Säugerspezies. Die Klone der beiden humanen Gene HS-SEC61alpha-I und -II (HS-1 und HS-2) stammen aus dem Screening einer cDNA-Bank aus HeLa-Zellen, die Sequenzen der Gene RN-SEC61alpha-I und -II (RN-1 und RN-2) aus dem Screening einer cDNA-Bank aus Ratten-Leber und die Sequenzen der Gene CF-SEC61alpha-I und -II (CF-1 und CF-2) aus dem Screening einer cDNA-Bank aus MDCK-Zellen (Madin-Darby-canine kidney-Zellen). RN-2 ist ein falsch gespleißter Klon mit Rasterschub. CF-2 sind zwei einzelne, unvollständige Klone. Balken markieren kodierende Sequenzabschnitte, Linien die flankierenden nicht-kodierenden Bereiche. Die Länge der jeweiligen Abschnitte ist durch die Anzahl der Nukleotide angegeben. Der vollständig kodierende Bereich ist für beide Gene 1431 bp (Basenpaare) lang.
Abbildung 5. Vergleich der DNA-Sequenzen der kodierenden Region des SEC61alpha-I-Gens (MM-1) und des SEC61alpha-II-Gens (MM-2) der Maus. Identische Nukleinsäurereste sind grau unterlegt. Unterstreichung mit einer Wellenlinie markiert Genabschnitte, deren Sequenzinformation aus ESTs (expressed sequence tags) stammt, die in der GenBank des NCBI veröffentlicht sind (Marra, M. et al., Mouse EST Project; für MM-1: Acc.No. AA410008 und AA245328; für MM-2: Acc.No. AI006571).
Abbildung 6. Vergleich der Aminosäuresequenzen der beiden Sec61alpha-Proteine, die durch die Gene SEC61alpha-I und SEC61alpha-II in Säugerzellen kodiert werden. Fett gedruckte Sequenzen markieren membranspannende Segmente, farbig markierte Aminosäurereste kennzeichnen Unterschiede zwischen beiden Sequenzen
Abbildung 7. Expression der beiden SEC61alpha-Gene in diversen Geweben der Maus. Für die Untersuchung der Expression der beiden Gene wurde Gesamt-RNA verschiedener Organe sowie PolyA+-RNA aus 8 Embryonal-stadien revers transkribiert und die resultierende cDNA mit typ- und speziesspezifischen Oligonukleotiden für die beiden SEC61alpha-Gene per PCR amplifiziert. Für die Amplifikation des SEC61alpha-I-Gens wurde das Primerpaar 1181/757, für die des SEC61alpha-II-Gens das Primerpaar 1182/758 eingesetzt. Die verwendeten Oligonukleotide führten zur Amplifikation nahezu des gesamten kodierenden Bereiches (1350 bp) der beiden Gene. Zum Vergleich der eingesetzten Mengen an RNA bzw. cDNA in den einzelnen Ansätzen wurde als Kontrolle ein 246 bp-Fragment des konstitutiv exprimierten HPRT-Gens amplifiziert (mit dem Primerpaar 825/824). L-Milz, Milz aus einer an einem Lymphom erkrankten Maus; Ed8,5, Embryonaltag 8,5 usw.. Als DNA-Größenmarker wurde der 1kb-DNA-Marker der Fa. Gibco verwendet. Die Sequenzen der hier verwendeten Primer sowie der für andere RT-PCR-Experimente eingesetzten Primer findet sich in Abschnitt 5.2.5.
Abbildung 8. Vergleich der Aminosäuresequenzen von Ssh1p und Sec61p aus S. cerevisiae. Entsprechend ihrer Lokalisation sind die Proteinabschnitte farblich abgesetzt: rotgedruckte, unterstrichene Sequenzabschnitte markieren die Position der putativen Membrananker, in schwarzer Schrift erscheinen die zytoplasmatischen, in blauer Schrift die luminalen Protein-segmente. Punkte über bzw. unter den Sequenzen markieren Positionen mit identischen Aminosäureresten im Vergleich zum Säuger SEC61alpha-I-Protein. Membrananker für Ssh1p kalkuliert mit MEMSAT.
Abbildung 9. Lokalisierung des Ssh1p in der ER-Membran. Die indirekte Immunfluoreszenz wurde anhand von haploiden Zellen durchgeführt, die entweder die Myc-markierte Version des Ssh1-Proteins, Ssh1Myc, exprimiert von dem Plasmid pKF15, trugen (die zwei oberen Reihen) oder anhand von Zellen, die den Kontrollvektor pRS414 trugen (untere Reihe). Als Kontrolle für die spezifische Anfärbung der ER-Membran (obere Reihe) wurden die Zellen mit Antikörpern gegen das luminale ER-Protein Kar2p inkubiert. Die Zellen der unteren beiden Reihen wurden mit 9E10 Antikörpern spezifisch für das c-Myc-Epitop inkubiert. Zusätzlich wurden alle Proben mit DAPI gefärbt, um die Position der Kerne anzuzeigen (rechte vertikale Reihe).
Abbildung 10. Wachstumsphänotyp der SSH1-Deletionsmutante. Zellen eines wt-Stammes und einer Deltassh1-Mutante wurden hinsichtlich ihres Wachstumsverhaltens bei 30°C in Vollmedium getestet. Dargestellt ist die Absorption (Optische Dichte) der Kulturen bei 600 nm (OD600nm), halblogarithmisch aufgetragen in Abhängigkeit von der Zeit. Die Verdopplungszeit wurde aus der Steigung der Geraden während der Phase des exponentiellen Wachstums ermittelt.
Abbildung 11. Genetische Interaktion zwischen SEC61 und SSH1. Zellen eines wt-Stammes, einer ts-Mutante bezüglich SEC61 (sec61-2), einer SSH1-Deletionsmutante (Deltassh1) sowie einer Doppelmutante (sec61-2 Deltassh1) wurden auf Wachstum bei 36°C auf Platten mit Vollmedium getestet.
Abbildung 12. Untersuchung auf Akkumulation von Prä-kursorproteinen nach Entzug des Ssh1-Proteins. Mutante Zellen, die das SSH1-Gen unter Kontrolle eines Galak-tose-induzierbaren Promotors trugen, und Zellen eines wt-Stammes wurden 0, 7 und 13 h nach Austausch der Kohlenstoffquelle von Galak-tose durch Glucose auf ihren Gehalt an Ssh1-Protein hin untersucht. Dies geschah durch Immunoblotting von Membranpräparationen (entsprechend 1 OD600nm) der Zellen zum jeweiligen Zeit-punkt. Für die Untersuchung auf Präkursorakkumulation wurden die Zellen für 10 min mit [35S]-Methionin markiert, anschließend wurden Zellextrakte präpariert, die für die Immunpräzipitation mit dem Antikörper gegen den alpha-Faktor eingesetzt wurden. Als Positivkontrolle wurden Zellen des temperatur-sensitiven sec61-2-Stammes verwendet, die für 2 h bei der nicht-permissiven Temperatur (38°C) inkubiert wurden, bevor sie für die Immunpräzipitation radioaktiv markiert wurden. Die gefällten Proteine wurden mittels SDS-PAGE und Autoradiographie analysiert. ppalphaF bezeichnet den akkumulierten Präpro-alpha-Faktor, der Stern markiert unspezifische Banden, die durch die Ssh1p-Antikörper erkannt werden.
Abbildung 14. Test der Deletionsmutanten von Sbh1p und Sbh2p auf Wachstumsdefekte. Das Wachstum von Zellen eines wt-Stammes und der Deletionsmutanten Deltasbh1und Deltasbh2 sowie der Doppelmutante Deltasbh1 Deltasbh2 wurde bei 30°C und 37°C auf Agarplatten mit Vollmedium getestet.
Abbildung 15. (A) Das Wachstum von Zellen eines wt-Stammes sowie der Mutanten Deltassh1, Deltassh1 Deltasbh2 und Deltassh1 Deltasbh1 wurde bei 30°C auf Agarplatten mit Vollmedium getestet. (B) Verdopplungszeiten diverser Mutanten bei Wachstum in Vollmedium bei 30°C in Flüssigkultur. Zellen eines wt-Stammes sowie diverser Deletionsmutanten wurden aus über Nacht gewachsenen Vorkulturen in Vollmedium mit einer optischen Dichte OD600nm von 0,15 angeimpft und bei 30°C schüttelnd inkubiert. Pro Stamm wurden jeweils drei Kulturen parallel untersucht. Im Untersuchungszeitraum von 12 h wurden zur Bestimmung der optischen Dichte der Kulturflüssigkeit bei 600 nm Proben im Abstand von etwa 1,5 h entnommen. Die Ermittlung der Verdopplungszeit erfolgte nach halblogarithmischer Auftragung der OD600nm in Abhängigkeit von der Inkubationszeit. Die oben angegebenen Werte stellen Mittelwerte dar (in Klammern die Standardabweichung). Die Ergebnisse dieses Experiments stehen repräsentativ für zahlreiche andere Untersuchungen.
Abbildung 16. Präkursorakkumulation in den Sbh1p- und Sbh2p-Deletionsmutanten. Zellen eines wt-Stammes, der Deletionsmutanten Deltasbh1 und Deltasbh2 sowie der Doppelmutante Deltasbh1 Deltasbh2 wuchsen bei 30°C bis zur exponentiellen Phase und wurden dann für 2 h bei 38°C inkubiert. Anschließend wurden sie für 10 min mit [35S]-Methionin markiert. Zellextrakte wurden hergestellt und für Immunpräzipitationen mit Antikörpern gegen Kar2p oder alpha-Faktor verwendet. Die gefällten Proteine wurden mittels SDS-PAGE und Autoradiographie mit 10%igen (Kar2p) bzw. 15%igen (alpha-Faktor) Polyacrylamidgelen analy-siert. preKar2 und ppalphaF sind die jeweiligen Präkursoren von Kar2p und alpha-Faktor.
Abbildung 17. Spezifität der Antikörper gegen Ssh1p und Sbh2p. Membranen wurden aus exponentiell wachsenden Zellen eines wt-Stammes bzw. der Mutanten Deltassh1 und Deltasbh2 präpariert und durch SDS-PAGE mit 13%igen Polyacrylamidgelen aufge-trennt, bevor sie für Immunoblots mit Antikörpern gegen Ssh1p und Sbh2p bzw. Sec61p und Sbh1p eingesetzt wurden. Die Punkte markieren die Position von Sbh2p, mit dem die Antikörper gegen Sbh1p im Blot kreuzreagieren, die Sterne unspezi-fische Banden, die durch die Antikörper gegen Ssh1p erkannt werden.
Abbildung 18. Immunoblot-Analyse diverser SSH1-, SBH1- und SBH2-Deletionsmutanten. Untersuchung der Mutanten wie in der Legende zu Abb. 17 beschrieben.
Abbildung 19. Untersuchung der Assoziation von Translokationskompo-nenten durch Koimmunpräzipitation. Mikrosomen aus wt-Zellen wurden mit Digitonin solubilisiert, Aliquots dieses Detergenzextraktes entsprechend 10 eq Mikrosomen (eq, 1 Äquivqalent ist definiert als 1 µl einer Membran-suspension mit OD280nm von 50) wurden mit diversen Antikörpern immunpräzipitiert. Das gefällte Material wurde durch SDS-PAGE aufgetrennt und die kopräzipitierten Proteine mittels diverser Antikörper analysiert. Der Stern rechts markiert die Position der schweren Kette der Immunglobuline; die Punkte kennzeichnen Proteinbanden, die durch die Kreuzreaktivität der gegen Sbh1p gerichteten Antikörper mit Sbh2p in der Immunpräzipitation (Bahn 2) und/oder im Blot (Sbh1p-Detektion) verursacht werden. Grün bzw. rot eingerahmt sind die Banden, die die Assoziation der Komponenten des trimeren Sec61p-Komplexes bzw. des trimeren Ssh1p-Komplexes widerspiegeln.
Abbildung 20. Immunoblotanalyse eines wt-Stammes und der Mutante YTX80 (Deltasss1:ADE2 pGAL-Sec61gamma) mit Antiseren gegen Sss1p und das Säuger Sec61gamma-Protein.
Abbildung 21. Reinigung des Ssh1p-Komplexes. Gezeigt ist der letzte Reinigungsschritt, in dem die Proteine auf einer SP-Sepharose-Säule aufgetrennt wurden. (A) Die Proteine aus den einzelnen Fraktionen, jeweils 1000 eq Mikrosomen entsprechend, wurden in einem SDS-Gel aufgetrennt und mit Coomassie Blau angefärbt. Die numerierten Pfeile über dem Gel markieren die Position der verschiedenen Komplexe: Pfeil 1, trimerer Sec61p-Komplex aus Sec61p (kleiner Pfeil), Sbh1p (mittleres Dreieck) und Sss1p (unteres Dreieck); Pfeil 2, trimerer Ssh1p-Komplex aus Ssh1p (Kreis), Sbh2p und Sss1p (Dreiecke, die beiden Proteine ko-migrieren); Pfeil 3, Ssh1p-Komplex aus Ssh1p (Kreis), Sss1p (linkes Dreieck, die obere Bande) und einer N-terminal verkürzten Form des Sbh2p (rechtes Dreieck, die untere Bande; die N-terminale Sequenz dieses Proteins wurde bestimmt als RRQAQSIKEKQAKQTPT und entspricht damit Sbh2p, beginnend mit Aminosäure-rest 16 des vollständigen Proteins). (B) Immunoblot-Analyse der in (A) gezeigten Fraktionen mit diversen Antikörpern. Die eingesetz-ten Proben entsprechen jeweils 20 eq Mikrosomen. Die numerierten Pfeile über dem Gel markieren die Position der verschiedenen Komplexe. Pfeil 4, dimerer Komplex aus Ssh1p und Sss1p, der nur in geringen Mengen vorkommt (nicht sichtbar auf dem in (A) gezeigten Coomassie-gefärbten Gel). Der Punkt kennzeichnet eine Proteinbande, die durch die Kreuzreaktivität der gegen Sbh1p gerichteten Antikörper mit Sbh2p im Blot verursacht wird.
Abbildung 22. Koimmunpräzipitation von Translokationskomponenten in beta-Deletionsstämmen. Mikrosomen aus Mutanten, denen entweder das SBH1-Gen (Bahnen 1-6), das SBH2-Gen (Bahnen 7-12) oder beide (Bahnen 13-18) fehlten, wurden in Digitonin solubilisiert. Aliquots dieses Detergenzextraktes, entsprechend jeweils 10 eq Mikrosomen, wurden für Immunpräzipitationen mit diversen Antikörpern eingesetzt. Das gefällte Material wurde in SDS-Gelen aufgetrennt und die kopräzipitierten Proteine durch Immunoblot mit verschiedenen Antikörpern analysiert. Die Sterne markieren die Position der schweren Kette der Immunglobuline, die Punkte kennzeichnen Proteinbanden, die durch die Kreuzreaktivität der gegen Sbh1p gerichteten Antikörper mit Sbh2p in der Immunpräzipitation verursacht werden. Grün bzw. rot eingerahmt sind die Banden, die die Assoziation der Komponenten des Sec61p- bzw. Ssh1p-Komplexes widerspiegeln.
Abbildung 23. Ein mutanter Sec61p-Komplex in der Deletionsmutante Deltassh1 Deltasbh1. Mikrosomen aus wt-Zellen oder aus Mutanten, denen entweder das SSH1-Gen oder das SSH1- und das SBH1-Gen fehlten, wurden in Digitonin solubilisiert. Aliquots dieses Detergenzextraktes, entsprechend jeweils 10 eq Mikrosomen, wurden für Immunpräzipitationen mit diversen Antikörpern eingesetzt. Die Auftrennung des gefällten Materials erfolgte in SDS-Gelen, die Analyse der kopräzipitierten Proteine anschließend durch Immunoblot mit verschiedenen Antikörpern. Die Punkte kennzeichnen Proteinbanden, die durch die Kreuzreaktivität der gegen Sbh1p gerichteten Antikörper mit Sbh2p in der Immunpräzipitation (Bahnen 2 und 14) und/oder im Blot (Sbh1p-Detektion) verursacht werden. Grün bzw. rot eingerahmt sind die Banden, die die Assoziation der Komponenten des trimeren Sec61p-Komplexes bzw. des trimeren Ssh1p-Komplexes widerspiegeln.
Abbildung 24. Immunpräzipitationen von Translokationskomponenten aus der ts-Mutante sec61-2. Mikrosomen wurden aus Zellen der ts-Mutante sec61-2 nach 2-stündiger Inkubation bei der nicht-permissiven Temperatur von 38°C isoliert. Daraus hergestellte Digitoninextrakte wurden für Immunpräzipitationen mit diversen Antikörpern eingesetzt. Das gefällte Material, entsprechend 10 eq Mikrosomen, wurde im SDS-Gel aufgetrennt und im Immunoblot mit diversen Antikörpern analysiert. Die Punkte kennzeichnen Proteinbanden, die durch die Kreuzreaktivität der gegen Sbh1p gerichteten Antikörper mit Sbh2p im Blot verursacht werden. Grün bzw. rot eingerahmt sind die Banden, die die Assoziation der Komponenten des trimeren Sec61p-Komplexes bzw. des trimeren Ssh1p-Komplexes widerspiegeln.
Abbildung 25. Der Ssh1p-Komplex findet sich in Assoziation mit membrangebundenen Ribosomen. (A) Hefemikrosomen (RM, rauhe Mikrosomen) wurden in einem Hochsalzpuffer, der 0,8 M Kaliumacetat enthielt, gewaschen, um periphere Membranproteine zu entfernen, und danach in Digitonin solubilisiert. Die anschließende Zentrifugation ergab einen Überstand, den Digitoninextrakt (DE) und ein Pellet, das die Ribosomen und mit ihnen assoziierte Membranproteine enthielt. Letztere wurden aus dem Pellet durch Behandlung mit Puromycin unter hohen Salzkonzentrationen herausgelöst (RAMP). Aliquots entsprechend 10 eq Mikrosomen wurden per SDS-PAGE und Immunoblot mit diversen Antikörpern analysiert. (B) Die RAMP-Fraktion (jeweils 20 eq Mikrosomen entsprechend) wurde für Koimmunpräzipitationsexperimente mit Antikörpern gegen Sec61p, Sbh1p, Sss1p, Ssh1p, Sbh2p und Sec62p eingesetzt. Die Analyse des gefällten Materials erfolgte durch SDS-PAGE und Immunoblot mit diversen Antikörpern. Die Sterne markieren die Position der schweren Kette der Immunglobuline, die Punkte kennzeichnen Proteinbanden, die durch die Kreuzreaktivität der gegen Sbh1p gerichteten Antikörper mit Sbh2p in der Immunpräzipitation (Bahn 2) und/oder im Blot (Sbh1p-Detektion) verursacht werden. Grün bzw. rot eingerahmt sind die Banden, die die Assoziation der Komponenten des trimeren Sec61p-Komplexes bzw. des trimeren Ssh1p-Komplexes widerspiegeln.

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Thu Sep 14 11:45:05 2000