Friedrich , Beate: ”Cathepsine B, H, L und ihre Inhibitoren im Gewebe und in Zellkulturen der Prostata“

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Kapitel 3. Material und Methoden

3.1. Patientengruppen

Alle Gewebeproben stammten von Patienten der Klinik für Urologie der Charité. Die Nutzung dieser Gewebeproben für Forschungszwecke wurde von der Ethik-kommission der Charité gebilligt.

3.1.1. Prostatakarzinompatienten

Insgesamt wurden jeweils zwei Gewebeproben von 15 Patienten entnommen. Das Durchschnittsalter dieser Gruppe lag bei 63,8 Jahren, im Bereich von 55 bis 70 Jahren. Nach der TNM-Klassifikation [95] hatte 1 Patient Stadium T 1, 9 Patienten T 2, 5 Patienten T 3. Bei allen war der Lymphknotenstatus (N) negativ und auch Fernmetastasen (M) wies keiner der Patienten zum Zeitpunkt der Operation auf. Das histologische Grading (Differenzierung des Gewebes) ergab folgende Verteilung: zwei mal G 1, 8 mal G2 und 5 mal G 3. Es handelte sich in allen Fällen um Adenokarzinome.

3.1.2. Adenomektomiepatienten

Von 9 Patienten, die sich einer Adenomektomie unterzogen, wurden Proben entnommen. Das Durchschnittsalter dieser Gruppe lag bei 71,2 Jahren, im Bereich von 63 bis 81 Jahren.

3.1.3. Patienten mit transurethraler Resektion der Prostata

Die 6 Patienten von denen Material durch transurethrale Resektion der Prostata gewonnen wurde, hatten ein Durchschnittsalter von 69,8 Jahren im Bereich von 64 bis 76 Jahren.


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3.1.4. Patienten mit Zystoprostatektomien

Den Patienten dieser Gruppe wurde die Prostata im Rahmen einer Zystoprostatektomie aufgrund eines Blasenkarzinoms entfernt. Das Durchschnittsalter der 6 Patienten lag bei 60 Jahren, im Bereich von 44 bis 67 Jahren.

3.2. Materialgewinnung und Lagerung

Alle Proben wurden sofort nach Entfernung der Prostata entnommen. Die Schnittränder in der Prostata wurden mit farbiger Tusche markiert, so daß entnommene Proben genau zugeordnet werden konnten. Durch die histopathologische Untersuchung wurde abgesichert, daß das Probenmaterial aus dem malignen bzw. nichttumorösen Anteil der Drüse stammte. Anschließend wurden die Gewebeproben in flüssigem Stickstoff bis zur Präparation eingefroren oder sofort zur Anzucht von primären Zellkulturen genutzt.

3.3. Aufbereitung der Gewebeproben

Insgesamt wurden 41 Gewebeproben analysiert. Gewebe der Prostata-karzinompatienten wurde in Paaren untersucht: 10 Proben des Tumorgewebes (PC) und jeweils Anteile des zugehörigen nichttumorösen Gewebes (PN). Die restlichen 21 Proben stammten von benignen Läsionen der Prostata: 9 Proben von Adenomektomien (Ad), 6 Proben von Zystoprostatektomien (Zy) aufgrund eines Blasenkarzinoms und 6 Proben von transurethralen Resektionen der Prostata (TURP).

Zur Extraktion der Enzyme nutzten wir eine Tritonextraktion. Dafür wurden die Gewebeproben (~30-50 mg) aufgetaut, zerkleinert und in einen Wheaton-Homogenisator gegeben. 150 µl einer 10 mmol/l CaCl2-Lösung, die 0,25 % Triton X-100 enthielt wurden hinzugefügt. Nach sorgfältiger Homogenisierung wurde dieses Gemisch in Eppendorf-Röhrchen (1,5 ml) überführt. Der Homogenisator wurde 2 mal mit 150 µl der CaCl2-Lösung nachgespült und dieser Homogenatrest mit dem bereits gewonnenen


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Homogenat vereinigt. Anschließend wurde bei 4°C und 23.100x g für 15 Minuten in einer Zentrifuge (Fa. Eppendorf, Hamburg) zentrifugiert. Der Niederschlag wurde, wie vorangehend beschrieben, noch einmal mit Tritonlösung extrahiert und zentrifugiert. Beide Überstande wurden vereinigt und dienten zur Eiweiß-, Enzym- und Inhibitorbestimmung.

3.4. Vorbereitung der Zellkulturen

3.4.1. Kulturmedien und Materialien

Die Kulturmedien RPMI-1640 und KSFM (Keratinozyten-Serumfreies-Medium; cat.no. 17005-34; mit 5 µg/l epidermalem Wachstumsfaktor und 50 mg/l Rinder-hypophysenextrakt), sowie Trypsin/EDTA Lösung (0,05 %, 0,02 %) und Dulbeccos phosphatgepufferte Salzlösung (DPBS; cat.no. 14190) bezogen wir von der Firma Gibco Life Technologies (Eggenstein). Dem KSFM Medium wurden zugesetzt: Rinderserumalbumin (Endkonzentration 250 mg/l; Behring AG, Marburg), Transferrin (10 mg/l von Boehringer), Dihydrotestosteron (5 µg/l von Sigma), nicht-essentielle Aminosäurelösung (1 %; Gibco, cat.no. 11140-35) und Penicillin/Streptomycin (125 kU bzw. 125 mg/l von Gibco). Dieses diente als Medium für die primären Prostatazellkulturen (PPCC).

Triton X-100, Kollagenase Typ IA (245 units/mg) und fetales Kälberserum von Sigma; Hyaluronidase (1000 units/mg) von Boehringer; Zellanheftungsmatrix (ECL) bestehend aus Enaktin, Kollagen IV und Laminin von Biozol (Echting) wurden benutzt. Falcon-Primaria Kulturflaschen bezogen wir von Becton/Dickinson (Heidelberg) und Plastikkulturflaschen von Costar (Cambridge, MA, USA).

3.4.2. Primärzellkulturen

Aus 5 Paaren zusammengehöriger Gewebeproben (nichterkranktes und Tumorgewebe) wurden Primärzellkulturen nach der Methodik von Cronauer et al. [96] und Peehl [97] angezüchtet.


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Dafür wurden ~100 mg Gewebe mit einem Skalpell zerkleinert und in 2 ml PPCC-Medium mit 2 mg Kollagenase und 2 mg Hyaluronidase auf einem Rotator bei 37°C für 16 Stunden inkubiert. Diese Lösung wurde durch ein 100 µm Nylonsieb gegeben und nochmals mit 2 ml PPCC-Medium nachgespült. Dieses Filtrat wurde bei 270x g für 5 Minuten zentrifugiert. Der so entstandene Niederschlag wurde erneut in 6 ml PPCC-Medium aufgewirbelt und wieder zentrifugiert. Diesem Pellet wurden 4 ml PPCC-Medium mit 50 µg/ml ECL-Lösung zugegeben und in 25 cm2 Primaria-Kulturflaschen überführt. Die Zellen wurden unter einem angefeuchteten 5 % CO2/95 % Luftgemisch bei 37°C inkubiert. Alle 2-3 Tage wurde das Medium gewechselt und bis zur Konfluenz kultiviert. Daraufhin wurde das Kulturmedium entfernt und die Monolayer zweimal mit 2 ml phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen. Die Zellen wurden mit Hilfe einer Trypsin/EDTA-Lösung (0,05 %; 0,02 %) unter mikros-kopischer Kontrolle innerhalb von 2-5 Minuten abgelöst. Subkultivierungen wurden im Verhältnis 1:3 durchgeführt. Die resultierenden epithelialen Zellen wiesen die dafür typischen Merkmale auf [97].

3.4.3. Permanente Zellkulturen

Die drei von uns untersuchten Zellinien [98] wurden bereits zwischen 1977 und 1980 entwickelt. Die Etablierung dieser immortalisierten malignen Epithel-zellinien der Prostata hat seitdem zum Verständnis der Mechanismen des Prostatakarzinoms beigetragen [99,100]. Die nachfolgend beschriebene Stimu-lierung mit Ammoniumchlorid führten wir in Anlehnung an eine Arbeit von Keppler et al. [52] durch.

Die PC3-Zellinie wurde 1976 aus der Knochenmetastase eines 62-jährigen Kaukasiers, der an einem Prostatakarzinom erkrankt war, gewonnen [101]. DU145 stammt von der Hirnmetastase eines 60-jährigen Prostata-karzinompatienten ab [102] und die LNCaP-Linie wurde aus der Lymphknoten-metastase eines Prostatakarzinoms gezüchtet [103].

Die Zellen stammen von der American Type Culture Collection. Ihre Anzucht erfolgte in RPMI-Medium, das 10 % fetales Kälberserum, Penicillin und Strepto-mycin enthielt. PC3 und DU145 wurden in Kulturflaschen der Firma Costar, LNCaP-Zellen in Primaria-Flaschen der Firma Falcon kultiviert.


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Nach etwa 3 Tagen war die Semikonfluenz erreicht und das Medium wurde entfernt. Nach zweimaligem Waschen mit RPMI-Medium wurden jeweils 5 Kulturen jeder Zellinie mit RPMI-Medium, das 10 mmol/l NH4Cl enthielt, versetzt, während fünf andere RPMI-Medium ohne Zusatz erhielten. Daraus resultierten je 5 Paare von stimulierten und unstimulierten Kulturen. Vom Medienüberstand wurden nach 24 Stunden 10 ml entnommen, 10 min bei 300x g zentrifugiert und dieser Überstand bei -80°C eingefroren. Die verbleibenden Zellen wurden gewaschen, mit Trypsin/EDTA-Lösung von den Kulturflaschen gelöst, erneut mit RPMI gewaschen und die Zellzahl bestimmt. Um die Zellen zu lysieren, wurde 1 ml eines 10 mmol/l Natriumphosphatpuffers mit 0,2 % Triton X-100, pH 4,6 dazugegeben, gemischt und für 15 min bei 10.000x g zentrifugiert. Der Überstand wurde abpipettiert und bis zur Analyse bei -80°C eingefroren.

3.5. Bestimmung der Cathepsine, Cysteinprotease-Inhibitoren und des Proteingehaltes

3.5.1. Testprinzip

Wir benutzten spezifische Substrate für jedes Cathepsin sowie synthetische Hemmstoffe (E-64, Z-Phe-Phe-CHN2), um den Substratumsatz durch andere Enzyme zu eliminieren [104,105]. Eine enzymatische Reaktion nach folgendem Schema wurde gestartet und nach genau 20 min wieder gestoppt.

Die endständige Gruppe bei jedem Substrat (S) ist 4-Methyl-7-coumarylamid. Nach der enzymatischen Reaktion wird als Produkt (P) 7-Amino-4-methyl-coumarin freigesetzt- ein Fluorogen. Die Aktivitätsbestimmung wird über die Quantifizierung dieses Produktes vorgenommen.

Die Fluoreszenz ist eine Form elektromagnetischer Strahlung, die beim Übergang eines Moleküls aus dem angeregten Zustand in den Grundzustand


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emittiert wird. Ein Teil der Energie wird als strahlungsfreie Energie abgegeben, deshalb hat das Licht der Fluoreszenz eine längere Wellenlänge (kleinere Frequenz, kleinere Energie) als die Strahlung, die zur Anregung benutzt wurde (Stokessche Regel). Damit ein Stoff fluoreszieren kann, muß er zuerst Licht absorbieren. Im allgemeinen ist die Wellenlänge des emittierten Lichts größer als die des anregenden Lichtes.

Zur Messung der Proben nutzten wir ein Fluoreszenzspektrophotometer der Firma Shimadzu (Abb. 1), in dem die Probe mit Licht einer bestimmten Wellen-länge angeregt wird und gleichzeitig die dabei auftretende Fluoreszenz für die quantitative Analyse gemessen wird.

Abb. 1. Schematischer Aufbau des Fluoreszenzspektrophotometers RF-1502.
Im Anregungsmonochromator wird aus dem von der Xenonlampe (X) erzeugten Licht die Ausgangswellenlänge von 370 nm herausgefiltert. Im Küvettenhalter (K) wird die zu messende Probe eingebracht. Der rechtwinklig zum Anregungsmonochromator angebrachte Emissionsmonochromator zerlegt das von der Probe emittierte Licht (lambda 460 nm), das dann vom Photomultiplier 2 (2) aufgefangen wird. Die Aufgabe des Monitor-Photomultipliers (1) ist es, Intensitätsschwankungen des Lichts der Xenonlampe zu kompensieren und das Signal/Rauschverhältnis zu verbessern.

3.5.2. Aktivitätsbestimmung der Cathepsine B, H und L

Die Bestimmung der Aktivität der Enzyme erfolgte im wesentlichen nach der Methodik von Barrett und Kirschke [106-108].


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3.5.2.1. Geräte, Reagenzien, Probenmaterialien

Um alle Proben unter konstanten Temperaturbedingungen zu bestimmen, nutzten wir die Thermomixer 5435 und 5436 der Firma Eppendorf (Eppendorf Gerätebau, Hamburg).

Zur Messung der Proben diente ein Spektrofluorophotometer der Firma Shimadzu (Kyoto, Japan), das über einen PC mit Drucker gesteuert wurde.

Verwendet wurden Substrate (Z-Arg-Arg-AMC, Arg-AMC, Z-Phe-Arg-AMC), Standard (AMC), E-64 als spezifischer Hemmstoff der Cysteinproteasen und Cathepsin B (cat.no. C 0150) von Sigma (Sigma Chemicals, St. Louis, MO, USA). Der Hemmstoff für Cathepsin L (Z-Phe-Phe-CHN2) wurde von Bachem (Heidelberg) bezogen.

Alle anderen Chemikalien waren von analytischer Qualität und wurden von Sigma oder Boehringer Mannheim bezogen.

Folgende Lösungen wurden für die Bestimmung vorbereitet:

1. Inkubationspuffer

  1. für Cathepsin B, pH 6,0: 352 mmol/l KH2PO4, 48 mmol/l Na2HPO4, 4 mmol/l EDTANa2. Für den täglichen Gebrauch wurde Cystein zu 8 mmol/l hinzugefügt. Die Anwesenheit einer Sulfhydrylgruppe (Cystein, Dithiothreitol [DTE]) und EDTA ist für die Aktivität der Enzyme notwendig [108].
  2. für Cathepsin H, pH 6,8: 200 mmol/l KH2PO4, 200 mmol/l Na2HPO4, 4 mmol/l EDTANa2 und 40 mmol/l Cystein.
  3. für Cathepsin L, pH 5,5: 340 mmol/l CH3COONa, 60 mmol/l CH3COOH 100%, 4 mmol/l EDTANa2 und 8 mmol/l DTE. Puffer 1 wurde für den täglichen Gebrauch mit 1,23 mg DTE/ml Puffer versehen, zu Puffer 2 gibt man 1,85 mg DTE/ml Puffer.

2. Substratlösungen

Die Substrate Z-Arg-Arg-AMC für Cathepsin B, Arg-AMC für Cathepsin H und Z-Phe-Arg-AMC für Cathepsin L wurden in DMSO zu einer Konzentration von


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1 mmol/l gelöst und bei -20°C gelagert. Zur täglichen Nutzung wurden sie mit destilliertem Wasser auf 20 µmol/l verdünnt.

3. Stoppuffer

Für den Stoppuffer wurden Monochloressigsäure (CH2ClCOOH) zu 100 mmol/l, CH3COONa zu 30 mmol/l und Essigsäure (CH3COOH) zu 70 mmol/l zu einem Puffer gemischt und auf pH-Wert 4,3 eingestellt.

4. Standard

AMC wurde in DMSO zu einer Konzentration von 1 mmol/l gelöst und bei -20°C aufbewahrt. Zum täglichen Gebrauch wurde es auf 0,5 µmol/l verdünnt. Als Verdünnungsflüssigkeit diente ein 1:1 Gemisch aus dem jeweiligen Puffer und Stoppuffer.

5. Hemmstoff E-64

E-64 ist ein spezifischer Hemmstoff der Cathepsine B, H und L. Er wurde den Reaktionsgemischen zugesetzt, um den Umsatz des Substrates durch andere Proteasen zu kontrollieren [104].

Die E-64-Lösung wurde ebenfalls mit DMSO hergestellt und bei einer Konzentration von 1 mmol/l bei -20°C aufbewahrt. Zum täglichen Gebrauch wurde diese Lösung mit Aqua dest. auf 65 µmol/l verdünnt. Die End-konzentration im Inkubationsansatz betrug 5 µmol/l.

6. Hemmstoff Z-Phe-Phe-CHN2

Dieser Inhibitor hemmt speziell Cathepsin L [109]. Zur Aktivitätsbestimmung wurden 2 Testreihen durchgeführt, mit und ohne Hemmstoff. Aus der Differenz ergibt sich die Aktivität des Cathepsin L.

Der Hemmstoff wurde in DMSO zu 1 mmol/l gelöst und bei -20°C aufbewahrt. Zum täglichen Verbrauch wurde diese Lösung mit Inkubationspuffer verdünnt, so daß im Testansatz eine Konzentration von 0,5 µmol/l vorlag.


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7. Proben und Kontrollmaterial

Die Proben wurden je nach Aktivität verdünnt. Die Lösung zum Verdünnen bestand zu unterschiedlichen Anteilen aus dem jeweiligen Puffer, 0,1 % Brij 35-Lösung und Aqua dest.- für Cathepsin B 1:2:7, für Cathepsin H 2:2:6 und für Cathepsin L 1:2:7.

Zur intraseriellen Präzision diente Rattenleberhomogenat, das 1:101, 1:61 und 1:701 für die Bestimmung der Cathepsine B, H und L eingesetzt wurde.

Zur interseriellen Präzision stellten wir ein Kontrollmaterial aus Rattenleberhomogenat her, das in Verdünnungen 1:606 für die Bestimmung von Cathepsin B und L und 1:51 für Cathepsin H eingesetzt wurde. Das verdünnte Homogenat wurde portioniert bei -20°C gelagert.

3.5.2.2. Testdurchführung

Das Volumen im Inkubationsansatz betrug 300 µl. Das Endvolumen nach Stop der Reaktion 600 µl. Die Proben wurden als Doppelbestimmungen durchgeführt. Es wurde ein Leerwert mitgeführt, indem der Stoppuffer vor dem Substrat zugefügt wurde. Ein zusätzlicher Wert ergab sich durch Zugabe von 25 µl E-64-Lösung vor der Substratzugabe.

Pipettierschema für die Bestimmung von Cathepsin B und H

in 1,5 ml Eppendorf Röhrchen werden nacheinander pipettiert:

Konzentration im Inkubationsansatz (Cathepsin B)

in mmol/l

Konzentration im Inkubationsansatz (Cathepsin H)

in mmol/l

Probe/Standard (4,7)

Inkubationspuffer (1)

150 µl

75 µl

KH2PO4 88

Na2HPO4 12

EDTA Na2 1

Cystein 2

5 µmol/l

50

50

1

10

5 µmol/l

etwa 2 min bei 30°C inkubieren lassen

Substrat (2)

75 µl

mischen, genau 20 min bei 30°C inkubieren lassen

Stoppuffer (3)

300 µl

CH2ClCOOH 50

CH3COONa 15

CH3COOH 35

50

15

35

Fluoreszenz bei lambda 370/460 nm messen


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Pipettierschema für Cathepsin L

Bei der Aktivitätsbestimmung des Cathepsin L wurden zwei Testreihen parallel durchgeführt, in An- und Abwesenheit des spezifischen Hemmstoffes Z-Phe-Phe-CHN2. Dazu wurden Puffer mit unterschiedlichem DTE-Gehalt benutzt. Aus der Differenz beider Meßreihen ergab sich der Wert der Cathepsin-L-Aktivität.

in 1,5 ml Eppendorf Röhrchen werden nacheinander pipettiert:

Konzentrationen im Inkubationsansatz

in mmol/l

Probe/Standard (4,7)

Puffer 1 (1)

Puffer 2 (1)

L-Inhibitor (6)

150 µl

75 µl

-

-

150 µl

-

50 µl

25 µl

CH3COONa 85

CH3COOH 15

EDTA Na2 1

DTE 2

0,5 µmol/l

5 µmol/l

etwa 2 min bei 30°C inkubieren lassen

Substrat (2)

75 µl

75 µl

mischen, genau 20 min bei 30°C inkubieren lassen

Stoppuffer (3)

300 µl

300 µl

CH2ClCOOH 50

CH3COONa 15

CH3COOH 35

Fluoreszenz bei lambda 370/460 nm messen

3.5.2.3. Berechnung der Aktivität

Da Standard und Proben gleich behandelt wurden, erfolgt die Berechnung über die direkte Proportion:

Unter Berücksichtigung der Reaktionszeit und des Verdünnungsverhältnisses der Probe ergibt sich daraus folgende Formel:


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3.5.3. Bestimmung der Inhibitoren

Um die alleinige Aktivität der Cysteinprotease-Inhibitoren zu bestimmen, ist es erforderlich, die Proben durch Hitze zu ”aktivieren“. Damit erreicht man, daß die Inhibitoren sich von eventuell gebildeten Komplexen mit den Cathepsinen lösen, die Cathepsine durch die Hitze denaturiert werden und allein die Aktivität der hitzestabilen Cystatine erhalten bleibt [23]. Die inhibitorische Aktivität testeten wir gegen reines Cathepsin B, isoliert aus Plazenta. Hierzu wurde jeweils die Cathepsin-B-Konzentration mit dem synthetischen Inhibitor E-64 titriert und über eine Regressionsanalyse errechnet. Aus dieser Kurve wurde die Hemmung der Proben errechnet.

Vorbereitung der Proben:

Die Inaktivierung der Cysteinproteasen erfolgte durch Kochen. Dazu wurden 100 µl Probe in 0,5 ml Eppendorf-Safelock-Röhrchen gegeben und 10 min im Wasserbad bei 100°C belassen. Nach Abkühlung wurden die Proben für 10 min bei 19.000x g zentrifugiert. Der so erhaltene Überstand diente zur CPI-Bestimmung.

Die E-64-Stammlösung (1 mmol/l) wurde mit 0,1 % Brij-35-Lösung auf Konzen-trationen von 1; 2,5; 5; 7,5; 10; 20 und 40 nmol/l verdünnt. Um die Aktivität des völlig ungehemmten Cathepsin B zu ermitteln, wurde diesem Ansatz statt ver-dünnter E-64-Lösung, Brij-Verdünnungslösung zugefügt.

Das Cathepsin B (Sigma) wurde in 0,1 % Brij aufgelöst, portioniert und bei -80°C eingefroren.

Außerdem benötigt man Inkubationspuffer für Cathepsin B.


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Pipettierschema zur Vorbereitung der CPI-Proben

in 1,5 ml Eppendorf Röhrchen werden nacheinander pipettiert:

Inkubationspuffer

20 µl

20 µl

inaktivierte Probe

50 µl

-

verdünnte E-64-Lösung

-

10 µl

Cathepsin-B-Lösung

4 µl

4 µl

vorsichtig mischen und für 30 min bei Raumtemperatur inkubieren lassen

0,1 % Brij-Lösung

396 µl

436 µl

mischen,

Aktivität des Cathepsin B in dieser Probe bestimmen, Testdurchführung s.o.,

Reaktionszeit auf 60 min verlängert

3.5.4. Bestimmung des Proteingehaltes

Der Eiweißgehalt in den homogenisierten und extrahierten Gewebeproben und Zellen wurde nach der Methode von Bradford mittels des Farbstoffes Coomassie Brilliant Blue bestimmt [110].

Die Herstellung der Lösung erfolgte, indem 7 mg des Farbstoffes Coomassie Brilliant Blue G 250 in 5 ml reinem Ethanol gelöst wurden und über Nacht bei 4°C belassen wurden. Dazu gibt man 10 ml Phosphorsäure (85 %) und füllt auf 100 ml mit Aqua dest. auf. Nach Filtration lagerten wir diese Lösung bis zum Gebrauch bei 4°C.

Als Standard diente Rinder-Serumalbumin in einer Konzentration von 1 mg Eiweiß pro ml.

Zur Bestimmung wurden die Proben 1:5 verdünnt und 10 µl davon in K-Küvetten (Eppendorf) mit 500 µl Coomassie-Lösung gemischt. Nach 5 min Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Proben erneut gemischt und bei einer Wellenlänge von 578 nm im Spektrophotometer ECOM 6122 (Eppendorf) gemessen. Alle Werte wurden als Doppelbestimmungen durchgeführt.


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3.5.5. Statistische Auswertung

Die Meßergebnisse wurden mittels des Statistikprogrammes Statgraphics 5.01 (Statistical Graphics Corp., Rockville, MD, USA) ausgewertet. Genutzt wurden der t-Test nach Student und der U-Test nach Mann-Whitney für unabhängige Stichproben, sowie der t-Test für gepaarte Daten und der Wilcoxon-Test für abhängige Stichproben. Die Korrelationskoeffizienten nach Pearson und Spearman wurden mit der Software von GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) ermittelt.

Unterschiede von p< 0,050 wurden als statistisch signifikant gewertet.


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