Friedrich , Beate: ”Cathepsine B, H, L und ihre Inhibitoren im Gewebe und in Zellkulturen der Prostata“

29

Kapitel 4. Ergebnisse

4.1. Zuverlässigkeit der Enzymaktivitätsbestimmungen

4.1.1. Intraserielle Präzision

Die intraserielle Präzision wurde mittels einer Zehnfachbestimmung des in Material und Methoden angegebenen Kontrollmaterials bestimmt. Der Variationskoeffizient ergab sich aus Mittelwert und Standardabweichung. Die Werte sind verzeichnet in Tabelle 3.

Tabelle 3 Intraserielle Präzision der Cathepsinbestimmungen.

Parameter

Mittelwert (x)

(mU/l)

Standard-abweichung (s)

(mU/l)

VK= s/x * 100

(%)

Cathepsin B

11,71

0,13

1,10

Cathepsin H

7,21

0,21

2,94

Cathepsin L

1,69

0,17

9,88

4.1.2. Interserielle Präzision

Es erfolgte eine interserielle Qualitätskontrolle. Dazu wurde in jeder Serie die Cathepsinkonzentration eines selbsthergestellten Kontrollmaterials bestimmt, dessen Herstellung im Kapitel Material und Methodik beschrieben wurde. Aus Mittelwert und Standardabweichung ergab sich der jeweilige Variations-koeffizient. Eine Zusammenfassung der Werte zeigt Tabelle 4.

Tabelle 4 Interserielle Präzision der Cathepsinbestimmungen

Parameter

(Anzahl)

Mittelwert (x)

(mU/l)

Standard-abweichung (s)

(mU/l)

VK= s/x * 100

(%)

Cathepsin B (12)

4,29

0,29

6,71

Cathepsin H (7)

17,06

2,64

15,47

Cathepsin L (13)

12,74

1,53

12,01


30

4.2. Überprüfung der Enzymextraktionen

In der Literatur sind verschiedene Homogenisationsverfahren unter Verwen-dung unterschiedlicher Extraktionspuffer beschrieben, mit denen die Gewebscathepsine für die Enzymaktivitätsbestimmung gewonnen wurden. Wir entschieden uns, ausgehend von Vorversuchen, für eine Homogenisierung im Wheaton-Homogenisator mit einer 10 mmol/l CaCl2-Lösung, die 0,25 % Triton X-100 enthielt. Hierzu wurden 30-50 mg Gewebe mit jeweils 150 µl Lösung homogenisiert und im Überstand die Aktivität gemessen. Die Extraktion wurde dreimal wiederholt. Die Summe der in den drei Extraktionsschritten ge-wonnenen Aktivitäten wurde 100 % gesetzt. Die zweifache Gewebeextraktion mit Triton führte zu nahezu vollständiger Extraktion der Enzyme. Proben, die mit der zweifachen Tritonextraktion behandelt wurden, hatten die in Tabelle 5 aufgeführten Anteile an der Gesamtaktivität von 100 %.

Tabelle 5 Anteil der Aktivität der zweifachen Tritonextraktion in Proben, die drei-fach extrahiert wurden.

Parameter

Mittelwert (x)

(%)

Standard- abweichung (s)

(%)

VK = s/x * 100

(%)

Cathepsin B

99,76

0,2

0,15

Cathepsin H

99,66

0,4

0,42

Cathepsin L

97,30

3,4

3,55


31

4.3. Korrelation der Bezugsgrößen

Die errechneten Cathepsinaktivitäten wurden auf den Eiweißgehalt der Probe bezogen. Bei den Gewebeproben erfolgte der Bezug zusätzlich noch auf das Feuchtgewicht und bei den Zellkulturen auf die jeweilige Zellzahl (106). Abbildung 2 (Seite 32) zeigt den Zusammenhang zwischen Cathepsinwerten bezogen auf Gramm Protein, zu Cathepsinwerten bezogen auf Gramm Feuchtgewicht (Gewebeproben). Die Korrelation bei den Primärzellkulturen ist in Abbildung 3 (Seite 33) dargestellt, bei den permanenten Zellkulturen in Abbildung 4 (Seite 34).

Die Koeffizienten der linearen Korrelation zwischen den Bezugsgrößen sind zusammengefaßt in Tabelle 6.

Tabelle 6 Korrelation zwischen den Bezugsgrößen, lineare Korrelations-koeffizienten.

Gewebeproben

Korrelation

Eiweiß/ Feuchtgewicht

Primärzellkulturen

Korrelation

Eiweiß/

Zellzahl

Permanente Zellkulturen

Korrelation

Eiweiß/

Zellzahl

Cathepsin B

0,949

0,868

0,955

Cathepsin H

0,677

0,666

0,978

Cathepsin L

0,974

0,927

0,969

CPI

0,621

0,679

0,861


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Abb. 2. Korrelation der Bezugsgrößen in den Gewebeproben von Prostatektomien, Adenomektomien, Zystoprostatektomien und trans-urethralen Resektionen der Prostata.
Dargestellt ist das Verhältnis von Cathepsinen B, H, L (Abb. a-c) und CPI (Abb. d) pro Gramm Protein zu Cathepsinen bzw. CPI pro Gramm Feuchtgewicht. Die Koeffizienten der linearen Korrelation sind in Tabelle 6 (Seite 31) aufgeführt.


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Abb. 3. Korrelation der Bezugsgrößen in den Primärzellkulturen der Prostata.
Dargestellt ist das Verhältnis von Cathepsinen B, H, L (Abb. a-c) und CPI (Abb. d) pro Gramm Protein zu Cathepsinen bzw. CPI pro eine Million Zellen. Die Koeffizienten der linearen Korrelation sind in Tabelle 6 (Seite 31) aufgeführt.


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Abb. 4. Korrelation der Bezugsgrößen in den immortalisierten Zellinien LNCaP, DU145 und PC3.
Dargestellt ist das Verhältnis von Cathepsinen B, H, L (Abb. a-c) und CPI (Abb. d) pro Gramm Protein zu Cathepsinen bzw. CPI pro eine Million Zellen. Die Koeffizienten der linearen Korrelation sind in Tabelle 6 (Seite 31) aufgeführt.


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Außerdem zeigte sich, daß sich die einzelnen Gruppen der Gewebeproben im Proteingehalt untereinander bezogen auf das Feuchtgewicht nicht signifikant unterscheiden. Die Mittelwerte und Standardabweichungen der Proteingehalte der Gewebeproben sind dargestellt in Abbildung 5.

Abb. 5. Prostata-Gewebeproben von nichterkranktem (PN) und Karzinom-gewebe (PC), Adenomektomien (Ad), transurethralen Resektionen der Prostata (TURP) und von Zystoprostatektomien (Zy). Die Säulen zeigen Mittelwert ± Standardabweichung des Proteingehaltes in µg/mg Gewebe. Die statistische Analyse mit dem t-Test zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen.

Aufgrund der Unabhängigkeit der Menge des extrahierten Proteins von der Art der Gewebegewinnung und der engen Korrelation zwischen Eiweißgehalt und den anderen Bezugsgrößen, ist es gerechtfertigt, die Ergebnisse jeweils be-zogen auf den Proteingehalt darzustellen.

Die im folgenden präsentierten Ergebnisse zeigen die Aktivität der Cathepsine bezogen auf den Eiweißgehalt der Proben.

4.4. Cathepsine B, H, L und Cysteinprotease-Inhibitoren in Prostatagewebeproben

Eine grafische Darstellung der Parameter aller Gewebeproben beinhaltet Abbildung 6 (Seite 36-37).

Allgemein trifft zu, daß Cathepsin B die höchsten Aktivitätswerte zeigte, gefolgt von Cathepsin L und Cathepsin H.


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Abb. 6a-b. Cathepsine B und H in Gewebeproben der Prostata. Aus-führliche Legende auf der nächsten Seite.


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Abb. 6. Cathepsine B, H, L (6 a-c) und Cysteinprotease-Inhibitoren (6 d) in Prostata-Gewebeproben. PN und PC bezeichnen jeweils 10 zusam-mengehörende Paare, die bei Prostatektomien von nichterkranktem (PN) und malignem (PC) Gewebe gewonnen wurden. Die mit Ad be-zeichneten Proben stammen von Adenomektomien (n=9), TURP von transurethralen Resektionen der Prostata, Zy von Zystoprostatektomien. Von beiden Gruppen wurden je 6 Proben untersucht.
Die Säulen repräsentieren Mittelwerte ± Standardfehler. Im t-Test signifikante Unterschiede sind mit den Buchstaben a-e gekennzeichnet. Dabei bedeutet (a) signifikant unterschiedlich zu PN, (b) zu PC, (c) zu Adenomektomien, (d) zu transurethralen Resektionen und (e) zu den Zystoprostatektomien.


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4.4.1. Vergleich von normalem und Tumorgewebe

Die Cathepsine B und L zeigten signifikante Unterschiede zwischen nicht-erkranktem (PN) und maligne verändertem Gewebe (PC).

Im normalen Gewebe fand sich eine zweifach höhere Aktivität im Vergleich zum malignen Gewebe: Cathepsin B: 830,4/407,7; Cathepsin L: 160,9/79,4 mU/g Eiweiß .

Auch in der Konzentration der Cysteinprotease-Inhibitoren (CPI) unterschieden sich normale und maligne Proben signifikant. Der Unterschied war jedoch nicht so deutlich wie im Cathepsingehalt: PN 1,37; PC 1,01 nmol/g Eiweiß.

Beim Cathepsin-H-Gehalt zeigte sich kein Unterschied im Vergleich beider Gruppen.

Wir errechneten die Quotienten zwischen dem jeweiligen Cathepsin und den Cysteinprotease-Inhibitoren. Diese Werte sind in Tabelle 7 aufgeführt.

Tabelle 7 Verhältnis von Cathepsinen zu Cysteinprotease-Inhibitoren. Die ange-gebenen Quotienten entsprechen den arithmetischen Mittelwerten ± Standard-abweichung von jeweils 10 Gewebeproben.

Quotient

Nichterkranktes

Gewebe (PN)

Tumorgewebe der Prostata (PC)

CB/CPI (mU/nIU)

567,8

± 351,9

417,9

± 391,6

CH/CPI (mU/nIU)

26,8

± 10,8

42,6

± 18,4

CL/CPI (mU/nIU)

109,7

± 68,5

81,5

± 53,0

Ein signifikanter Unterschied zwischen den normalen und Tumorproben besteht nur beim Quotient Cathepsin H/CPI, der im t-Test 0,050 erreichte.

Der Quotient zwischen allen Cathepsinen und CPI beträgt für PN 234,8 ± 143,7 und für PC 180,7 ± 154,3. Im Paarvergleich ergab sich kein signifikanter Unter-schied.

Außerdem wurden die Aktivitäten der einzelnen Cathepsine mit anderen Tumor-merkmalen korreliert. Der Spearman-Rangkorrelationskoeffizient zeigte eine signifikante Abhängigkeit zwischen dem Gehalt an Cathepsin H und dem TNM-Staging (0,7490). Der Cathepsin-L-Gehalt korrelierte negativ mit dem histo-logischen Grading (Pearson r= -0,6713; Spearman r= -0,6742).


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4.4.2. Adenomektomien, Zystoprostatektomien, transurethrale Resektionen

Von diesen 3 Gruppen zeigten die Adenomektomieproben die höchste Cathepsin-B-Aktivität (788,3 mU/g Protein), vergleichbar mit PN (830,4), gefolgt von TURP (423,4) und Zystektomien (323,7). Signifikant unterscheiden sich die Adenomektomie- von den Zystoprostatektomieproben.

Im Cathepsin-H-Gehalt liegen die Zystoprostatektomieproben am höchsten mit 54,0 mU/g Eiweiß, danach folgen die Adenomektomien mit 41,4 mU/g Eiweiß und die transurethralen Resektionen mit 38,6 mU/g Eiweiß. Weder untereinander, noch zu PN und PC gibt es Unterschiede.

Die Verteilung der drei Gruppen im Cathepsin-L-Gehalt zeigt deutlichere Unterschiede. Die Adenomektomieproben liegen mit einem Mittelwert von 296,2 vor den Zystektomien mit 68,1 und den TURP mit 23,6 mU/g Protein. Daraus ergibt sich eine signifikante Differenz des Cathepsin-L-Gehaltes bei Adenomektomieproben im Vergleich zu Proben von TURP und Zystektomien.

Bei der CPI-Konzentration liegen die drei Gruppen der benignen Prostata-proben mit Mittelwerten von 1,83 nmol/g Eiweiß (Ad), 1,79 nmol/g Eiweiß (TURP), 1,84 nmol/g Eiweiß (Zy), eng beisammen. So unterscheiden sie sich untereinander nicht, sondern alle nur zu PC (1,01 nmol/g Eiweiß) und die Adenomektomien zusätzlich noch zu PN (1,37 nmol/g Eiweiß).

4.5. Cathepsine B, H, L und Cysteinprotease-Inhibitoren in Zellkulturen

Die grafische Darstellung aller untersuchten Zellkulturen findet sich in Abbildung 7 (Seite 40-41).

Sowohl primäre als auch permanente Zellkulturen (LNCaP, DU145, PC3) weisen die höchsten Aktivitäten beim Cathepsin L auf, gefolgt von Cathepsin B und Cathepsin H, das wie bei den Gewebeproben den geringsten Gehalt zeigt.


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Abb. 7a-b. Cathepsine B und H in Zellkulturen der Prostata. Ausführ-liche Legende auf der nächsten Seite.


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Abb. 7. Cathepsine B, H, L (7 a-c) und Cysteinprotease-Inhibitoren (7 d) in Zellkulturen der Prostata. PCN und PCC bezeichnen 5 jeweils zusammengehörende Paare von Primärzellkulturen, die aus nichterkranktem (PCN) und malignem (PCC) Gewebe angezüchtet wurden. Von den drei immortalisierten Zellinien LNCaP, DU145 und PC3 wurden jeweils 5 Proben untersucht.
Die Säulen repräsentieren Mittelwerte ± Standardfehler. Im t-Test signifikante Unterschiede sind mit den Buchstaben a-e gekennzeichnet. Dabei bedeutet (a) signifikant unterschiedlich zu PCN, (b) zu PCC, (c) zu LNCaP, (d) zu DU145 und (e) zu den PC3.


42

4.5.1. Vergleich der Primärzellkulturen

Die aus normalem Prostatagewebe und aus Karzinomgewebe gezüchteten Primärzellkulturen (PCN und PCC) unterscheiden sich in der Aktivität aller drei Cathepsine.

Im Gegensatz zu den Gewebeproben sind hier jedoch in den Tumorzellkulturen die signifikant höheren Aktivitäten vorhanden.

Diese liegen für Cathepsin B und Cathepsin L um ca. das Doppelte höher als in den Zellkulturen von der normalen Prostata, beim Cathepsin H ist der Unterschied geringer, aber trotzdem signifikant. In der CPI-Konzentration gibt es keine statistisch signifikante Differenz zwischen den Kulturen des normalen und malignen Gewebes.

Auch hier ermittelten wir den Quotienten aus den einzelnen Cathepsinen zu den CPI. Die daraus resultierenden Werte sind in Tabelle 8 zusammengefaßt.

Tabelle 8 Verhältnis von Cathepsinen zu Cysteinprotease-Inhibitoren. Die angegebenen Quotienten entsprechen den arithmetischen Mittelwerten ± Standardabweichung von jeweils 5 Gewebeproben.

Quotient

Primärzellkulturen von nichterkranktem Prostatagewebe (PCN)

Primärzellkulturen vom Tumorgewebe der Prostata (PCC)

CB/CPI (mU/nIU)

3,93

± 1,93

9,15

± 4,41

CH/CPI (mU/nIU)

3,76

± 3,03

4,29

± 3,02

CL/CPI (mU/nIU)

8,53

± 9,07

14,76

± 10,51

Auch hier ergab der t-Test keine Signifikanzen für die einzelnen Quotienten.

Der Quotient aus allen Cathepsinen und CPI betrug für die Primärzellkulturen des normalen Gewebes (PCN) 5,41 ± 4,68 gegenüber 9,40 ± 5,98 des Tumor-gewebes (PCC). Diese für die malignen Zellen erhöhte Relation war mit 0,047 im t-Test signifikant.

Die Korrelation der Cathepsin-Aktivitäten mit anderen klinischen Tumormerk-malen (TNM, Grading) mittels des Spearman Rangkorrelationskoeffizienten ergab keine signifikanten Werte.


43

4.5.2. Permanente Zellkulturen

Für alle drei Zellinien zeigt sich ein ähnliches Verteilungsmuster der Cathepsine B, H und L. DU145-Zellen haben die höchsten Aktivitäten, gefolgt von LNCaP- und PC3-Zellen. Untereinander zeigen sich daher in jedem Fall zu einer, meistens aber zu beiden anderen Zellinien signifikante Unterschiede. Generell liegen die Aktivitäten im Vergleich zu den primären Zellkulturen um ein Vielfaches höher. Daraus ergibt sich, daß DU145 zu den normalen und malignen Primärzellkulturen (PCN und PCC) bei allen drei Cathepsinen; LNCaP bei Cathepsin B und Cathepsin L und PC3 bei Cathepsin H signifikant ver-schieden sind.

Die Konzentration der Cysteinprotease-Inhibitoren beträgt bei den permanenten Zellinien nur etwa ein Viertel von der in den Primärzellkulturen. Untereinander gibt es keine Differenzen, nur zu den Primärzellkulturen des normalen Gewebes (PCN).


44

4.5.2.1. Ammoniumchlorid-stimulierte Zellkulturen

Die grafische Darstellung der Ammoniumchlorid-stimulierten Zellkulturen findet sich in Abbildung 8 auf den folgenden beiden Seiten.

In den Zellysaten der unstimulierten Zellen finden sich höhere Aktivitäten der Cathepsine B, H und L als nach der Stimulierung. Eine Ausnahme bilden die PC3-Zellen, die beim Cathepsin H in den stimulierten Proben einen höheren Gehalt aufweisen.

Die Überstände verhalten sich gegensinnig, d.h. nach Stimulation durch NH4Cl-Zusatz zeigen sie eine höhere Aktivität der Cathepsine B, H und L. Dies gilt für alle Proben bis auf LNCaP im Cathepsin-B-Gehalt.

Bei den Cysteinprotease-Inhibitoren verhalten sich Zellysate und Überstände gleichsinnig. Bei allen drei Zellinien sind sowohl im Zellysat, als auch im Überstand der stimulierten Zellen die höheren Werte der CPI-Konzentration zu finden.

In Tabelle 9 ist die Verteilung von Cathepsinen und CPI zwischen Zellysat und Überstand prozentual ausgedrückt.

Tabelle 9 Prozentuale Anteile der einzelnen Cathepsine im Überstand und Zellysat der drei permanenten Zellinien DU145, LNCaP und PC3 ohne und mit Ammoniumchlorid-Stimulierung. Die Summe der Aktivitäten (Mittelwerte) in Zellysat und Überstand wurde 100 % gesetzt und dann der jeweilige prozen-tuale Anteil errechnet. SD bezeichnet die Standardabweichung.

ohne NH4Cl

mit NH4Cl

Zellysat

Überstand

Zellysat

Überstand

% SD % SD % SD %

SD

DU145

Cathepsin B 73 19 27 26 41 17 59

72

Cathepsin H 77 45 23 24 64 51 36

32

Cathepsin L 94 7 6 5 88 26 12

12

CPI 0,5 0,2 99,5 64 0,5 0,3 99,5

103

LNCaP

Cathepsin B 96 35 4 6 80 51 20

12

Cathepsin H 48 33 52 61 14 7 86

55

Cathepsin L 92 37 8 3 52 40 48

26

CPI 0,4 0,2 99,6 67 0,6 0,1 99,4

47

PC3

Cathepsin B 88 28 12 6 33 6 67

84

Cathepsin H 48 27 52 20 29 8 71

78

Cathepsin L 66 49 34 25 6 4 94

175

CPI 0,3 0,1 99,7 86 0,5 0,1 99,5

84


45

Abb. 8a-b. Cathepsine B und H in den drei immortalisierten Zellinien DU145 (DU), LNCaP (LN) und PC3 (PC) vor (-) und nach (+) Stimu-lierung mit Ammoniumchlorid.
Ausführliche Legende auf der nächsten Seite.


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Abb. 8. Darstellung der drei immortalisierten Zellinien DU145 (abgekürzt DU), LNCaP (LN) und PC3 (PC) vor (-) und nach (+) Stimulierung mit Ammoniumchlorid. Es wurden jeweils Zellysate (schraffiert) und Überstände (leer) untersucht.
Die Säulen repräsentieren Mittelwerte ± Standardabweichung von je 5 gemessenen Werten. Im t-Test signifikante Unterschiede zwischen stimulierten und unstimulierten Zellysaten (bzw. Überständen) einer Zellinie sind mit (*) gekennzeichnet.
Die Abbildungen 8 a-c zeigen die Aktivitäten der Cathepsine B, H und L. In Abbildung 8 d ist die Konzentration der Cysteinprotease-Inhibitoren dargestellt.

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