Friedrich , Beate: ”Cathepsine B, H, L und ihre Inhibitoren im Gewebe und in Zellkulturen der Prostata“

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Kapitel 5. Diskussion

Die Cysteinproteasen Cathepsin B, H und L sind an verschiedenen Krankheits-bildern und an neoplastischen Vorgängen beteiligt.

In der Gruppe der entzündlichen Gelenkerkrankungen sind sie an der Zer-störung des Gelenkknorpels beteiligt. Der Gehalt im Serum, in Synovial-flüssigkeit und synovialen Gewebeproben ist erhöht und kann als Marker für die Aktivität der Krankheit genutzt werden [69]. Bei einer Form der Muskel-dystrophie scheint die Aktivierung eines intramyofibrillären lysosomalen Systems für die erhöhte Cysteinprotease-Aktivität verantwortlich zu sein. Damit verbunden ist die gesteigerte proteolytische Zerstörung der Muskelfasern [111]. Andere nicht-maligne Erkrankungen mit nachgewiesener Beteiligung der Cathepsine sind z.B. die Alzheimersche Krankheit [64], Multiple Sklerose [71], Nierenerkrankungen, wie die polyzystische Niere [67], Glomerulonephritis, Otitis media, Sinusitis, Pankreatitis und Parodontose [69].

Der erhöhte Cathepsingehalt maligner Gewebe (s. a. Tabelle 1) ist in den ver-schiedensten Tumoren nachgewiesen worden [60]. Unterstützt und erweitert durch Studien an Tiermodellen [112] und Zellkulturen [113,114] zeigte sich auch ein Zusammenhang mit anderen Tumormerkmalen, wie Differenzierungsgrad des Gewebes [19,20], dem Stadium der Erkrankung [18], der Überlebensrate [19,26,27,33] und dem metastatischen Potential [47,114-116]

Sloane et al. [117] wiesen nach, daß die Erhöhung im Cathepsin-B-Gehalt primär in Form einer plasmamembran-assoziierten Fraktion auftritt, d.h. es kommt zu einer Umverteilung des Enzyms auf subzellulärer Ebene während des malignen Geschehens. Die höchste Aktivität fand sich in den kleinsten, am schnellsten wachsenden Tumoren, was als Zeichen der Invasivität dieser Tumoren gewertet wird. Außerdem konnte eine verminderte Konzentration der hitzestabilen CPI nachgewiesen werden, die somit nicht mehr in der Lage sind, die Aktivität des Cathepsin B ausreichend zu hemmen.

In dieser Arbeit sind die Hauptmechanismen, die den Cathepsinen bei der Tumorausbreitung zugeschrieben werden, zusammengefaßt. Einerseits die Umverteilung vom lysosomalen Kompartiment zur Plasmamembran und andererseits die verschobene Balance zwischen Enzym und Inhibitor.


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5.1. Methodik

Die meisten der uns bekannten Studien über den Cathepsingehalt der Prostata wurden mit immunhistochemischen Methoden durchgeführt. Der Nachteil dieser Methode liegt darin, daß Antikörper nicht in der Lage sind, verschiedene Konformationen der Enzyme nachzuweisen. Die Kreuzreaktion mit anderen nahe verwandten Enzymen der selben Proteinfamilie stellt ebenfalls eine Fehlerquelle dar. Eine dritte Möglichkeit der Beeinflussung besteht durch die Anwesenheit gemeinsamer Epitope auf anderen, nichtverwandten Proteinen [118]. Zudem bleibt unklar, ob die angefärbten Proteine auch funktionell intakt sind. Das läßt sich nur über eine Bestimmung der Enzymaktivität aussagen.

Die von uns angewandte Methodik der Cathepsin-Aktivitätsbestimmung wurde bereits 1980 von Barrett entwickelt [106,107]. Wir haben sie übernommen und unseren technischen Bedingungen angepaßt. Die intra- und interseriellen Kontrollen zeigten mit Werten von 1,10 bis 9,88 bzw. 6,71 bis 12,01 % zufriedenstellende Werte. Vergleichbare Werte waren bis auf die intraserielle Präzision für die Cathepsin-H-Bestimmung von 2-4 % nicht zu finden [108]. Diese Angabe stimmt aber mit unseren Ergebnissen überein.

Die Messung der katalytischen Aktivität kann aufgrund einer weiten und überlappenden Substratspezifität zum Problem werden. Außerdem gibt es wahrscheinlich in jedem Gewebe unbekannte Proteasen, deren katalytische Eigenschaften störenden Einfluß ausüben können. Die von uns eingesetzten Substrate sind zwar für das jeweilige Cathepsin spezifisch, werden aber zum Teil auch von anderen umgesetzt. Z-Arg-Arg-AMC zur Bestimmung von Cathepsin B wird auch von Kallikrein umgesetzt [85]. Das Cathepsin-H-Substrat Arg-AMC wird von Cathepsin B und L nicht angegriffen, kann aber anderen Arylamidasen als Substrat dienen. Z-Phe-Arg-AMC wird nicht nur vom Cathepsin L, sondern auch von Cathepsin B und den Kallikreinen umgesetzt [106].

Um diese, wenn auch geringen, Interferenzen auszuschalten, nutzten wir zwei verschiedene Inhibitorstoffe. E-64 (L-trans-Epoxysuccinyl-leucylamido[4-guanidino]butane) ist ein synthetischer Hemmstoff, gewonnen aus Kulturen des Aspergillus japonicus, der die drei von und untersuchten Cysteinproteasen hemmt [104]. Die Inhibition der Cathepsine B und L wird als exzellent, die des


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Cathepsin H als ausreichend beschrieben. Zur Bestimmung des Cathepsin L setzten wir den dafür spezifischen Hemmstoff Z-Phe-Phe-CHN2 ein [109].

Die Messung der Aktivität kann auch durch die Anwesenheit von Inhibitoren oder inaktiven Enzymvorstufen behindert sein [118].

ELISA-Tests, die in den vergangenen Jahren zur Analyse des Cathepsin-gehaltes entwickelt wurden, haben den Vorteil, auch geringe Mengen des Enzymes nachzuweisen. Doch auch diese Methode bietet nicht die Möglichkeit zwischen proteolytisch aktiven und nicht funktionsfähigen Enzymen zu unter-scheiden. Gabrijelcic et al. [20] fanden, daß der Cathepsin-H-Gehalt im Serum 50-100fach höher lag als Cathepsin B und L. Das deutet darauf hin, daß der verwendete polyklonale ELISA-Test den Cathepsin-H-Gehalt überschätzte.

Eine weitere Möglichkeit der Bestimmung der Enzymexpression besteht in der Messung des mRNA-Gehaltes [118]. Mit dieser Methode kann man Unter-schiede in den Transkriptionsaktivitäten der verschiedenen Proteinase-Gene nachweisen. Die Transkription stellt den ersten Schritt der Proteinbiosynthese dar. Im weiteren Verlauf kann es jedoch auch hier zu Veränderungen kommen, die zu strukturell intakten, aber nicht funktionsfähigen Enzymen führen. Diese posttranslationellen Veränderungen werden durch die mRNA-Bestimmung nicht erfaßt. Somit ist auch der mRNA-Gehalt kein Indikator für die proteolytische Aktivität der Enzyme.

Chambon et al. [94] analysierten den Cathepsin-D-Gehalt der Prostata mit Hilfe zytosolischer und immunhistochemischer Methoden. In der quantitativen Analyse des Zytosols enthielten die Proben aus dem Karzinomgewebe die höchste Aktivität, gefolgt von Adenomen und normalem Gewebe. Die Verteilung der Proben nach immunhistochemischer Analyse hingegen zeigte die stärkste Färbung bei den Adenomproben und einen niedrigeren, fast gleichen Gehalt bei den normalen und Karzinomproben. Die Autoren konnten sich diese Diskrepanz der beiden Methoden nicht erklären.

Von den beschriebenen Verfahren zeigt die von uns genutzte quantitative Aktivitätsbestimmung deutliche Vorteile gegenüber der Immunhistochemie, da sie genauere, nicht nur semiquantitative Daten liefert und gegenüber dem ELISA-Test und der mRNA-Bestimmung vor allem die aktiven Komponenten erfaßt.


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5.2. Cathepsine B, H, L und Cysteinprotease-Inhibitoren in Gewebeproben der Prostata

Zur Beurteilung des individuellen malignen Potentials eines Prostatakarzinoms wurden bestimmte Methoden entwickelt, die Tumorcharakteristika wie DNA-Ploidie oder die Proliferationsrate mittels zytophotometrischer und immun-histochemischer Verfahren erfaßt [93]. Doch auch unter Berücksichtigung dieser Faktoren konnte man keine, die klassischen histopathologischen Merkmale erweiternde Aussage hinsichtlich des Aggressivitätspotentials treffen [93].

Untersuchungen zur Invasion und Metastasierung verschiedener Tumore deuteten auf die Beteiligung proteolytisch wirkender Enzyme an diesen Vorgängen hin [82].

Die drei von uns untersuchten Cathepsine wurden im Zusammenhang mit ihren endogenen Inhibitoren bis jetzt nur in zwei Studien untersucht, die im folgenden näher beschrieben werden.

Kos et al. [14] untersuchten in ihrer 1995 veröffentlichten Studie die Cathepsine D, B, H, L und die Inhibitoren Stefin A und B im Gewebe von Tumoren des Kopf-Halsbereiches. Gewebeproben von 53 Patienten wurden jeweils paar-weise (normales und tumoröses Gewebe) mittels ELISA-Tests analysiert. Die Aktivitäten der Cathepsine D, B, L waren im Tumorgewebe signifikant höher, die des Cathepsin H dagegen im normalen Gewebe. Stefin A und B zeigten keine Unterschiede. Eine Korrelation mit anderen Merkmalen wie dem Alter der Patienten, Größe des Tumors, Lymphknotenbeteiligung und histologischem Grading wurde nicht gefunden.

In der zweiten Studie aus dem Jahr 1996 wurden ebenfalls Patienten mit Malignomen im Kopf-Halsbereich untersucht [13]. Cathepsin B, D und die Stefine A und B wurden bei 45 Patienten, Cathepsin L bei 24 und Cathepsin H bei 21 Patienten gemessen. Die Ergebnisse entsprechen ebenfalls der erst-genannten Studie- Cathepsine B, L, D im Tumorgewebe erhöht, Cathepsin H erniedrigt und kein Unterschied bei den Stefinen. Kleine Tumore wiesen geringere Konzentrationen der beiden Stefine auf als bereits infiltrierend wachsende. Die Überlebensrate war bei Patienten mit niedrigen Cathepsin-L-Aktivitäten besser als bei hohen Aktivitäten. Diese Relation war für die Stefine


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genau umgekehrt, d.h. je höher die Konzentration der Inhibitoren, desto besser die Überlebensrate.

Eine Studie über die Cathepsine B, H, L und ihre endogenen hitzestabilen Inhibitoren im Prostatagewebe wurde bisher nicht veröffentlicht.

In den von uns untersuchten Gewebeproben zeigten die Cathepsine B und L im normalen Gewebe die höhere Aktivität bzw. Konzentration. Im Cathepsin-H-Gehalt stellte sich kein signifikanter Unterschied dar. Dies steht in Widerspruch zu den meisten Studien, die im Tumorgewebe höhere Enzymaktivitäten fanden (s. Tabelle 1).

Eine mögliche Erklärung dafür ist die Heterogenität des Prostatagewebes.

Der charakteristische Aufbau besteht aus Drüsenepithel, umgeben von Bindegewebe mit zahlreichen kollagenen und elastischen Fasern sowie glatten Muskelzellen und Nervenfasern [97]. Die drei histologischen Haupt-komponenten sind Epithel, Stroma und Drüsenlumina, wobei das Stroma den größten Anteil ausmacht. Die Relation zwischen Stroma und Epithel wird mit 5:1 [119] bzw. 3,9:1 im Bereich von 1,6:1-7,6:1 [120] angegeben. Diese Relation vergrößert sich noch im Fall der benignen Prostatahyperplasie (BPH), da die epitheliale zugunsten der stromalen Komponente abnimmt. Es scheint, daß dieses Verhältnis die Cathepsinaktivitäten, die wir in den Gewebeproben ermittelten, beeinflußt. Das Überwiegen der Stromakomponente mit ihren Fibroblasten und glatten Muskelzellen hat somit wohl den größeren Anteil an der Aktivität der Enzyme.

Auch die Verteilung der Cathepsine in den verschieden gewonnen Proben ist uneinheitlich und bedarf der Interpretation.

Adenomektomieproben enthielten zumeist mehr Cathepsin als das tumor-umgebende normale Gewebe oder das von Zystoprostatektomien gewonnene. Die geringsten Aktivitäten fanden sich in den Proben von transurethralen Re-sektionen der Prostata (TURP).

Diese Unterschiede lassen sich zum einen aus der Art der Probengewinnung erklären, möglicherweise sind sie aber auch charakteristisch für den jeweiligen Zustand des Gewebes. Bei radikalen Prostatektomien wird das ganze Organ entnommen und es bietet sich die Möglichkeit, Proben zu entnehmen, die auch histologisch eindeutig gesichert werden können. Somit erhält man normales (nichterkranktes) bzw. benigne und maligne verändertes Gewebe.


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Zystoprostatektomien werden als operative Therapie bei Blasenkrebs vorgenommen. Die dabei entfernte Prostata ergibt Proben, die als normal angesehen werden, doch auch hier muß eine sorgfältige histologische Analyse durchgeführt werden, um BPH oder ein Karzinom auszuschließen. Die geringeren Cathepsinaktivitäten im Material der transurethralen Resektionen (TURP) sind sicherlich Folge der Elektroresektion, bei der durch direkten Hitzeeinfluß die Aktivitäten der Enzyme beeinträchtigt werden. Dies ist wahrscheinlich die Ursache der Unterschiede zum Adenomektomie-Gewebe, das ja histologisch gleich ist und demzufolge vergleichbare Aktivitäten zeigen müßte.

Die durch Adenomektomie erhaltenen Proben enthalten durchgehend die höchsten Aktivitäten. Eine erhöhte Cathepsinaktivität bei benigner Prostata-hyperplasie ist bis jetzt noch nicht beschrieben worden.

Erklärung bietet eine Studie von Guenette et al. [121], die erhöhte Cathepsin-B-Aktivitäten während der Regression der Prostata der Ratte beschreibt. 3-4 Tage nach Hormonentzug, wenn die Rückbildung der Drüse maximal war, fanden sich die höchsten mRNA-Werte für das RSG-2 Gen. Dieses Gen ist homolog zu Cathepsin B. Es kommt zu einer Umverteilung an die basale Zellmembran und zu einem späteren Zeitpunkt finden sich vermehrte Mengen des Proteins in den apoptotischen Zellen.

5.2.1. Korrelation mit anderen Tumormerkmalen

Bei der Korrelation mit den anderen Tumormerkmalen zeigte sich eine Korrelation zwischen Cathepsin H und dem TNM-Staging und eine negative Korrelation zwischen Cathepsin L und dem histologischen Grading. Eine Korrelation zwischen Cathepsin H und TNM-Stadien fand sich in der Literatur nicht. Budinha et al. [13] beschrieben einen Zusammenhang zwischen Höhe der Cathepsin-H-Aktivität und einer verbesserten Überlebensrate bei der Untersuchung von Kopf-Halstumoren. Dies widerspricht dem von uns errechneten Zusammenhang, da Patienten mit fortgeschrittenerem Karzinom im allgemeinen eine schlechtere Überlebensrate haben.

Lah et al. [23] fanden eine negative Korrelation zwischen erhöhter Cathepsin-L-Aktivität und rezidivfreier Überlebenszeit. Das würde heißen, daß geringe


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Cathepsin-L-Aktivitäten mit einer Verbesserung der Überlebensrate einher-gehen. In unserem Fall korrelieren niedrige Aktivitäten des Enzyms mit den undifferenzierteren Tumoren. Auch dies widerspricht einer verbesserten Überlebensrate.

Betrachtet man die Verteilung der Patienten im Grading und Staging, zeigen sich Ungleichgewichte. Die TNM-Stadien verteilen sich in den 10 Proben folgendermaßen: 1 mal T1, 6 mal T2 und 3 mal T3. Im Grading gibt es 2 mal G1, 7 mal G2 und nur 1 mal G3. Aufgrund dieser Verteilung sind die gefun-denen Korrelationen im Hinblick auf die geringe Anzahl der Proben kritisch zu betrachten. Um eine echte Aussage hinsichtlich der Korrelation unserer Cathepsinwerte mit anderen Tumormerkmalen treffen zu können bedarf es sicherlich einer größeren Gruppe und einer Verlaufskontrolle.

5.3. Cathepsine B, H, L und Cysteinprotease-Inhibitoren in Primärzellkulturen

Wir fanden in den primären Zellkulturen andere Relationen der Cathepsin-aktivitäten als im Gewebe.

Auch andere Autoren beschreiben Unterschiede zwischen Gewebe und primären Zellkulturen. Festuccia et al. [122] untersuchten die Aktivität des Plasminogen-Aktivators in Primärzellkulturen. Sie empfahlen, die Bestimmung in Primärzellkulturen und nicht in Gewebeproben vorzunehmen.

Die für die Gewebeproben erwartete Erhöhung der Cathepsine in den Tumor-proben fand sich erstaunlicherweise in den Primärzellkulturen. Alle drei Cathepsine waren in den Zellkulturen, die aus dem malignen Gewebe etabliert wurden, signifikant erhöht. Das bedeutet, daß bei jedem der 5 Paare, die aus Tumorgewebe angezüchteten Zellen höhere Aktivitäten zeigten, als die aus normalem Gewebe gewonnenen.

Wir schlußfolgern daraus, daß die Untersuchung der Primärzellkulturen genauere und zuverlässigere Ergebnisse bringt, als die Analyse der Gewebeproben. Grund hierfür scheint zu sein, daß die Heterogenität des Gewebes durch die Anzucht primärer Zellkulturen aufgehoben wird. Es wachsen lediglich die epithelialen Zellen, deren Cathepsinaktivitäten ein


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genaueres Bild des Tumorgeschehens darstellen. Die Charakterisierung dieser Zellen ist nur in Hinsicht auf ihren epithelialen Ursprung möglich.

Es gibt bis jetzt keine zuverlässigen Marker, die zwischen gesunden und malignen Zellen zuverlässig unterscheiden können [97]. So obliegt der sorgfältigen histologischen Untersuchung des benutzten Gewebes in diesem Fall eine besondere Bedeutung.

Die Konzentration der Cysteinprotease-Inhibitoren zeigte keine Unterschiede zwischen normalen und malignen Zellkulturen. Nachdem wir aber die Relation für alle Cathepsine insgesamt zu den CPI errechnet hatten, stellte sich diese für die Tumorzellen signifikant erhöht dar. Das unterstützt die Theorie, daß auch dem Prostatakarzinom ein verschobenes proteolytisches Gleichgewicht, im Sinne von erhöhten Cathepsinwerten und unzureichend vorhandenen Inhibitoren, zugrundeliegt. Im Hinblick auf Invasion und Metastasierung des Tumors scheint dieses Verhältnis eine größere Bedeutung zu haben als Aktivität der Cathepsine oder der CPI allein [123].

Ein ähnliches Ungleichgewicht wurde bereits für Metalloproteasen und ihre Gewebsinhibitoren beschrieben [124].

5.3.1. Korrelation mit anderen Tumormerkmalen

In Bezug auf andere Tumormerkmale (Grading und Staging) konnten wir bei den Primärzellkulturen keine Korrelation finden. Das liegt sicherlich an der sehr kleinen Anzahl der Patienten und der damit verbundenen Verteilung der Patienten im Grading und Staging. Von den 5 Proben wiesen beim Grading vier ein G3 auf, 1 ein G2. G1 war in dieser Gruppe gar nicht vertreten. In der TNM-Klassifizierung sieht die Verteilung ähnlich aus: 3 mal T3 und 2 mal T2, T1 war wiederum nicht vertreten.


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5.4. Permanente Zellkulturen

Die Cathepsine B, H und L sind bis jetzt noch nicht systematisch in den drei immortalen Zellinien LNCaP, PC3 und DU145 untersucht worden. Es gibt daher keine direkt vergleichbaren Studien.

Weiss et al. [125] untersuchten die Expression verschiedener Proteasen in den Zellinien LNCaP und DU145. Sie fanden, daß Cathepsin B in den androgen- insensitiven DU145 erhöht war. Da die LNCaP-Zellinie androgen-sensitiv ist, schlußfolgern die Autoren daraus, daß die erhöhte Cathepsinaktivität mit dem aggressiveren, entdifferenzierten Phänotyp einhergeht. Androgen-insensitive Zellinien entstehen unter dem Einfluß einer antiandrogenen Therapie und sind dann zumeist kennzeichnend für ein fortgeschrittenes Prostatakarzinom.

Dies entspricht nur zum Teil unseren Ergebnissen. Die DU145-Zellen zeigten bei allen drei Cathepsinen höhere Aktivitäten als die LNCaP-Zellen. Die ebenfalls androgen-insensitive PC3-Zellinie lag aber im Cathepsingehalt noch niedriger als die LNCaP-Zellen. Der angenommene Unterschied, daß die androgen-insensitiven Zellkulturen ein größeres malignes Potential besitzen, spiegelt sich im Cathepsingehalt nicht wieder.

Neben der Androgen-Sensitivität gibt es noch andere Merkmale, die diese Zellinien charakterisieren. Tumorsuppressorgene sind ein bedeutender Faktor in der Ätiologie vieler Krebsarten, gekennzeichnet durch den Verlust oder Mutationen der kodierten Proteine in den malignen Zellen. Produkte der Tumorsuppressorgene, z.B. p53 und Rb, sind negative Regulatoren des Zellzyklus. Änderungen ihrer Expression tragen zur Entwicklung der malignen Transformation bei. Mutationen des p53 sind assoziiert mit metastatasierenden Prostatakarzinomen [126]. Mutationen des p53 lagen bei DU145 und PC3 vor, jedoch nicht in LNCaP-Zellen. Also bietet sich auch hier keine Erklärung der von uns gefundenen Cathepsinverteilung, da wiederum DU145 und PC3 Zeichen einer höheren Malignität zeigen, die sich nicht in der Aktivität der Cathepsine widerspiegelt. Das Verteilungsschema scheint in etwa mit dem anderen Tumorsuppressorprotein, dem Rb, zu korrelieren. LNCaP und PC3 exprimieren ein normales Rb-Protein, während das Gen in den DU145-Zellen eine Mutation mit einem Verlust von 105 Nukleotiden zeigt [98].


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Da jedoch verschiedene Mechanismen bei der Invasivität und Metastasierung zusammenspielen, bleibt bisher ungeklärt, warum sich die beiden androgen-insensitiven Zellinien so im Cathepsingehalt unterscheiden.

Eine andere mögliche Erklärung wäre, daß sich die Zellinien nach so langer Kultivierung in ihren Merkmalen verändert haben und deshalb die Cathepsin-werte nicht mehr mit den bekannten Malignitätskriterien übereinstimmen. Solche veränderten Expressionen sind möglich und wurden z.B. für das Verhältnis der antioxidativen Enzyme in den drei von uns untersuchten Prostatazellinien beschrieben [127]. Aus diesem Grund haben wir beide androgen-insensitiven Zellinien (PC3 und DU145) mitgeführt, um einen Ver-gleich zu haben.

Der Einfluß spezifischer Bedingungen in der Kultur ist unserer Ansicht auch dafür verantwortlich, daß kein Zusammenhang zu den Primärzellkulturen erkennbar ist. Die in den immortalisierten Zellen gemessenen Aktivitäten liegen um ein vielfaches höher als in den primären Zellkulturen. Betrachtet man hingegen die CPI-Konzentrationen, so liegen diese unter den Werten der Primärzellkulturen. Diese Diskrepanzen erschweren einen Vergleich von primären mit immortalisierten Zellkulturen der Prostata.

Wir sind daher der Ansicht, daß sich die permanenten Zellinien LNCaP, DU145 und PC3 nicht für Untersuchungen über eine mögliche Beziehung zwischen Proteasen und der Entwicklung des Prostatakarzinoms eignen.

5.4.1. Ammoniumchlorid-stimulierte Zellkulturen

Neben der Erhöhung der Cathepsine in Tumorgeweben hat man auch gefunden, daß maligne Zellen in Kultur vermehrt Cathepsine sezernieren [25]. Die Menge des sezernierten Enzyms war in Adenokarzinomzellen signifikant höher als in Fibroadenomzellen.

Die Stimulierung der drei immortalisierten Zellinien LNCaP, PC3 und DU145 erfolgte in Anlehnung an eine Studie von Keppler et al. [52], die ihre Untersuchungen an Kolonkarzinomzellinien durchführten. Deren Ziel war es, festzustellen, ob die Akkumulierung des latenten Cathepsin B im Kulturmedium im Zusammenhang mit der begleitenden Sekretion des Inhibitors Cystatin C steht.


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Ammoniumchlorid ist eine azidophile Substanz, von der bekannt ist, daß sie in sauren Kompartimenten akkumuliert. Dadurch steigt der pH-Wert auf über 8,0 und somit ist die Aufnahme der lysosomalen Enzyme über Mannose-6-Phosphat-Rezeptoren blockiert. Aus diesem Grund wird neusynthetisiertes Cathepsin B sezerniert.

Die Untersuchung 10 verschiedener Kolonkarzinomzellinien ergab, daß durch Stimulierung mit NH4Cl die Cathepsin-B-Sekretion erhöht wurde, die Sekretion des Cystatin C jedoch unbeeinflußt blieb. Die Autoren schlußfolgerten, daß latentes Cathepsin B ein echtes Proenzym ist und kein Enzym-Inhibitor-Komplex. Die Behandlung mit NH4Cl resultierte in einer erhöhten Sekretion von Cathepsin B in 9 von 10 Fällen und als Folge in einen Abfall des intrazellulären Cathepsingehaltes in 7 von 10 Fällen. Die Cystatin-C-Konzentration änderte sich nicht signifikant.

In unserem Fall diente die Stimulierung mit Ammoniumchlorid als Modell für den Einfluß exogener Substanzen auf das proteolytische Verhältnis.

Bei den von uns untersuchten Zellinien zeigte sich wieder ein ähnliches Verteilungsmuster der drei Zellinien vor und nach Stimulierung. Generell sezernierten DU145-Zellen die meisten Cathepsine gefolgt von LNCaP und PC3. Die Stimulierung führte in den meisten Fällen zu einem Abfall der Cathepsin-Konzentration im Zellysat und einem Anstieg im Überstand. Diese Differenz war aber in nur wenigen Fällen signifikant.

Das Bild bei den Cysteinprotease-Inhibitoren sieht anders aus. Hier kommt es in den stimulierten Zellen sowohl intra- als auch extrazellulär zu einem Anstieg der Konzentration. Bemerkenswert ist hier auch, daß die Konzentration im Überstand um zwei Größenordnungen über der im Zellysat liegt.

Aus diesen Ergebnissen leitet sich ab, daß die Sekretion der Cathepsine wahrscheinlich andere Mechanismen beinhaltet als die Sekretion der Inhibitoren. Außerdem scheint eine Stimulierung durch exogene Substanzen vor allem die Sekretion der Inhibitoren und weniger der Cathepsine zur Folge zu haben.


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