Friedrich , Beate: ”Cathepsine B, H, L und ihre Inhibitoren im Gewebe und in Zellkulturen der Prostata“

Aus der Klinik für Urologie
des Universitätsklinikums Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin
Direktor Prof. Dr. med. S.A. Loening


DISSERTATION
”Cathepsine B, H, L und ihre Inhibitoren im Gewebe und in Zellkulturen der Prostata“

Zur Erlangung des akademischen Grades
doctor medicinae
(Dr. med.)

Medizinische Fakultät Charité,
der Humboldt-Universität zu Berlin

vorgelegt von Frau Beate Friedrich ,
geb. am 4. April 1972 in Zwickau/Sa.

Dekan: Prof. Dr. med. M. Dietel

Gutachter:
Prof. Dr. med. K. Jung
Prof. Dr. med. habil. H. Seiter
PD Dr. med. A. Sokolowski

eingereicht: Januar 1998

Datum der Promotion: 28.01.1999

Abstract

The cathepsins B, H and L (CB, CH, CL) are lysosomal proteolytic enzymes belonging to the cysteine protease family. Elevated cathepsin levels and decreased concentration of their endogenous inhibitors have been demonstrated in a variety of tumors, suggesting a contribution to invasion and metastasis. The situation for prostate cancer was so far unknown.

Using fluorimetric assays, catalytic activities of the cathepsins B, H, L were measured in prostatic tissue samples obtained from different groups of patients, in primary cell cultures established from human prostate and in the immortalized cell lines LNCaP, PC3 and DU145. Inhibitory activities of cysteine protease inhibitors (CPI) were tested against purified cathepsin B.

Comparing matched pairs of normal and cancerous tissue samples from the prostate, significantly decreased levels of CB and CL were found in malignant samples. In contrast, primary cell cultures from malignant tissue showed elevated levels of all three cathepsins and increased ratios of cathepsins to CPI when compared to cell cultures from non-malignant prostate. The permanent cell lines showed a similiar distribution of cathepsin levels, DU145 with the highest activity, followed by LNCaP and PC3.

These results suggest that elevated cathepsin activities and increased ratios of cathepsins to CPI in malignant cell cultures compared to non-malignant samples may be an indication for a cellular proteolytic imbalance in prostatic cancer cells. Regarding different results, determinations in primary cell cultures should be preferred to tissue samples.

Keywords:
cathepsins, cysteine protease inhibitor, prostate carcinoma, LNCaP, PC3, DU145

Zusammenfassung

Die Cathepsine B, H und L sind lysosomale Enzyme, die zur Gruppe der Cysteinproteasen gehören. Erhöhte Aktivitäten dieser Proteasen fand man in Gewebeproben verschiedener Tumore, vermutlich Hinweis auf eine Beteiligung an Invasion und Metastasierung. Unter physiologischen Bedingungen werden die Cathepsine von endogenen Inhibitoren kontrolliert, eine Verminderung dieser Cysteinprotease-Inhibitoren (CPI) würde die proteolytische Dysbalance verstärken und zur Ausbreitung des malignen Prozesses beitragen. Für das Prostatakarzinom gab es bisher keine Untersuchungen.

Die Aktivität der Cathepsine wurde mit Hilfe spezifischer Substrate bestimmt, die zur Bildung fluorogener Produkte führten. Zur Bestimmung der inhibitorischen Aktivität der CPI wurden die Proben nach einer Hitzeaktivierung gegen reines Cathepsin B getestet. Untersucht wurden Gewebeproben verschiedener Patientengruppen, Primärzellkulturen, die aus normalem und maligne veränderten Prostatagewebe angezüchtet wurden und vergleichend dazu die drei immortalisierten Zellinien LNCaP, PC3 und DU145.

Die Ergebnisse der Gewebeproben zeigten höhere Aktivitäten der Cathepsine B und L im nichterkrankten Gewebe, nicht wie erwartet im Tumorgewebe der Prostata. Hingegen waren bei den Primärzellkulturen alle drei Cathepsine und der Quotient Cathepsine/CPI in den Tumorproben erhöht. Die immortalisierten Zellinien zeigten die gleiche Verteilung bei allen Cathepsinen, DU145 mit der höchsten Aktivität, gefolgt von LNCaP und PC3.

Anhand der Ergebnisse schlußfolgern wir, daß die Untersuchung von Gewebe-proben der Prostata hinsichtlich der Beteiligung der Cathepsine am Tumor-geschehen keine eindeutigen Erkenntnisse erbringt. Dies ist vermutlich auf die Heterogenität des Gewebes zurückzuführen, das nicht nur epitheliale, sondern auch stromale Zellen enthält. Die aus dem Gewebe angezüchteten Primär-zellkulturen scheinen ein genaueres Bild des Verhältnisses von Cathepsinen und den Inhibitoren zu geben und sind unserer Meinung nach den Bestimmungen in Gewebeproben vorzuziehen.

Schlagwörter:
Cathepsine, Cysteinprotease-Inhibitor, Prostatakarzinom, LNCaP, PC3, DU145


Seiten: [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61]

Inhaltsverzeichnis

Titelseite ”Cathepsine B, H, L und ihre Inhibitoren im Gewebe und in Zellkulturen der Prostata“
Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis
1 Einleitung und Problemstellung
2 Theoretischer Teil: Cathepsine B, H, L und ihre Inhibitoren
2.1.Eigenschaften, Synthese und Vorkommen der Cathepsine B, H, L
2.2.Biologische Funktionen der Cathepsine
2.3.Regulation der Enzymaktivität
2.4.Charakterisierung der Cysteinprotease-Inhibitoren
2.4.1.Vorkommen, Eigenschaften und Struktur
2.4.2.Rolle der Cysteinprotease-Inhibitoren bei pathologischen Prozessen
2.5.Rolle der Cathepsine und ihrer Inhibitoren bei malignen Erkrankungen
2.6.Cathepsine in Prostatagewebe und Zellkulturen
3 Material und Methoden
3.1.Patientengruppen
3.1.1.Prostatakarzinompatienten
3.1.2.Adenomektomiepatienten
3.1.3.Patienten mit transurethraler Resektion der Prostata
3.1.4.Patienten mit Zystoprostatektomien
3.2.Materialgewinnung und Lagerung
3.3.Aufbereitung der Gewebeproben
3.4.Vorbereitung der Zellkulturen
3.4.1.Kulturmedien und Materialien
3.4.2.Primärzellkulturen
3.4.3.Permanente Zellkulturen
3.5.Bestimmung der Cathepsine, Cysteinprotease-Inhibitoren und des Proteingehaltes
3.5.1.Testprinzip
3.5.2.Aktivitätsbestimmung der Cathepsine B, H und L
3.5.2.1.Geräte, Reagenzien, Probenmaterialien
3.5.2.2.Testdurchführung
3.5.2.3.Berechnung der Aktivität
3.5.3.Bestimmung der Inhibitoren
3.5.4.Bestimmung des Proteingehaltes
3.5.5.Statistische Auswertung
4 Ergebnisse
4.1.Zuverlässigkeit der Enzymaktivitätsbestimmungen
4.1.1.Intraserielle Präzision
4.1.2.Interserielle Präzision
4.2.Überprüfung der Enzymextraktionen
4.3.Korrelation der Bezugsgrößen
4.4.Cathepsine B, H, L und Cysteinprotease-Inhibitoren in Prostatagewebeproben
4.4.1.Vergleich von normalem und Tumorgewebe
4.4.2.Adenomektomien, Zystoprostatektomien, transurethrale Resektionen
4.5.Cathepsine B, H, L und Cysteinprotease-Inhibitoren in Zellkulturen
4.5.1.Vergleich der Primärzellkulturen
4.5.2.Permanente Zellkulturen
4.5.2.1.Ammoniumchlorid-stimulierte Zellkulturen
5 Diskussion
5.1.Methodik
5.2.Cathepsine B, H, L und Cysteinprotease-Inhibitoren in Gewebeproben der Prostata
5.2.1.Korrelation mit anderen Tumormerkmalen
5.3.Cathepsine B, H, L und Cysteinprotease-Inhibitoren in Primärzellkulturen
5.3.1.Korrelation mit anderen Tumormerkmalen
5.4.Permanente Zellkulturen
5.4.1.Ammoniumchlorid-stimulierte Zellkulturen
6 Ausblick
7 Zusammenfassung
Bibliographie Literaturverzeichnis
Anhang A
Selbständigkeitserklärung
Danksagung
Lebenslauf

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1 Überblick über die Cathepsine B, H, L und Cysteinprotease-Inhibitoren (CPI) in Gewebeproben verschiedener maligner Tumore des Menschen.
uarr dient als Symbol für erhöhte Aktivität, vermehrte immunhistochemische Anfärbung bzw. vermehrten Gehalt an mRNA. darr symbolisiert verminderte Aktivität, mRNA, immunhistochemische Anfärbung bzw. inhibitorische Kapazität. Nicht untersuchte Parameter sind mit - gekennzeichnet, n.s. bedeutet, daß der Unterschied zwischen normalem und Tumorgewebe statistisch nicht signifikant war.
Tabelle 2 Biochemische Charakteristika der Cathepsine B, H und L, zusammen-gestellt aus mehreren Arbeiten [59-61].
Angegeben sind Molekulargewicht, die Anzahl der Aminosäuren (AS), aus denen das reife Enzym besteht, pH-Optimum und die Punkte der isoelektrischen Fokussierung (pI).
Tabelle 3 Intraserielle Präzision der Cathepsinbestimmungen.
Tabelle 4 Interserielle Präzision der Cathepsinbestimmungen
Tabelle 5 Anteil der Aktivität der zweifachen Tritonextraktion in Proben, die drei-fach extrahiert wurden.
Tabelle 6 Korrelation zwischen den Bezugsgrößen, lineare Korrelations-koeffizienten.
Tabelle 7 Verhältnis von Cathepsinen zu Cysteinprotease-Inhibitoren. Die ange-gebenen Quotienten entsprechen den arithmetischen Mittelwerten ± Standard-abweichung von jeweils 10 Gewebeproben.
Tabelle 8 Verhältnis von Cathepsinen zu Cysteinprotease-Inhibitoren. Die angegebenen Quotienten entsprechen den arithmetischen Mittelwerten ± Standardabweichung von jeweils 5 Gewebeproben.
Tabelle 9 Prozentuale Anteile der einzelnen Cathepsine im Überstand und Zellysat der drei permanenten Zellinien DU145, LNCaP und PC3 ohne und mit Ammoniumchlorid-Stimulierung. Die Summe der Aktivitäten (Mittelwerte) in Zellysat und Überstand wurde 100 % gesetzt und dann der jeweilige prozen-tuale Anteil errechnet. SD bezeichnet die Standardabweichung.

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1. Schematischer Aufbau des Fluoreszenzspektrophotometers RF-1502.
Im Anregungsmonochromator wird aus dem von der Xenonlampe (X) erzeugten Licht die Ausgangswellenlänge von 370 nm herausgefiltert. Im Küvettenhalter (K) wird die zu messende Probe eingebracht. Der rechtwinklig zum Anregungsmonochromator angebrachte Emissionsmonochromator zerlegt das von der Probe emittierte Licht (lambda 460 nm), das dann vom Photomultiplier 2 (2) aufgefangen wird. Die Aufgabe des Monitor-Photomultipliers (1) ist es, Intensitätsschwankungen des Lichts der Xenonlampe zu kompensieren und das Signal/Rauschverhältnis zu verbessern.
Abb. 2. Korrelation der Bezugsgrößen in den Gewebeproben von Prostatektomien, Adenomektomien, Zystoprostatektomien und trans-urethralen Resektionen der Prostata.
Dargestellt ist das Verhältnis von Cathepsinen B, H, L (Abb. a-c) und CPI (Abb. d) pro Gramm Protein zu Cathepsinen bzw. CPI pro Gramm Feuchtgewicht. Die Koeffizienten der linearen Korrelation sind in Tabelle 6 (Seite 31) aufgeführt.
Abb. 3. Korrelation der Bezugsgrößen in den Primärzellkulturen der Prostata.
Dargestellt ist das Verhältnis von Cathepsinen B, H, L (Abb. a-c) und CPI (Abb. d) pro Gramm Protein zu Cathepsinen bzw. CPI pro eine Million Zellen. Die Koeffizienten der linearen Korrelation sind in Tabelle 6 (Seite 31) aufgeführt.
Abb. 4. Korrelation der Bezugsgrößen in den immortalisierten Zellinien LNCaP, DU145 und PC3.
Dargestellt ist das Verhältnis von Cathepsinen B, H, L (Abb. a-c) und CPI (Abb. d) pro Gramm Protein zu Cathepsinen bzw. CPI pro eine Million Zellen. Die Koeffizienten der linearen Korrelation sind in Tabelle 6 (Seite 31) aufgeführt.
Abb. 5. Prostata-Gewebeproben von nichterkranktem (PN) und Karzinom-gewebe (PC), Adenomektomien (Ad), transurethralen Resektionen der Prostata (TURP) und von Zystoprostatektomien (Zy). Die Säulen zeigen Mittelwert ± Standardabweichung des Proteingehaltes in µg/mg Gewebe. Die statistische Analyse mit dem t-Test zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen.
Abb. 6a-b. Cathepsine B und H in Gewebeproben der Prostata. Aus-führliche Legende auf der nächsten Seite.
Abb. 6. Cathepsine B, H, L (6 a-c) und Cysteinprotease-Inhibitoren (6 d) in Prostata-Gewebeproben. PN und PC bezeichnen jeweils 10 zusam-mengehörende Paare, die bei Prostatektomien von nichterkranktem (PN) und malignem (PC) Gewebe gewonnen wurden. Die mit Ad be-zeichneten Proben stammen von Adenomektomien (n=9), TURP von transurethralen Resektionen der Prostata, Zy von Zystoprostatektomien. Von beiden Gruppen wurden je 6 Proben untersucht.
Die Säulen repräsentieren Mittelwerte ± Standardfehler. Im t-Test signifikante Unterschiede sind mit den Buchstaben a-e gekennzeichnet. Dabei bedeutet (a) signifikant unterschiedlich zu PN, (b) zu PC, (c) zu Adenomektomien, (d) zu transurethralen Resektionen und (e) zu den Zystoprostatektomien.
Abb. 7a-b. Cathepsine B und H in Zellkulturen der Prostata. Ausführ-liche Legende auf der nächsten Seite.
Abb. 7. Cathepsine B, H, L (7 a-c) und Cysteinprotease-Inhibitoren (7 d) in Zellkulturen der Prostata. PCN und PCC bezeichnen 5 jeweils zusammengehörende Paare von Primärzellkulturen, die aus nichterkranktem (PCN) und malignem (PCC) Gewebe angezüchtet wurden. Von den drei immortalisierten Zellinien LNCaP, DU145 und PC3 wurden jeweils 5 Proben untersucht.
Die Säulen repräsentieren Mittelwerte ± Standardfehler. Im t-Test signifikante Unterschiede sind mit den Buchstaben a-e gekennzeichnet. Dabei bedeutet (a) signifikant unterschiedlich zu PCN, (b) zu PCC, (c) zu LNCaP, (d) zu DU145 und (e) zu den PC3.
Abb. 8a-b. Cathepsine B und H in den drei immortalisierten Zellinien DU145 (DU), LNCaP (LN) und PC3 (PC) vor (-) und nach (+) Stimu-lierung mit Ammoniumchlorid.
Ausführliche Legende auf der nächsten Seite.
Abb. 8. Darstellung der drei immortalisierten Zellinien DU145 (abgekürzt DU), LNCaP (LN) und PC3 (PC) vor (-) und nach (+) Stimulierung mit Ammoniumchlorid. Es wurden jeweils Zellysate (schraffiert) und Überstände (leer) untersucht.
Die Säulen repräsentieren Mittelwerte ± Standardabweichung von je 5 gemessenen Werten. Im t-Test signifikante Unterschiede zwischen stimulierten und unstimulierten Zellysaten (bzw. Überständen) einer Zellinie sind mit (*) gekennzeichnet.
Die Abbildungen 8 a-c zeigen die Aktivitäten der Cathepsine B, H und L. In Abbildung 8 d ist die Konzentration der Cysteinprotease-Inhibitoren dargestellt.

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Mon Jan 10 18:11:09 2000