Gebauer, Bernhard: Hyaluronsäure als Verlaufsparameter im Rahmen der Lebertransplantation

13

Kapitel 2. Material und Methoden

2.1. Patienten und Diagnosen

Unsere Studie umfaßt 81 Patienten (f: 31 m: 50) mit 85 orthotopen Lebertransplantationen (LTX), die zwischen August 1993 und Juli 1994 im Universitätsklinikum Rudolf Virchow der Freien Universität Berlin transplantiert wurden. Das durchschnittliche Alter der Patienten zum Zeitpunkt der Transplantation betrug 45,8 ± 1,1 Jahre (18 - 62 Jahre).

Bei den Patienten wurden prospektiv die Serumspiegel verschiedener Cytokine und extrazellulärer Matrix-Bestandteile intra- und postoperativ gemessen und ausgewertet.

Indikation für die primäre Lebertransplantation war bei 16 Patienten eine Alkohol-toxische Zirrhose, bei 12 Patienten eine Hepatitis B (HBV), bei 11 Patienten eine Hepatitis C (HCV) Zirrhose, bei 11 Patienten eine Primäre Biliäre Zirrhose (PBC), bei 8 Patienten eine kryptogene Zirrhose, bei 4 Patienten eine autoimmune Zirrhose, bei 5 Patienten ein akutes Leberversagen (ALV) aufgrund einer fulminanten HBV, HCV-Hepatitis oder einer Intoxikation und bei 12 Patienten verschiedene andere Indikationen.

Zu den 12 Patienten mit anderen Indikationen gehörten 3 Patienten mit Budd-Chiari-Syndrom, 2 mit Oxalose, 2 mit Morbus Wilson, und je 1 Patient mit Caroli-Syndrom, Primärer Sklerosierender Cholangitis (PSC), Klatskin-Tumor, Carcinoid-Metastase und Zystenleber.

Abb. 3 : Indikationen zur primären Lebertransplantation (n=79)


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Aufgrund der Grunderkrankung wurde die Lebertransplantation bei 4 Patienten mit einer Nierentransplantation (NTX) verbunden und bei 2 weiteren Patienten machte die Grunderkrankung eine Kombination von Lebertransplantation und Kausch-Whipple-Operation notwendig.

Sechs Retransplantationen (Re-LTX) wurden ebenfalls in unsere Studie mitaufgenommen. 4 Patienten, die bereits im Rahmen ihrer primären Lebertransplantation in unserer Studie waren, mußten retransplantiert werden. Indikation für die Retransplantation war jeweils in einem Fall eine Initiale Nicht-Funktion (INF) des Transplantats, eine chronische Abstoßung, eine therapierefraktäre akute Abstoßung und ein frühes Transplantatversagen aufgrund einer Lungenarterienembolie-Lysetherapie mit rekombinantem tissue Plasminogen-Aktivatorkomplex (rt-PA) und disseminierter intravasaler Koagulopathie (DIC).

2 Patienten wurden erst im Rahmen der Retransplantation in die Studie aufgenommen. Ein Patient aufgrund einer chronischen Abstoßung und ein Patient mit einer Hepatitis B-Reinfektion.

Die Studie wurde von der Ethikkomission der Freien Universität Berlin geprüft; jeder Patient erklärte vor Teilnahme an der Studie schriftlich sein Einverständnis.

Tab.1: Indikationen zur Lebertransplantation (n=85)

Indikation zur LTX

Transplantationen

Leberzirrhose

70

Akutes Leberversagen (ALV)

5

Retransplantation (Re-LTX)

6

Andere (Zystenleber, Carcinoid-Metas-tase, Klatskin-Tumor, Caroli-Syndrom)

4

Insgesamt (Transplantationen)

85


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2.2. Methoden

2.2.1. Prä- und postoperative Untersuchungen

Präoperativ : Mit Ausname der Patienten mit fulminantem Leberversagen wurde bei allen Patienten im Rahmen des Evaluierungsprogramms eine körperliche Untersuchung, eine abdominelle Ultraschalluntersuchung, eine Abdomen-Computertomographie und eine Angiographie des Truncus coeliacus durchgeführt.

Postoperativ : Routinemäßig wurde am 7. postoperativen Tag und bei jedem Verdacht auf eine Abstoßung eine Leberbiopsie durchgeführt. Am 5. postoperativen Tag wurde über die T-Drainage eine Cholangiographie zum Ausschluß von Strikturen oder Leakagen der Gallengangsanastomose durchgeführt, wenn diese ausgeschlossen werden konnten, so wurde die T-Drainage abgeklemmt.

42 Tage nach Transplantation wurde vor dem Entfernen der abgeklemmten T-Drainage eine zweite Choleangiographie durchgeführt.

2.2.2. Intraoperative Verfahren und Transplantat-Konservierung

Die Konservierung des für die Transplantation vorgesehenen Organs erfolgte mit der University of Wisconsin (UW) Lösung. Die kalte Ischämiezeit betrug zwischen 3,5 und 22 Stunden (Mittelwert 9,5 ± 0,4 Stunden).

Die orthotopen Transplantationen wurden nach einer standardisierten Methode durchgeführt (14). Während der anhepatischen Phase wurde ein veno-venöser Bypass mit Pumpe zwischen der Vena femoralis und der Vena axillaris eingesetzt (12). Die Gallengangsanastomose erfolgte mittels einer Seit-zu-Seit-Choledochochole-dochostomie mit T-Drainage (10, 15). In einem Fall machte die Grunderkrankung eine Choledochojejunostomie notwendig. Alle Anastomosen waren vor Reperfusion geschlossen.

Intraoperativ bis 3 Tage nach Transplantation erhielten alle Patienten Aprotinin (0,1 Mio. I.E. /h) zur Senkung des Bedarfs an Blutkonserven (13). Weiterhin erhielten alle Patienten zur Aufrechterhaltung einer ausreichenden Diurese Dopamin in Nierendosis (bis 3 µg/kg KG/h) bis 48 Stunden postoperativ.


16

2.2.3. Immunsuppression

24 Patienten erhielten eine Quadruple Therapie aus Cyclosporin A (CyA), Azathioprin (AZA), Prednisolon und Anti-Lymphozyten Immunglobulin (ALG, Mérieux, Frankreich) für die ersten 7 postoperativen Tage, gefolgt von einer Triple Therapie aus Cyclosporin A, Azathioprin und Prednisolon.

47 Patienten wurden anstatt mit ALG mit dem Interleukin 2 Rezeptor Antagonisten BT563 (Biotest, Dreieich, Deutschland) für die ersten 12 Tage gefolgt von einer Triple Therapie behandelt (24).

Keine Induktionstherapie wurde bei 12 Patienten durchgeführt (Primäre Triple Therapie). 2 Patienten, die retransplantiert wurden, waren vorher auf FK506 (Prograf, Fujisawa, Osaka, Japan) und Prednisolon umgestellt worden. Die Umstellung erfolgte bei einem Patienten wegen einer steroid-resistenten Abstoßung beim anderen Patienten aufgrund einer frühen chronischer Abstoßung.

Da die enterale Cyclosporin A Resorption von der Anwesenheit von Galle abhängig ist, wurde das Immunsuppressivum in den ersten 5 Tagen nach Transplantation i.v. gegeben, da in dieser Zeit die Galle über die T-Drainage abgeleitet wurde (79, 80). Danach wurde Cyclosporin A per os verabreicht, FK506 wurde direkt postoperativ per os gegeben. Die Einstellung der Immunsuppression erfolgte anhand von Blutspiegelkontrollen (EDTA-Blut) von FK506 (IMX, Abott, Wiesbaden (Zielbereich : 10 \|-\| 15 ng/ml)) und Cyclosporin A (polyklonal) (TDX-assay (Zielbereich : 600 \|-\| 800 ng/ml)).

Tab. 2: Induktionstherapie

  Quadruple Therapie Primäre Triple Therapie FK506 sigma
Induktion ALG BT563      
  Cyclosporin A Cyclosporin A Cyclosporin A FK506  
  Azathioprin Azathioprin Azathioprin    
  Prednisolon Prednisolon Prednisolon Prednisolon  
Transplantationen 24 47 12 2 85


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Tab. 3: Immunsuppressiva-Dosierungen (POD : postoperativer Tag)

Immunsuppressivum

Dosierung zu Beginn

spätere Dosierung

Cyclosporin A (CyA)

2 x 1-2 mg/kg KG i.v.

über jeweils 8 Stunden

ab POD 5: 2 x 5-7 mg/kg KG p.o., dann individuell nach Spiegel

Azathioprin (AZA)

1 x 25 mg p.o.

ab POD 7: 1-2 mg/kg KG, abhängig von der Leukozyten-zahl

Prednisolon

1 x 1 mg/kg KG p.o.

ab POD 4: stufenweise Reduk-tion

ALG

5 mg/kg KG i.v. über 8 Stunden

bis POD 8

BT563

10 mg i.v. über 24 Stunden

POD 6-12: 10 mg i.v. über 6 Stunden

FK506

0,1 - 0,2 mg/kg KG p.o.

individuell nach Spiegel

OKT3

5 mg/d als Bolus für 7 Tage

 

2.2.4. Abschätzung der initialen Transplantatfunktion

Die initiale Transplantatfunktion wurde anhand der Gallefarbe und -produktion in den ersten 24 Stunden nach Reperfusion und dem Maximum der hepatischen Enzyme im Plasma in den ersten 72 Stunden abgeschätzt. Die initiale Transplantatfunktion wurde in 3 Gruppen (gut, mäßig, schlecht) eingeteilt. (siehe Tab. 4)

Tab. 4: Score für die Initiale Transplantatfunktion

Parameter

1 Punkt

2 Punkte

3 Punkte

Galle Farbe (24 h nach Reperfusion)

dunkel braun

leicht braun

gelb

Gallenproduktion (24 h nach Reperfusion)

> 250 ml

< 250 ml

keine

AST / GOT (Maximum in 72 h)

< 500 U/l

500 - 1000 U/l

1000 U/l

ALT / GPT (Maximum in 72 h)

< 500 U/l

500 - 1000 U/l

1000 U/l

Transplantatfunktion

Gut

Mäßig

Schlecht

Punkte

4 - 6

7 \|-\| 9

10 - 12


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2.2.5. Prophylaxe, Diagnose und Therapie von Infektionen

Systemische Antibiotikaprophylaxe erfolgte für 2 Tage nach Lebertransplantation mit Cefotaxim, Tobramycin und Metronidazol i.v. (genaue Dosierungen siehe Tab. 5) (5). Als Prophylaxe vor Infektionen mit humanem Herpes Simplex Virus (HSV) wurden die Patienten mit Acyclovir p.o. in den ersten 6 Wochen nach Transplantation behandelt. Jeden 2. Tag wurde Cotrimoxazol p.o. zur Prophylaxe vor Pneumocystis carinii Infektionen gegeben. Die Prophylaxe vor Infektionen mit Legionellen erfolgte mit Ciprofloxacin p.o..

Die selektive Darmdekontamination (SDD) erfolgte oral bereits auf der Warteliste nach Indikationsstellung zur Lebertransplantation mit SDD3 (Polymyxin 100 mg, Nystatin 0,5 Mio. I.E., Tobramycin 80 mg) und nach der Transplantation weiter mit der viermaligen täglichen SDD3-Gabe p.o. bis 3 Wochen nach Transplantation (81).

Zur Prophylaxe vor Infektionen mit Zytomegalie-Viren (CMV) wurden alle Patienten am 1. und am 14. postoperativen Tag mit CMV-Antikörpern (Cytotect, Biotest, Dreieich, Deutschland) behandelt.

CMV negative Empfänger von einem CMV positiven Spender wurden in den ersten 4 Wochen einmal pro Woche prophylaktisch mit Cytotect und Gancyclovir behandelt. Alle Patienten wurden routinemäßig mit Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Alkaline Phosphatase anti-Alkaline Phosphatase (APAAP) auf CMV-Infektionen untersucht. Nachgewiesene Infektionen wurden mit Gancyclovir behandelt (82).

HBsAg positive Empfänger erhielten anti-HBs Hyperimmunglobulin (Hepatect, Biotest, Dreieich, Deutschland) intra- und postoperativ für 7 Tage, dann nach anti-HBs-Titer (5).


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Tab.5: Dosierung der Infektionsprophylaxe
* bei CMV positiven Spender und CMV negativem Empfänger am 1., 7., 14., 21. und 28. postoperativen Tag

Antibiotikum

Dosierung

Zeitraum

Cefotaxim

4 x 1 g /d i.v.

intra-Op. bis 48 h post-Op.

Tobramycin

3 x 40 - 80 mg /d i.v.

intra-Op. bis 48 h post-Op.

Metronidazol

2 x 500 mg /d i.v.

intra-Op. bis 48 h post-Op.

Ciprofloxacin

250 mg/d p.o.

bis 2 Wochen nach Entlassung

Cotrimoxazol

480 mg (3 x / Woche) p.o.

bis 2 Wochen nach Entlassung

Acyclovir

5 mg / kg KG,

dann 3 x 200 mg p.o.

für 6 Wochen nach Operation

CMV Immunglobulin

1 ml/kg KG i.v.

am 1. und 14. postoperativen Tag*

anti-HBs Immunglobulin

(nur bei HBsAg positiven Empfängern)

10.000 I.E. i.v.

2.000 I.E. i.v./d

intra-Op.

1. bis 7. postoperativer Tag, dann weiter nach anti-HBs-Titer

Dreimal pro Woche erfolgten routinemäßig orale, rektale und T-Drainagen Abstriche und Urinkulturen. Cholangitis wurde definiert als positive Routineabstrich-Kultur der T-Drainage, selbst wenn keine klinischen Infektionszeichen vorlagen (5).

Bei unklarem Fieber wurden sofort Urin, Gallen und Sekret Kulturen angelegt. Bei klinischem oder radiologischem Verdacht auf eine Pneumonie wurde eine Bronchoskopie veranlaßt, um die Diagnose zu sichern und Material für eine gezielte Antibiose zu gewinnen. Unklares Fieber oder Pneumonien ohne Keimnachweis wurden mit Imipenem und Vancomycin behandelt.

Infektionen wurden als schwerwiegend definiert, wenn mehr als 2 sekundäre Organversagen im Rahmen der Infektion auftraten. Zu den genannten Organversagen zählten akutes Nierenversagen (ANV), akutes respiratorisches Versagen (ARV), akutes Leberversagen, disseminierte intravasale Koagulation (DIC), Sepsis, systemic inflammatory response syndrom (SIRS), neurologische Auffälligkeiten, Notwendigkeit von Katecholaminen und eine akute oder chronische Abstoßung.


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2.2.6. Diagnose und Therapie von Abstoßungen

Die Diagnose akute Abstoßung wurde anhand von klinischen Befunden, Laborparametern und einer bei Verdacht auf Abstoßung durchgeführten Biopsie gestellt (siehe Tab. 6). Als klinische Befunde dienten Fieber, Änderung der Gallefarbe oder -menge. Laborparameter, die zur Diagnostik der Abstoßung herangezogen wurden, waren Glutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT), Glutamat-Oxalazetat-Transaminase (GOT), Gamma-Glutamyl-Transferase (gamma-GT), Alkalische Phosphatase (AP) und Bilirubin.

Patienten mit mononukleärer Infiltration der Biopsie ohne Bilirubin- oder Transaminasenanstieg wurden nicht als akute Abstoßung interpretiert und nicht als solche therapiert.

Tab. 6: Einteilung der Abstoßungen (aus: 5)

Grad

Histologisches Korrelat

0

kein Anhalt für eine Abstoßung

I

geringe periportale mononukleäre Infiltrate, geringe Endothelitis, geringe Gallengangsverletzung, keine Leberzellnekrosen

II

moderate periportale mononukleäre Infiltrate, die die Membran des Periportalfelds überschreiten, begrenzte Endothelitis, begrenzte Gallengangsverletzung, Einzelzellnekrosen der Hepatozyten

III

weitergehende Veränderungen als II und konfluierende Leberzellnekrosen

Akute Abstoßungen wurden mit Methylprednisolon 500 mg/d i.v. für 3 Tage behandelt. Akute Abstoßungen, die auf diese Therapie nicht ansprachen (= steroid-resistent) oder schwere wiederkehrende Abstoßungen, wurden mit einer Umstellung der Immunsuppression auf FK506 (FK506 Rescue, 0,1-0,2 mg/kg KG/d p.o.) behandelt (17 - 21). Bei einigen Patienten, die klinisch eine besonders schwerwiegende Abstoßung hatten, wurde eine simultane Behandlung mit FK506 und monoklonalen Antikörpern OKT3 (Orthoclone, Cilag GmbH, Sulzbach, Deutschland) (5 mg/d als Bolus für 7 Tage) notwendig (83).


21

Abb. 4 : Schema der Therapie von akuten Abstoßungen

Eine chronische Abstoßung wurde definiert als obliterative Vaskulopathie mit Verlust von Gallengängen und machte eine Hochdosis-FK506-Rescue Therapie notwendig (36, 84 - 86).


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Tab. 7: Histologische Kriterien der chronischen Abstoßung (aus : 30)

 

Früh

Spät

Portal Felder    
Gallengangs-Schädigung +++ ±
Gallengangs-Verlust ± +++
Entzündung    
Chronische Entzündungs-Infiltrate +++

±

Gefäß-Läsionen    
Arterielle Schaumzellen ±

+++

Venöse Endothelitis ++

±

Parenchym    
Cholestase ++

+++

Hepatozyten-Nekrose +

++

2.3. Material

2.3.1. Materialgewinnung und Zeitpunkte

Die Blutabnahmen erfolgten präoperativ, intraoperativ und postoperativ zu folgenden Zeitpunkten: präoperativ bei Spender und Empfänger, bei Operationsbeginn, vor der Hepatektomie, zum Zeitpunkt der Reperfusion, 15 Minuten, 120 Minuten, 6 Stunden, 12 Stunden, 18 Stunden, 24 Stunden, 36 Stunden, 48 Stunden und 72 Stunden nach Reperfusion. Anschließend wurde an jedem Tag, den der Patient auf der Transplantationsintensivstation verbrachte (in der Regel 14 Tage nach Transplantation), einmal täglich Blut aus einer peripheren Vene für unsere Studie abgenommen.

Zusätzlich wurde bei den Patienten ein Oxymetrie-Katheter (Bexter, Deutschland) über die rechte Vena jugularis externa in die rechte Lebervene (= lebervenöser Katheter (LVK)) eingebracht. Dieser wurde vor der Hepatektomie in die Vena cava inferior zurückgezogen, um bei der Reperfusion wieder in die Lebervene vorgeschoben zu werden. Über diesen Katheter, der in der Regel bis 48 Stunden nach Reperfusion in der Lebervene verblieb, haben wir zusätzlich, zu den gleichen Zeitpunkten wie oben beschrieben, Material gewonnen.

Zum Zeitpunkt der Reperfusion wurde durch den LVK ein Teil des venösen Rückstroms aus der infrahepatischen Vena cava inferior gewonnen. Diesen Zeitpunkt bezeichneten wir als ´Flush´.


23

2.3.2. Konservierung und Messung der Blutproben

Das heparinisierte Blut wurde nach der Entnahme sofort mit Eis gekühlt und innerhalb von 30 Minuten nach Entnahme 10 Minuten zentrifugiert. Bis zum Zeitpunkt der Messung wurde das so gewonnene Plasma in Aliquots zu 250 µl bei -70oC gekühlt gelagert. Die Hyaluronsäure (HA) wurde mit einem Radio-Immun-Assay (RIA) (Kabi Pharmacia, Uppsala, Schweden) gemessen.

Das Prinzip dieses Assays beruht auf spezifischen 125I-markierten Hyaluronsäure bindenden Proteinen (HABP) aus Rinderknorpeln. Die Hyaluronsäure der Probe bindet an die HABP. Die ungebundenen HABP werden an Hyaluronsäure, die an Sepharose gekoppelt ist, gebunden.

Nach Zentrifugieren der Lösung wird die an HABP gebundene Hyaluronsäure der Serum-Probe dekantiert, während die an Sepharose gekoppelte Hyaluronsäure und die von ihr gebundenen radioaktiv-markierten HABP im Reagenzglas verblieben. Die Radioaktivität wird dann im Gammazähler gemessen und ist umgekehrt proportional zur Hyaluronsäurekonzentration in der Probe (87).

Proben, die oberhalb des Meßbereichs von 500 µg HA/l lagen, wurden mit dem 0-Standart verdünnt und erneut gemessen.

Gesunde Probanden (n=41) im Alter von 21 bis 55 Jahren wurden zum Vergleich mitgemessen. Bei den Probanden ergab sich ein durchschnittlicher Hyaluronsäurespiegel im Plasma von 19,4 ± 2,5 µg/l.

2.4. Statistische Methoden

Die aus den Krankenakten erhobenen Daten und die Laborergebnisse wurden in das Computer-Datenbank-Programm Microsoft-Access (Microsoft, Redmond, USA) eingegeben. Danach fand die Auswertung mit Statistica (Statsoft, Tulsa, USA) statt.

Kaplan Meier Analysen, Wilcoxon, Chi-Quadrat (\|[khgr ]\|2) und Kruskal-Wallis Tests und Varianz-Analysen (One-Way-ANOVA und Multivarianz-Analyse) wurden ihrer Funktion nach eingesetzt. Lineare Regressionsanalysen wurden verwendet, um herauszufinden, ob die Veränderungen der Hyaluronsäure mit der Inzidenz und Schwere von frühen postoperativen Infektionen und Abstoßungen korrelierten und ob


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die Hyaluronsäure-Konzentrationen mit dem Überleben nach Infektion korrelierten. Multivarianzanalysen wurden durchgeführt zur Untersuchung des Einflusses der jeweiligen Parameter, sowie der Abgrenzung von schweren Infektionen und Abstoßungen. Alle Ergebnisse sind als Mittelwert (

) ± Standardfehler des Mittelwerts bei einem Signifikanzniveau von p le 0,05 angegeben.


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