Geil, Dominik: Thema: ”Charakterisierung der Ca2+-Transportaktivität des sarkoplasmatischen Retikulums nach experimentellem Myokardinfarkt“

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Kapitel 1. Einleitung

1.1. Herzinsuffizienz als eine Folge von koronarer Herzerkrankung und Myokardinfarkt beim Menschen

Nach wie vor stehen Herz-Kreislauf Erkrankungen in den westlichen Industrieländern als Todesursachen an erster Stelle (87) . Einen nicht unerheblichen Anteil daran stellen Patienten mit der Diagnose Herzinsuffizienz. Unter Herzinsuffizienz versteht man laut Pschyrembel (76) eine ”...unzureichende Funktion des Herzens. Das Herz ist nicht imstande, eine den Anforderungen entsprechende Förderleistung zu erbringen.“ Anders ausgedrückt handelt es sich um ein klinisches Bild, bei dem das venöse Blutangebot nicht ausreichend bis in die Peripherie gepumpt werden kann (18) . Die häufigste Ursache für die Herzinsuffizienz ist heutzutage die koronare Herzerkrankung und hier insbesondere der Myokardinfarkt (25) . An zweiter Stelle folgt die dilatative Kardiomyopathie (41) . Erst danach kommen Hypertonie, Vitien und Myokarditis als Primärkrankheit in Betracht (71) . Seltener führen auch verschiedene extrakardiale Ursachen zur Herzinsuffizienz. Ein verminderter O2-Transport bei Anämie ist z.B. als Grund bekannt. Die Koronarinsuffizienz kann vor allem durch Minderperfusion des Myokards zur Kontraktionsschwäche führen, während der Herzinfarkt direkt vitales Gewebe unwiederbringlich zerstört. Das überlebende Myokard muß das verlorene Gewebe funktionell ersetzen. Gerade bei größeren Infarkten geschieht dies unzureichend, so daß die Entwicklung einer Herzschwäche begünstigt wird. Meist geht der Entwicklung einer Herzinsuffizienz, aufgrund einer koronaren Herzerkrankung, eine Latenzzeit von mehreren Monaten bis Jahren voraus.

Die Herzinsuffizienz tritt vor allem im höheren Lebensalter auf. Die Inzidenz beträgt 3/1000/Jahr bei 35-64jährigen und 10/1000/Jahr in der Altersgruppe von 65-94 Jahren. Die Mortalität steigt bei 75jährigen fast um den Faktor 200 gegenüber der Altersgruppe zwischen 35 und 44 Jahren (31) . Die Mortalitätsrate ist zwischen 1970 und 1983 annähernd konstant geblieben und beträgt bei Männern 8/106 und bei Frauen 5/106 pro Jahr, wie Untersuchungen in den USA ergaben (31) . Für die Bundesrepublik sind gleiche Zahlen anzunehmen (71) . Mehr als 50% der Patienten versterben in den ersten fünf Jahren nach Diagnosestellung (25) ; (44) . Nach der New York Heart Association (NYHA) wird die Herzinsuffizienz in vier Schweregrade eingeteilt (NYHA I-IV). Patienten, die zur Klasse I und II gezählt werden, klagen über nur geringe Belastungsintoleranz. Diese nimmt bis zum Stadium IV zu, wobei hier Beschwerden


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schon in Ruhe auftreten. Die Prognose für Erkrankte mit NYHA III bzw. IV ist durch das Auftreten einer Vielzahl von Komplikationen (Rhythmusstörungen, Lungenödem, kardiogener Schock, Thrombosen) schlecht. Welche pathophysiologischen Mechanismen für die Entwicklung einer Herzinsuffizienz verantwortlich sind, werden im nun folgenden Kapitel dargestellt.

1.2. Pathophysiologie der Herzarbeit

Die Pumpleistung des Herzens ist im wesentlichen von drei Faktoren abhängig:

  1. Inotropie: Darunter wird die Kraft und Geschwindigkeit der Muskelfaserverkürzung des Herzens verstanden. Ein geeigneter klinisch meßbarer Parameter zur Bestimmung der Kontraktilität ist die maximale Druckanstiegsgeschwindigkeit (+dP/dtmax). Die maximale Druckabfallgeschwindigkeit (-dP/dtmin) charakterisiert die Lusitropie des Myokards. Eine adäquate und vollständige Relaxation des Herzens ist nötig, um eine ausreichende diastolische Füllung der Herzkammern und eine effiziente Koronardurchblutung zu ermöglichen.
    Die Kontraktionskraft kann durch den Frank-Starling-Mechanismus gesteigert werden, indem die Kammer durch zunehmende Vorlast (Preload), also ein gesteigertes enddiastolisches Ventrikelvolumen vorgedehnt wird. Dadurch nimmt das Schlagvolumen zu. Sowohl inotroper Zustand als auch Frank-Starling-Mechanismus sind die entscheidenden Determinanten für die Größe des Schlagvolumens (SV).
  2. Die Größe des SV hängt außerdem von der sogenannten Nachlast (Afterload) ab. Sie repräsentiert die maximale systolische Wandspannung des Ventrikels und ist vom Auswurfwiderstand abhängig. Die Nachlast wird im wesentlichen vom arteriellen Blutdruck bestimmt. Der Systemdruck wiederum wird u.a. vom peripheren Widerstand beeinlußt.
  3. Das Herzzeitvolumen ist das Produkt aus SV und Herzfrequenz (HF). Deshalb kann der chronotrope Zustand des Myokards ganz entscheidend zur Pumpleistung des Herzens beitragen.

Bei der Herzinsuffizienz vermindert sich die Zahl der funktionsfähigen Herzmuskelzellen (7) . Die Kontraktilität der verbliebenen Kardiomyozyten sinkt und dadurch fällt das maximal erreichbare Herzminutenvolumen ab. Ein erforderliches SV läßt sich nur noch mit einer Erhöhung des linksventrikulären enddiastolischen Drucks (LVEDP) erreichen. Aufgrund der hohen Plastizität des Myokards entwickelt sich zuerst eine kompensatorische myokardiale


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Hypertrophie, welche die zuvor erhöhte Wandspannung wieder in den Normbereich zurückführen kann (10) . Auf molekularer Ebene kommt es dabei zu einer Aktivierung von verschiedenen Genen und einem veränderten molekularen Phänotyp der hypertrophen Kardiomyozyten (14) .

Ein anderer Kompensationsmechanismus wird über eine verstärkte ß-adrenerge Stimulation erreicht. Die Folge sind eine Zunahme von Inotropie, Chronotropie und Lusitropie (51) . Neben der direkten Kurzzeitwirkung der Katecholamine bei gesteigertem sympathischen Tonus, sind diese Substanzen wichtige Mediatoren des hypertrophen Wachstums (86) . Bei anhaltender Sympathikusaktivierung über die physiologische Ebene hinaus, erfolgt eine Desensibilisierung (Downregulation) von ß-Rezeptoren am Herzen (24) . Gleichzeitig steigert die Katecholaminausschüttung den Arteriolentonus, in dessen Folge eine Erhöhung der Nachlast auftritt. Reichen die Möglichkeiten des Organismus nicht aus, eine suffiziente Anpassung zu erreichen, kommt es zum Herzversagen.

1.3. Tiermodell zur Untersuchung chronischer Veränderungen nach Myokardinfarkt

Tiermodelle sind zur Untersuchung von physiologischen und pathologischen Veränderungen geeignet, die im Rahmen verschiedenster Erkrankungen auftreten können. In der Regel verbieten ethisch-moralische Gründe solche Studien am Menschen durchzuführen. Darüber hinaus bietet das Tiermodell durch eine ausgeprägte Homogenität eine bessere Vergleichbarkeit der Ergebnisse. Die Laborratte ist das kreislaufphysiologisch am besten charakterisierte Versuchstier. Sie wurde bereits mehrfach als geeignetes Modell für die Entwicklung einer Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz nach Myokardinfarkt (MI) untersucht (72) ; (16) ; (53) ; (104) ; (4) ; (5) ; (80) . Durch Unterbindung der linken Herzkranzarterie entsteht ein akuter MI. In der Regel kommt es zur Induktion transmuraler Infarkte. Die Letalität bei diesen Versuchen beträgt je nach Verfahren bis zu 50%. Das infarzierte linksventrikuläre Gewebe wird innerhalb weniger Wochen über eine Koagulationsnekrose in Narbengewebe umgewandelt. Um aber ein bestimmtes Herzminutenvolumen aufrechtzuerhalten, muß sich das überlebende Restgewebe an den funktionellen Wegfall der vernarbten Region anpassen. Das betrifft nicht nur die Herzmuskelzellen, sondern in gleicher Weise das Nicht-Myozytenkompartiment. Dazu gehören Blut- und Lymphgefäße, die amorphe Interzellularsubstanz, Fibroblasten, Makrophagen, Leukozyten, Kollagen und andere extrazelluläre Matrixproteine (11) . Dieser Prozeß wird als


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”Remodeling“ (Umbau) bezeichnet. Die Aktivierung verschiedenster Wachstumsfaktoren endokriner, parakriner oder neurohormonaler Art erzeugt eine veränderte Genexpression und Proteinsynthese. Dadurch entwickelt sich eine zelluläre Hypertrophie der Kardiomyozyten und Proliferation anderer Zellen. Wesentlich beteiligt sind das Renin-Angiotensin-System (99) , Katecholamine und eine Vielzahl anderer Wachstumsfaktoren. Dazu gehören das Wachstumshormon (GH) und der IGF-1 (Insulin-like Growth Factor-1), deren hypertrophe Wirkungen in vitro nachgewiesen werden konnten (21) . Eine Vielzahl von anderen vermuteten Stimuli und die zugrunde liegenden Wirkmechanismen sind bei weitem noch nicht aufgeklärt. Interessant ist, daß sich während des ”Remodeling“ der Gehalt sowohl an kollagenen, als auch an nicht-kollagenen Proteinen im überlebenden Myokard signifikant erhöht (72) . Bei der Ratte kommt es zu einer typischen Verschiebung des Isomyosinmusters von V1 mit hoher ATPase-Aktivität nach V3 mit niedriger ATPase-Aktivität. Ursache ist eine verstärkte Expression des schweren Myosinketten (MHC)-ß-Gens, während die Expression des alpha-MCH-Gens vermindert ist (61) . Für das menschliche Herzen ist diese Verschiebung irrelevant, da ausschließlich ß-MHC exprimiert wird (82) . Proteine des Energiestoffwechsels und der kardialen Ca2+-Regulation sind ebenfalls betroffen (siehe Kap. 1.5 ).

Bei ausgedehnten Infarkten kann sich das Volumen der überlebenden Myozyten nahezu verdoppeln (104) . Ein wesentlicher Einflußfaktor für die Entwicklung einer Hypertrophie des Herzens ist die Größe des infarzierten Gewebes (29) und damit der Verlust funktionellen Myokards. Untersuchungen haben ergeben, daß es bei Infarktarealen um 20% zu sehr gering ausgeprägter Hypertrophie kommt (80) . Mit zunehmender Infarktgröße nimmt das Ausmaß der Hypertrophie zu. Ein Maß hierfür ist das absolute und relative links- und rechtsventrikuläre Herzgewicht (relatives Herzgewicht ist gleich dem Quotienten aus Herzgewicht und Körpergewicht). Anversa und Mitarbeiter zeigten, daß es sich bei der Hypertrophie nach MI um die Kombination aus konzentrischem und exzentrischem Wachstum des Herzens handelt (6) . Die Hypertrophie erfaßt nicht nur das überlebende Gewebe des linken Ventrikel, sondern in gleicher Weise auch die rechte Herzkammer (94) , was dafür spricht, daß neben mechanischen Einflüssen auch die Stimulation durch zirkulierende Wachstumsfaktoren eine entscheidende Rolle spielt. Infolge der rechtsventrikulären Hypertrophie erzeugt die Muskulatur einen höheren Druck in der rechten Herzkammer. Es kann zur Ausbildung einer pulmonalen Hypertonie kommen (74) .

Bei ausgedehnten Infarkten des Gewebes kann eine inadäquate Hypertrophie des Myokards entstehen, gefolgt von einem Anstieg der diastolischen Wandspannung. Bei der nachfolgenden


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progressiven linksventrikulären Dilatation (68) ; (75) ist der Ventrikel nicht länger in der Lage, das ihm angebotene Blut in ausreichendem Maße auszuwerfen. Rückstau in das venöse System und unzureichende Versorgung der Peripherie schließen sich an. Es entwickelt sich das klinische Bild einer Herzinsuffizienz. Interventionen zur Induktion eines adäquaten ”Remodeling“ nach Myokardinfarkt sollten deshalb ein geeigneter Ansatz sein, um der Entwicklung einer Herzinsuffizienz entgegenzuwirken. Dies ist u.a. über einen Eingriff in Stoffwechselvorgänge möglich. Eine interessante neue Intervention sind pharmakologische Eingriffe in die Substratoxidation von Fettsäuren (FS) und Glukose, die über hypothetische ”metabolische Signale“ das ”Remodeling“ des Herzmuskels günstig zu beeinflussen scheinen (siehe Kap. 4.7 ). Das in vorliegender Studie zum Einsatz gekommene Etomoxir (siehe Kap. 4.8 ) hemmt die Carnitin-Palmitoyltransferase-1 (CPT-1). Dieses Enzym ist an der Mitochondrienmembran lokalisiert und katalysiert die Aufnahme langkettiger Fettsäuren in die Mitochondrien, wo sie zur Energiegewinnung herangezogen werden.

1.4. Ca2+-Homöostase und Funktion des sarkoplasmatischen Retikulums (SR)

Der Herzmuskel besteht aus einem Verbund einer Vielzahl von einzelnen Myozyten, die ein funktionelles Synzytium bilden. Im normalen Herzzyklus werden im Sinusknoten Aktionspotentiale (AP) generiert und auf alle Muskelzellen übergeleitet. Als Folge der Erregung kommt es unter anderem zu einer Öffnung von spannungsabhängigen L-Typ Ca2+-Kanälen im Sarkolemm, was den Einstrom dieses Ions in das Zytoplasma der Zelle ermöglicht ( Abb. 1 ). Daneben existieren in viel geringerer Anzahl sog. T-Typ Kanäle, die sich elektrophysiologisch und pharmakologisch von den L-Typ Kanälen unterscheiden (35) . Der überwiegende Teil des einströmenden Ca2+ gelangt über den L-Typ Kanal in die Zelle. Hier triggern die Ca2+-Ionen die Ca2+-Freisetzung aus dem sarkoplasmatischen Retikulum (SR), einer Zellorganelle von zentraler Bedeutung für die Ca2+-Homöostase in der Herzmuskelzelle (26) . Strukturell besteht das SR aus drei unterschiedlichen Komponenten: (1) dem longitudinalen Anteil, der von einem Tubulus-Netzwerk gebildet wird und die Myofibrillen umgibt; (2) dem transversalen SR, aufgebaut aus Zisternen, die an die T-Tubuli gekoppelt sind und sogenannte Diaden bzw. Triaden bilden; (3) einem speziellen nicht-junktionalen SR, das die Verlängerung des longitudinalen SR ohne Verbindung zum Sarkolemm oder den T-Tubuli darstellt (42) .


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Abb. 1: Schema der Ca2+-Bewegungen in einer Herzmuskelzelle
PKA, cAMP-abhängige Proteinkinase; Ca2+/CAM-PK, Ca2+-Calmodulin abhängige Proteinkinase; SR, sarkoplasmatisches Retikulum; SERCA2a, sarko(endo)plasmatische Retikulum Ca2+-ATPase Isoform 2a; PLB, Phospholamban; P, Phosphorylierung; NCX, sarkolemmaler Na+/Ca2+-Austauscher; PMCA, Plasmamembran Ca2+-ATPase

Durch die Ca2+-getriggerte Ca2+-Freisetzung aus dem SR steigt die Ca2+-Konzentration in kürzester Zeit um ca. zwei Zehnerpotenzen an. Ca2+-Ionen ändern die Konformation des Troponinmoleküls, wodurch Bindungsplätze für Myosin am Aktin freiwerden und sich die beiden kontraktilen Proteine miteinander vernetzen können (Myofibrillen, Abb. 1 ). Dies führt letztendlich zur Verkürzung und Kraftentwicklung jeder einzelnen Herzmuskelzelle und im Verband zur Kontraktion des Herzmuskels und zum Auswurf des Schlagvolumens. Um eine adäquate diastolische Füllung der Ventrikel zu ermöglichen, muß das Kammermyokard erschlaffen. Auf molekularer Ebene ist dafür die Inaktivierung der Aktin-Myosin Interaktion erforderlich. Diese setzt ein, wenn der Ca2+-Troponinkomplex infolge einer gesunkenen intrazellulären Ca2+- Konzentration [Ca2+]i dissoziert. Für eine schnelle [Ca2+]i-Senkung ist insbesondere die schnelle Rückbindung des zytosolischen Ca2+ in das Lumen des SR verantwortlich. Untersuchungen an isolierten Kardiomyozyten von Kaninchen und Ratte haben


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gezeigt, daß 80-90 % des Ca2+ auf diesem Wege aus dem Zytoplasma entfernt werden (8) . Der verbleibende Anteil wird zum einen von dem sarkolemmalen Na+/Ca++ -Austauscher (NCX) zum anderen von der Plasmamembran Ca2+-ATPase (PMCA) aus der Zelle gepumpt. Für die langfristige Pufferung der [Ca2+]i sind außerdem Ca2+-Bewegungen in die Mitochondrien von Bedeutung (12) .

Der Transport in das SR erfolgt unter Katalyse einer membranständigen Ca2+-abhängigen Mg2+-ATPase (34) ; (22) . Sie wird auch als sarko(endo)plasmatische Retikulum Ca2+ATPase (SERCA) bezeichnet. Unterschieden werden fünf Isoformen, kodiert von drei verschiedenen Genen. Das SERCA1- und SERCA2-Gen kodieren jeweils für zwei alternativ gespleißte Transkripte. Der Untertyp 2a ist derjenige, welcher im Herzen, sowie im undifferenzierten weißen und im roten Skelettmuskel exprimiert wird (3) . Das Molekulargewicht dieses großen Polypeptids beträgt 110 kDa und repräsentiert über 40 % des Totalproteins im kardialen SR (89) . Durch ATP-Hydrolyse wird der Konformationszustand des Transporters verändert und jeweils zwei Ca2+-Ionen von der zytosolischen Seite mit hoher Affinität zu der SR-luminalen Seite mit niedriger Affinität für Ca2+ transportiert (Übersichtsarbeit in (39) ). SERCA2a ist vor allem im SR-Netzwerk rund um die Myofibrillen lokalisiert, weniger dagegen im transversalen Anteil. Nach Hydropathieanalyse besteht die Ca2+-ATPase aus zehn transmembranären Helices und mehreren extramembranären Schleifen (59) ; (9) ( Abb. 2 ). Ein ”Scharnier“ (Hinge-Region) ermöglicht die freie Beweglichkeit der extramembranären Schleifen. An der zytosolischen Seite sind Domänen für die Ca2+- und ATP-Bindung, für Phosphorylierung und Wechselwirkung mit dem Modulatorprotein Phospholamban (PLB) ausgebildet (59) . Letzteres ist in der longitudinalen SR-Membran lokalisiert und hat im unphosphorylierten Zustand einen inhibitorischen Einfluß auf die Ca2+-ATPase (36) . Erst durch Phosphorylierung von Phospholamban wird die Ca2+-Affinität der SERCA2a erhöht, und damit die Transportrate für Ca2+ in das SR gesteigert (90) . Die Phosphorylierung erfolgt durch die cAMP-abhängige Proteinkinase A (PKA), die funktionell am bedeutendsten ist. Das Protein kann auch über die Ca2+/Calmodulin-abhängige Proteinkinase (Ca/CAM-PK) ( Abb. 1 ) und in geringem Maße durch Proteinkinase C, sowie einer cGMP-abhängigen Proteinkinase phosphoryliert werden (77) ; (48) ; (88) ; (45) . Die Phosphorylierung des 52 Aminosäuren-Proteins erfolgt an zwei Aminosäureresten. Serin-16 wird durch cAMP-abhängige Proteinkinase und Threonin an Position 17 durch Ca2+/Calmodulin-abhängige Kinase phosphoryliert (85) .


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Abb. 2: Schematische Darstellung der vorgeschlagenen Sekundärstruktur der SR Ca2+-ATPase
Erläuterungen siehe Text. Modifiziert entnommen aus (59)

1.5. Funktion des sarkoplasmatischen Retikulums bei Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz

Durch eine kompensatorische Hypertrophie des überlebenden Myokards nach Infarkt kann vorübergehend die Kontraktilität und damit die Auswurfleistung des Herzens verbessert werden. Letztlich führt das ventrikuläre ”Remodeling“ jedoch bei großem Gewebeverlust zu einer vorwiegend exzentrischen Massenzunahme (Volumenbelastung), zur Dilatation der Kammer und zum Linksherzversagen (51) . Erschwerend kommt hinzu, daß insuffiziente Herzen einem verstärkten Sympathikotonus ausgesetzt sind. Dies führt zu erhöhter Herzfrequenz und damit zu einer Abnahme sowohl der Systolen- als auch Diastolendauer, was sich negativ auf eine ökonomische Arbeit des Herzens auswirkt. Darüber hinaus steigt der O2-


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Verbrauch bei zunehmender Frequenz an, so daß die Minderversorgung von ischämisch vorgeschädigten Arealen zusätzlich verschlechtert wird.

Verschiedene Veränderungen auf molekularer Ebene, wie Störungen des kontraktilen Apparats, Beeinträchtigungen der Mitochondrien und des Energiestoffwechsels, werden durch Aktivierung von Wachstumsfaktoren ausgelöst. Ein wichtiges Kennzeichen ist dabei eine gestörte Ca2+-Homöostase der Myozyten. Sie ist in entscheidendem Maße für diastolische und systolische Funktionsstörungen in hypertrophierten und insuffizienten Herzen verantwortlich (13) ; (63) . Es lassen sich erhöhte diastolische Ca2+-Spiegel bei experimenteller Überlasthypertrophie und an insuffizienten Herzen nachweisen. Die rhythmischen Ca2+-Transienten, also die intrazellulären Ca2+-Konzentrationen im zeitlichen Verlauf betrachtet, sind verlängert (33) ; (32) ; (73) . Ein diastolisch erhöhter Ca2+-Spiegel bedeutet, daß sich das Myokard nicht adäquat relaxieren kann, die Füllung der Ventrikel demnach verzögert abläuft und zusätzlich die Perfusion des Myokards erschwert ist. Verantwortlich für die gesteigerte Ca2+-Konzentration in der Diastole ist eine verminderte Rückbindung von Ca2+ in das SR; die unzureichende Transportleistung der SERCA2a spielt dabei eine zentrale Rolle. Die Folge davon ist ein verringerter Ca2+-Gehalt im SR. Da die Ca2+-Ionen aber für die Aktivierung des kontraktilen Apparats unerläßlich sind, erklärt sich, warum zusätzlich zu diastolischen auch systolische Funktionsstörungen auftreten können. Wie Untersuchungen an drucküberlasteten hypertrophierten Herzen zeigten, wird die SERCA2a gemessen an den Erfordernissen nicht ausreichend exprimiert. Drucküberlast und anschließende Hypertrophie wurde durch Aorten- bzw. Pulmonalarterienligatur induziert. Es liegt also keine Schädigung des Transportmoleküls vor, vielmehr ist die Konzentration von Ca2+-ATPase-Molekülen an der SR-Membran verringert. Der Mechanismus, der zu verminderter SERCA2a-Expression führt, ist vermutlich mit einer verminderten Aktivierung des Gens verbunden, welches für die SERCA2a kodiert. Dies läßt sich anhand verminderter mRNA-Spiegel postulieren (15) ; (65) . Feldman und Mitarbeiter nehmen an, daß der Abfall des Ca2+-ATPasen-mRNA-Spiegels ein Marker für den Übergang von kompensierter Hypertrophie zur Insuffizienz darstellt. Diese Vermutung stützt sich auf Befunde, bei denen lediglich bei Tieren mit Zeichen einer Dekompensation der mRNA-Spiegel verringert war (27) . Neben der SERCA2a ist im Modell der drucküberlasteten Herzen auch Phospholamban (65) und die Ca2+-Freisetzungskanäle am SR (66) vermindert. Letztere Befunde im Zusammenhang mit verminderten SERCA2a-mRNA-Spiegeln gesehen, lassen an einen relativen Verlust von SR-Membranen in hypertrophierten Herzen denken (54) .


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Erste Befunde zu Veränderungen der Ca2+-Transportfunktion des SR bei experimenteller Herzinsuffizienz nach Myokardinfarkt kommen aus dem Labor von Naranjan S. Dhalla (2) . Die SR Ca2+-Transportfunktion in rechts- und linksventrikulären Membranpräparationen von Ratten vier, acht und sechzehn Wochen nach Infarkt war im linken Ventrikel zu allen Zeitpunkten signifikant vermindert. Das SR der rechten Herzkammer zeigte dagegen eine Steigerung der Ca2+-Aufnahme bei den Tieren vier und acht Wochen nach Infarkt und einen Abfall der Transportfunktion nach sechzehn Wochen auf Kontrollwerte. Diese Befunde lassen vermuten, daß der linke Ventrikel in einem insuffizienten Stadium, der rechte Ventrikel zumindest zu diesem Zeitpunkt noch kompensiert ist. Gestützt wurden die Befunde von einer anderen Untersuchung, in welcher parallel der linksventrikuläre SERCA2a-mRNA- und Proteinspiegel quantifiziert wurden. Vermindertes Ca2+-ATPase-Protein korrelierte mit abgesunkenen mRNA-Werten (102) .

Im gleichen Tiermodell ist ein deutlicher Abfall der sarkolemmalen NCX-Aktivität nachgewiesen worden (20) . Im gesunden Herzen ist dieser Kationen-Transporter entscheidend für den diastolischen Ca2+-Auswärtstransport. Offensichtlich gehört die veränderte Expression verschiedener Gene der kardialen Ca2+-Regulation zum Phänotyp des hypertrophierten Myokards nach überlebtem Myokardinfarkt. Somit wird verständlich, daß eine Verminderung der NCX-Aktivität an einer gestörten Ca2+-Homöostase und an systolischen und diastolischen Funktionsstörungen beteiligt ist.

Vergleichbare Ergebnisse ließen sich auch beim menschlichen Herzen feststellen. Einschränkend muß allerdings gesagt werden, daß Befunde am Humanmyokard größeren individuellen Schwankungen unterworfen sind. Die Patienten haben häufig koexistente Stimuli für die Entwicklung einer Herzhypertrophie, wie z.B. arteriellen Hypertonus oder Klappendysfunktionen (80) . Außerdem gelangen fast nur Herzproben von terminal insuffizienten Patienten (NYHA IV) zur Untersuchung, die zusätzlich mit verschiedensten herzwirksamen Medikamenten therapiert worden sind. Im Vergleich von insuffizienten Herzen bei ischämischer Kardiomyopathie und nicht-insuffizienten Herzen ergab sich allgemein ein erniedrigter Spiegel der SERCA2a-mRNA (83) ; (33) ; (92) ; (62) . Dagegen waren die Ergebnisse bei der Untersuchung der SERCA2a Proteinspiegel nicht eindeutig.

Zusammenfassend ist festzustellen, daß es durch die Induktion eines Myokardinfarktes im Tiermodell zuerst zu einer kompensatorischen Hypertrophie des überlebenden Myokards kommt, die mit veränderter Expression und Funktion von Ca2+-Transportproteinen einhergeht.


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Ein Abfall der SERCA2a Expression ist vermutlich Folge einer verminderten Aktivierung des SERCA2a-Gens. Im Gegensatz dazu ist die Expression einer großen Anzahl anderer Gene unter dem Einfluß verschiedener Wachstumsfaktoren gesteigert. Qualitativ zeichnet sich diese durch die Reexpression von fötalen Genprogrammen aus, quantitativ als Zunahme der linken und rechten Ventrikelmasse (95) . Warum unter diesen Bedingungen eine Aktivierung der Expression des SERCA2a-Gens ausbleibt, und welche möglichen Faktoren daran beteiligt sind, ist nach wie vor nicht geklärt. Sicher ist aber, daß es zu keiner Expression anderer SERCA-Isoformen kommt (65) .

1.6. Substratoxidation im Herzmuskel

Der Herzmuskel kann sowohl freie Fettsäuren als auch Kohlenhydrate (KH) zur Energiegewinnung oxidieren. Von Fisher und Williamson wurde 1961 ein wichtiges generelles Prinzip entdeckt: Bei adäquater Koronarperfusion mit ausreichender Sauerstoff- und Substratversorgung konkurrieren die verschiedenen Substrate um O2 (28) . Randle und Mitarbeiter konnten 1963 nachweisen, daß die FS-Oxidation durch Glukoseangebot im Koronarperfusat zu Gunsten der Glukose-Oxidation vermindert wird (sog. Glukose-Fettsäure-Zyklus oder Randle-Zyklus) (78) . Umgekehrt gelang es Taegtmeyer und Mitarbeitern 1980 nachzuweisen, daß die Glukoseoxidation im Myokard durch das Angebot freier Fettsäuren reduziert werden kann (91) . Das gesunde Herz oxidiert vor allem FS, während die Glykolyse durch anfallendes ATP und Zitrat gehemmt wird. Im Falle einer milden Ischämie des Myokards resultiert eine Stimulierung der Glykolyse, die auf dem anaeroben Stoffwechselweg zur Synthese von Laktat führt (Pasteur-Effekt). Bei schweren Ischämien dagegen wird die Glykolyse durch einen stark angestiegenen Laktatspiegel und niedrigen pH-Wert gehemmt. Dadurch wird die Kapazität des Gewebes zum Überleben des ischämischen Insults limitiert (70) .

1.7. Fettsäureoxidation in der Herzmuskelzelle

Fettsäuren (es dominieren Öl- und Palmitinsäure) sind der wesentliche Energielieferant in der Herzmuskelzelle. Sie werden in die Mitochondrien transportiert und nach der ß-Oxidation dem Zitratzyklus zugeführt. Jeder Zyklus der ß-Oxidation schließt mit der Verkürzung der Fettsäure um zwei Kohlenstoffatome und der Bildung von NADH und FADH2 ab. Im Zitratzyklus entstehen dann pro Mol aktivierter Essigsäure 12 Mol ATP, 2 Mol CO2, 3 Mol


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NADH und 1 Mol FADH2. Die Abb. 3 zeigt die zentrale Rolle der Carnitin-Palmitoyltransferase-1 (CPT-1) bei der mitochondralen Oxidation von langkettigen Fettsäuren. Es werden zwei Formen dieses Enzyms unterschieden: CPT-1 und CPT-2. CPT-1 ist an der äußeren Mitochondrienmembran lokalisiert (64) . Es katalysiert die Kopplung von langkettigem Acyl-CoA an L-Carnitin (30) . In der Folge wird langkettiges Acylcarnitin gebildet. Erst dieses Produkt kann in die mitochondrale Matrix mit Hilfe der Carnitin-Acyltranslokase transportiert werden. Kurz- und mittelkettige Fettsäure gelangen dagegen passiv in die Mitochondrien. An der Innenseite der inneren Mitochondrienmembran befindet sich die CPT-2 (in der Abb. 3 nicht dargestellt). Dieses Enzym ist für die Umwandlung von Acylcarnitin in Acyl-CoA verantwortlich, das im Zitratzyklus zur Energiegewinnung verstoffwechselt wird. Ein geringer Anteil des Acetyl-CoA wird zu Acetylcarnitin konvertiert und gegen Carnitin durch die Carnitin-Acetyltranslokase aus den Mitochondrien herausgeschleust. Aus Acetylcarnitin entsteht zuerst Acetyl-CoA, katalysiert durch die Carnitin-Acetyltransferase und im nächsten Schritt Malonyl-CoA mit Hilfe der Malonyl-CoA-Carboxylase (beide Enzyme sind in der Abb. 3 nicht dargestellt). Malonyl-CoA ist der physiologische Hemmstoff der CPT-1. Somit existiert ein negativer Rückkopplungsmechanismus zwischen anfallendem mitochondralem Acetyl-CoA und der Aktivität der CPT-1. Durch Hemmung der CPT-1, sei es durch Malonyl-CoA oder durch synthetische Hemmstoffe wie Etomoxir (siehe Kap. 1.8 ), wird verstärkt Glukose utilisiert ( Abb. 3 ), (56) . Der Mechanismus, der dafür verantwortlich zeichnet, ist noch nicht gänzlich aufgeklärt. Klar ist, daß der Pyruvatdehydrogenasekomplex (PDK) in die Regulation eingebunden ist. Diese Enzym katalysiert die Umwandlung von Pyruvat als Abbauprodukt der Glykolyse. In einer mehrstufigen, als dehydrierende Decarboxylierung bezeichneten Reaktion, wird Acetyl-CoA synthetisiert. Dieses Produkt dient nun im Zitratzyklus zur Energiegewinnung.

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Abb. 3: Schema der Wechselwirkung zwischen Fettsäure- und Glukoseoxidation im Myokard
PDK, Pyruvatdehydrogenasekomplex. Modifiziert aus: (57)

Da im gesunden Herzen bevorzugt Fettsäuren mobilisiert werden, ist eine Hemmung der Kohlenhydrat-Utilisation auf der Ebene des Glukosetransports, der Phosphofruktokinase, der Hexokinase, der Glykogenphosporylase und Pyruvatdehydrogenase, genauso wie eine Stimulierung der Glykogensynthetase, anzunehmen (17) . Durch Unterbindung der FS-Oxidation durch CPT-1-Inhibition unterbleibt folglich diese Hemmung auf den KH-Stoffwechsel. In der vorliegenden Arbeit wurde dieser Effekt an chronisch infarzierten Rattenherzen untersucht, die sechs Wochen mit dem CPT-1-Hemmstoff Etomoxir behandelt worden sind. Durch die dauerhafte Verschiebung der myokardialen Substratoxidation von Fettsäuren nach Glukose sollten Einflüsse auf das überlebende Herzgewebe analysiert werden. Im folgenden Kapitel wird der CPT-1-Inhibitor Etomoxir mit seiner Wirkung eingehend beschrieben.


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1.8. Der Carnitin-Palmitoyl-Transferase-1-Hemmstoff Etomoxir

Etomoxir (Ethyl 2-[6-(4-chlorphenoxy)hexyl]oxiran-2-carboxylat) ( Abb. 4 ) ist ein Hemmstoff der mitochondralen Carnitin-Palmitoyl-Transferase-1.

Abb. 4: Strukturformel von Etomoxir

Andere spezifische Inhibitoren der CPT-1 sind in Tab. 1 dargestellt. Intrazellulär wird Etomoxir in seinen CoA-Ester umgewandelt und bindet kovalent an die CPT-1. Es ist 100-1000 Mal stärker wirksam als der physiologische Inhibitor der CPT-1 Malonyl (23) .

Tab. 1: Hemmstoffe der mitochondralen Carnitin-Palmitoyl-Transferase-1

Agens

Kurzform

Referenz

2-Tetradecylglyzidat

TDGA

(49)

Natrium-2[5-(4-Chlorphenyl)-pentyl]oxiran-2-carboxylat

POCA

(101)

Emeriamin

(43)

Natrium-4-Hydroxyphenylglyzin

Oxfenizin

(37)

Etomoxir ist ursprünglich für die Behandlung des Diabetes mellitus entwickelt worden, da dieser Stoff, wie in Kap. 0 beschrieben, die Glukoseutilisation steigert und gleichzeitig die Glukoneogenese hemmt (55) ; (23) . Darüberhinaus ist Etomoxir für eine günstige Beeinflussung der Substratoxidation bei ischämischen Erkrankungen des Herzens interessant geworden. Schon länger ist bekannt, daß sich nach einem akuten Myokardinfarkt toxische Substanzen des FS-Stoffwechsels im Herzen akkumulieren. Zwei dieser FS-Metaboliten


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sind unter anderem langkettiges Acyl-CoA und langkettiges Acylcarnitin (38) . Im Plasma läßt sich ein Anstieg der freien Fettsäuren feststellen (69) , die für die Größe des Infarktareals und die Mortalität verantwortlich gemacht werden (98) ; (67) . Der endogene langkettige Fettacylester Palmitoylcarnitin hemmt in höherer Konzentration die sarkolemmale Na+-K+ ATPase und die SR Ca2+-ATPasen-Aktivität, wie in vitro Versuche von Adams und Mitarbeitern ergaben (1) . Es kann daraus geschlossen werden, daß erhöhte Spiegel an Palmitoylcarnitin, das auch zu den nach MI verstärkt anfallemden Produkten gehört, Einfluß auf die Ca2+-Rückbindung in das SR nimmt.

Es gibt mehrere Ansatzmöglichkeiten, die Störungen im Lipidstoffwechsel nach Myokardischämie pharmakologisch zu beeinflussen. Zum einen kann dies durch eine Erniedrigung freier Fettäuren im Plasma erfolgen. Eine andere Möglichkeit liegt in der Reduktion der Nahrungsmittellipide oder auch in der Hemmung der endogenen Mobilisation von Fetten. Desweiteren kann die intrazelluläre Konzentration von Fettsäuren durch Inhibition von sarkolemmalen FS-Transportern erniedrigt werden (17) . Auch der PDK ist ein Angriffspunkt für Interventionen an der myokardialen Substratoxidation.

Welchen Effekt kann Etomoxir am ischämischen Herzen bewirken? In einer Studie wurde gezeigt, daß Etomoxir die myokardiale Funktion, ausgedrückt als Produkt aus Herzfrequenz und systolischem Spitzendruck, nach einer Ischämiephase am isolierten, mit Palmitinsäure und Glukose perfundierten Rattenherzen signifikant verbesserte (55) . In drucküberlasteten, hypertrophierten Herzen zeigten Rupp und Mitarbeiter unter Etomoxirbehandlung einen signifikanten Abfall der freien Fettsäuren im Plasma, eine Zunahme des relativen Herzgewichtes (Quotient aus Herz- und Körpergewicht) und eine Steigerung der kolorimetrisch gemessenen SR Ca2+-ATPase Aktivität (81) . Darüber hinaus wurde nachgewiesen, daß CPT-1-Inhibition bei Drucküberlast mit einem erhöhten mRNA-Spiegel der kardialen SR Ca2+-ATPase einhergeht (103) . Folglich scheint Etomoxir das für die SERCA2a kodierende Gen zu stimulieren oder die SERCA2a-mRNA zu stabilisieren.

Eine weitere Eigenschaft von Etomoxir ist die Induktion einer myokardialen Hypertrophie. Eine 5-wöchige Behandlung von Versuchratten mit hohen Dosen (12-15 mg/kg/d) dieser Substanz induzierte ein moderates biventrikuläres Myokardwachstum, das alle Kennzeichen einer physiologischen Hypertrophie aufwies (97) . Dieses Kennzeichen ist mehreren CPT-1-Hemmstoffen gemeinsam. Vorangegangene Studien bei Nagetieren ergaben eine deutliche Zunahme der Herzmasse bei Behandlung mit CPT-1-Inhibitoren (52) ; (50) ; (37) . Histologische


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Untersuchungen des nichtinfarzierten Gewebes zeigten einen Anstieg des Volumens der Herzmuskelzellen ohne Anzeichen einer Fibrose. Extravaskuläre Flüssigkeit oder Fetteinlagerung nahmen nur geringfügig zu (53) . Daher ist anzunehmen, daß die Hypertrophie des Herzens unter Etomoxirbehandlung vor allem durch eine gesteigerte Proteinsynthese bedingt ist. Auf molekularer Ebene ist in Etomoxir-behandelten Ratten eine Isomyosinverschiebung von V3 nach V1 nachgewiesen worden. Qualitativ ähnliche Effekte können z.B. auch durch Schilddrüsenhormone ausgelöst werden (96) . Die Arbeiten der Gruppen um Rupp und Vetter haben außerdem gezeigt, daß die Isomyosinverschiebung hin zu V1 mit erhöhter ATPase-Aktivität mit gesteigerter SR Ca2+-Transportaktivität korrelierte (97) . Deshalb wurden ein oder mehrere bisher nicht identifizierte metabolische Signale postuliert, die bei einer pharmakologisch induzierten Umschaltung der kardialen Substratoxidation von FS nach Glukose an der Expression zusätzlicher SR Ca2+-ATPasen beteiligt sein könnten.

Nach den vorausgegangenen Ausführungen läßt sich folgende Schlußfolgerung treffen:

Unter einer Behandlung mit Etomoxir nach MI kann erwartet werden, daß die kompensatorische Hypertrophie verstärkt wird und die Entwicklung einer eventuellen Herzinsuffizienz verzögert eintritt. Gleichzeitig soll durch die Inhibition der CPT-1 verstärkt Glukose oxidiert und so der toxische Einfluß der langkettigen Fettsäuren, die nach MI verstärkt anfallen, minimiert werden. Weiter wird vermutet, daß durch die Behandlung mit Etomoxir eine verstärkte Gen-Aktivierung der SERCA2a induziert wird, und es in der Folge zu einer verbesserten Ca2+-Homöostase in der Zelle kommt.

1.9. Aufgabenstellung

In der vorliegenden Arbeit sollte tierexperimentell untersucht werden, wie sich der Verschluß der linken Herzkranzarterie, also die Induktion eines Myokardinfarkts auf das hypertrophe Myokardwachstum auswirkte. Es ist bekannt, daß es nach einem MI über das Stadium einer kompensierten Hypertrophie zu einer zunehmenden Dysfunktion des Ventrikels und Ausbildung einer Herzinsuffizienz kommen kann (68) ; (75) ; (6) ). Da es bei Herzinfarkt zu drastischen Veränderungen der Substratoxidation kommt, wurde in erster Linie untersucht, welchen Einfluß eine pharmakologische Modulation der Glukose- und mitochondralen FS-Oxidation auf das ”Remodeling“ hat. Vorliegende Arbeit ist Teil einer Studie, die zwischen April und August 1996 am Universitätsklinikum Charité durchgeführt wurde. Dabei erfolgte die Untersuchung von Langzeitwirkungen von Angiotensin-Conversions-Enzym (ACE)-


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Hemmung, ß-Blockade und Inhibition der CPT-1 auf das überlebende Myokard nach MI. Vorliegende Arbeit enthält drei Versuchsgruppen. Zum einen handelt es sich um ein unbehandeltes Kollektiv mit Myokardinfarkt (MI-Gruppe), zum anderen um eine Gruppe von Ratten, die nach Infarkt mit Etomoxir (Etomoxir-Gruppe) behandelt wurden. Eine dritte, scheinoperierte Kontrollgruppe (SO-Gruppe) diente als Vergleich. Im einzelnen sollen in der Arbeit folgende Fragen beantwortet werden:

  1. Wird die myokardiale Hypertrophie nach Infarkt durch chronische Hemmung der CPT-1 verändert?
  2. Verändert die Etomoxir-Behandlung die kontraktile Funktion des Myokards nach MI?
  3. Kann durch chronische Verschiebung der kardialen Substratoxidation von FS nach Glukose die Ca2+-Transportfunktion infarzierter Herzen verbessert werden?

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