Geil, Dominik: Thema: ”Charakterisierung der Ca2+-Transportaktivität des sarkoplasmatischen Retikulums nach experimentellem Myokardinfarkt“

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Kapitel 2. Untersuchungsgut und Methodik

2.1. Verwendete Chemikalien

Tab. 2 enthält eine Übersicht der in dieser Studie verwendeten Chemikalien und Wirkstoffe. Wenn nicht ausdrücklich vermerkt, stammten alle im Text erwähnten Detergenzien von der Firmen Serva, Heidelberg und entsprachen dem höchsten Reinheitsgrad (p.A. Qualität).

Tab. 2: Übersicht der verwendeten Chemikalien und Wirkstoffe

Agens

Firma

Acrylamid

BioRad, Richmond, CA, USA

Ammoniumpersulfat

Sigma-Aldrich, Deisenhofen

Anti-Kaninchen IgG-Meerrettich Peroxidasekonjugat

Sigma-Aldrich, Deisenhofen

45CaCl2

Amersham, Little Chalfout, GB

EDTA

Merck, Darmstadt

Enhanced Chemoluminescence Analysis Kit (ECL)

Amersham, Little Chalfout, GB

Etomoxir

RBI, Natick, MA, USA

EGTA

Merck, Darmstadt

Folin-Ciocalteus-Phenolreagenz

Sigma-Aldrich, Deisenhofen

Gentamicin

Merck, Darmstadt

Kaninchen anti-SERCA2a anti-Serum

Geschenk von W. Dillmann, St. Diego, CA, USA

Ketaminhydrochlorid

Parke-Davis, Berlin

Kreatinphosphat

Boehringer-Mannheim

katalytische Untereinheit der PKA

Präparation der Arbeitsgruppe

PKI-(6-22)amide

GibcoBRL, Grand Island, New York, USA

Ponceaurot-Konzentrat

Sigma, Deisenhofen

Szintillatorlösung Rotiszint

Carl Roth, Karlsruhe

Tris-ATP

Sigma, Deisenhofen

Xylazinhydrochlorid

Bayer, Leverkusen


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2.2. Durchführung des experimentellen Infarktes

Die Durchführung der Operation zur Herzinfarktinduktion einschließlich der Hämodynamikmessung erfolgte im Labor der Inneren Medizin an der Charité. Die Tierversuche wurden von der Senatsverwaltung für Gesundheit und Soziales Berlin genehmigt. Die Operationsmethode zur Unterbindung der linken Herzkranzarterie wurde im wesentlichen nach Selye und Mitarbeitern (84) sowie Johns und Olson (40) durchgeführt. Versuchstiere waren zehn bis fünfzehn Wochen alte männliche HAN-Wistar-Ratten mit einem Körpergewicht zwischen 250 g und 350 g. Die Narkose wurde durch eine Mischinjektion aus Ketaminhydrochlorid (75 mg/kg KG) und Xylazinhydrochlorid (7.5 mg/kg KG) in das Peritoneum eingeleitet. Anschließend erfolgte die Fixation und Intubation der Ratte. Nach Rasur der Brust, des Oberbauches und der unteren Halsregion folgte eine Hautdesinfektion. Der Zugang zum Thorax wurde über einen kleinen Hautschnitt paramedial gewählt. Nach Durchtrennung des großen Brustmuskels erfolgte die Anbringung einer Tabaksbeutelnaht und das Ablegen des lockeren Knotens auf der Ratte. Die künstliche Beatmung wurde mittels eines selbstgefertigten Tubus aufgenommen mit ca. 15 ml Raumluft/Atemzug/kg KG bei 40 Atemzügen/min. Nach vorsichtigem Durchtrennen der vierten und fünften Rippe und Spreizen der Wunde, folgte die Eröffnung des Herzbeutels, das Herausnehmen des Herzens und das Umstechen und Verschließen der linken Koronararterie nahe dem Ursprung. Das Herz wurde reponiert, die vorbereitete Tabaksbeutelnaht zugezogen und die künstliche Beatmung beendet. Daran schloß sich eine 15minütige EKG Aufzeichnung nach Einthoven an. Alle Tiere erhielten eine subkutane Injektion von Gentamicinsulfat (20 mg/Ratte) zur Antibiose. Bei den durchgeführten Scheinoperationen entfiel der Verschluß der Koronararterie. Bei der im Mittel 8 min dauernden Operation war der Brustkorb etwa 85 s offen. Nach der OP erfolgte eine Randomisierung, um die Tiere zufällig einer der Behandlungsgruppen zuzuordnen. Die postoperative Letalität betrug unter den infarzierten Tieren annähernd 50 %.

2.3. Behandlungsmuster und Messung der Hämodynamik

Die Tiere der SO-Gruppe erhielten über den gesamten Zeitraum von sechs Wochen Rattenstandardfutter und Wasser ad libitum. Die MI-Gruppe wurde mit 30 g/kg KG Rattenstandardfutter und 10 ml Wasser pro Ratte und Tag versorgt. Die Behandlung der Etomoxir-Gruppe setzte am ersten postoperativen Tag ein. Jedes Tier bekam 8 mg/kg KG (+) Etomoxir (Na+-Salz) in 10 ml Trinkwasser gelöst und Rattenstandardfutter ad libitum. Sechs


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Wochen nach Infarkt wurden die Ratten wiederum mit Ketaminhydrochlorid und Xylazinhydrochlorid intraperitoneal narkotisiert. Es folgte die Ermittlung des Körpergewichtes, eine Rasur und die Fixation der Tiere. Die Beatmung wurde, wie schon oben beschrieben, durchgeführt. Über die Arteria carotis communis wurde ein 2 French Mikrotip Katheter (Millar Instruments, Houston, Texas, USA) unter Blutdruck-Monitorkontrolle bis in den linken Ventrikel vorgeschoben. Es folgte die Messung des linksventrikulären enddiastolischen Drucks, der maximalen Druckanstiegs- und Druckabfallgeschwindigkeit. Ein angelegtes Elektrokardiogramm lieferte die Herzfrequenz. Anschließend wurde nach Durchtrennen der dritten bis siebten Rippe rechts parasternal die Aorta freipräpariert und zur Messung des aortalen Blutflusses ein Flußmeßkopf (Transsonic Systems, USA) um den aufsteigenden Teil dieses Gefäßes gelegt. Nachfolgend wurden die arteriellen und venösen Hauptgefäße durchtrennt und das Herz entnommen und sofort in Blutersatz-Lösung (NaCl 140 mM, KCl 5 mM, CaCl2 0.75 mM, MgCl2 1.1 mM, Tris/HCl 10 mM, Glukose 11.1 mM, ph 7.4, Zimmertemperatur) überführt. Nach Abtrennen der Vorhöfe und dem rechten Ventrikel wurden die Ventrikelgewichte bestimmt und die linke Herzkammer von der Basis zur Spitze aufgeschnitten. Im Anschluß daran folgte die Aufspannung des Ventrikels mit dem Septum und das Ausmessen des infarzierten Gewebes mit Hilfe von Planimetrie. Von der Gesamtfläche des Ventrikels wurde das Infarktareal subtrahiert. Entnommene Papillarmuskeln aus dem linken Ventrikel dienten zur Charakterisierung der kontraktilen Funktion des Myokards. Der Rest des Gewebes wurde umgehend in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80°C eingelagert. Von der Entnahme des Herzens bis zum Einfrieren vergingen ca. fünf Minuten.

2.4. Präparieren der Homogenate

Von den Proben des gefrorenen Herzmuskelgewebes (-80 °C) wurde zwischen 20 und 30 mg abgenommen. Alle weiteren Arbeitsschritte erfolgten bei einer Temperatur von +4 °C. Die Gewebestückchen wurden zu einem dem Gewicht entsprechenden Volumen an Schutzpuffer (250 mM Saccharose, 10 mM Histidin, 50 mM NaH2PO4, 10 mM NaF, 1 mM EDTA, 0.3 mM PMSF, 0.5 mM DTT, ph 7.4) gegeben, so daß ein Milliliter Puffer 30 mg Gewebe enthielt. NaH2PO4, NaF und PMSF dienten der Hemmung der Proteinphosphatasen, während DDT als SH-Gruppenschutz eingesetzt wurde. Nun erfolgte eine mechanische Zerkleinerung des Gewebes mittels einer Schere. Die Homogenisierung mit dem Polytron PT 3000 (Kinemata AG, Littau, Schweiz) bei 21000 U/min erfolgte sechsmal für je 10 s. Um eine Überhitzung zu


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vermeiden, wurden Pausen von je 15 s zwischen den Umläufen eingehalten. Zur Entfernung von bindegewebigen Anteilen erfolgte anschließend eine Filtrierung des Materials durch Polyamidgaze mit 150 µm Porengröße (NeoLab, Heidelberg, Deutschland). Der Proteinverlust durch die Filtrierung betrug etwa 5 %. Aliquots von je 100 µl wurden umgehend in flüssigem Stickstoff tiefgefroren und bei -80 °C eingelagert. Je 50 µl Homogenat diente zur Proteinbestimmung. Die Homogenisierung des Gewebes zerstört die Zellmembranen der Myozyten. In dem Schutzpuffer bilden sich aus den SR-Membranfragmenten spontan Vesikel, von denen mindestens 90 % eine Membranorientierung wie in der intakten Zelle haben. ATPase- und Ca2+-Bindungsstelle der SERCA2a sind so dem Ca2+-Transportmedium frei zugänglich ( Abb. 6 im Kap. 5.8).

2.5. Proteinbestimmung

Die Proteinbestimmung erfolgte in einer modifizierten Version nach Lowry und Mitarbeitern (58) . 50 µl Homogenat wurden in 0.5 ml bidestilliertem Wasser aufgenommen. Im ersten Schritt wurde jeweils 2.5 ml des Lowry-Reagenz (2 % Na2CO3 in 0.1n NaOH, 0.02 % K-Na-Tatrat, 0.01 % CuSO4 x 5H2O) zugegeben. Nach 10 min folgte die Zugabe von 0.25 ml des Folin-Ciocalteu-Phenolreagenz, welches vorher 1:1 mit bidestilliertem Wasser verdünnt worden war. 45 min danach schloß sich die photometrische Messung der optischen Dichte bei einer Wellenlänge von 585 nm am Spektrophotometer UV-1202 (Shimadzu, Tokio, Japan) an. Gleichzeitig mit den Proben wurde mit Standardprotein eine Eichkurve im Bereich von 0 bis 100 µg ermittelt. Als Bezugslösung diente eine Stammlösung in der Konzentration 5 mg/ml Ovalbumin. Alle Eichwerte sind Duplikate. Die erhaltenen Absorptionswerte wurden durch lineare Regression mit Hilfe des Programms Ligand (G.A. McPherson, Elsevier-Biosoft, Cambridge, GB) in Proteinkonzentrationen umgerechnet.

2.6. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Elektrotransfer

Die Homogenate wurden in Eiswasser aufgetaut und entsprechend ihrer Proteinkonzentration mit Saccharose/Histidin-Puffer (250 mM Saccharose, 10 mM Histidin) auf 2 mg/ml verdünnt. Bei einer Temperatur von 22 °C und einer Schüttelfrequenz von 1000/min (Eppendorf-Thermomixer 5436, Hamburg, Deutschland) wurden die Proben in 4fach konzentriertem Probenpuffer 1:4 verdünnt und für 30 min solubilisiert (Endkonzentration: 1.5 % Natrium Dodecyl Sulfat (SDS), 62.5 mM Tris-HCl, 7.5 % Glycerol, 5% Mercaptoethanol, 0.1 %


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Pyronin, 0.04 % Bromphenolblau, ph 6.8). Die elektrophoretische Auftrennung der solubilisierten Proteine erfolgte in einer Mini Elektophorese Kammer (Bio-Rad Laboratories, Richmond, USA). Der Zusatz von 4 M Harnstoff in die Trenngelpolymerisationslösung (Acrylamid-bis-Acrylamidmonomerkonzentration T=7.5 %, Vernetzerkonzentration C=2.7 %, 375 mM Tris pH 8.8, 0.1 % SDS, 0.05 % Ammonium-Persulfat, 4 M Harnstoff , 0.05 % Tetramethylethylendiamin (TEMED)) modifizierte die Vorschrift nach Laemmli (46) . Das Trenngel wurde sofort nach dem Gießen mit einem dünnen Wasserfilm überschichtet. Nach Polymerisation desselben (etwa 30 min) ließ sich mit Filterpapier der Wasserfilm entfernen. Es folgte die Herstellung des Sammelgels mit 4 % Acrylamid, 125 mM Tris pH 6.8, 0.01 % SDS, 0.005 % Ammonium-Persulfat, 0.1 % TEMED (T=4 %, C=2.7 %). Hier dauerte es wiederum etwa 30 min bis zum Aushärten. Pro Minigel (1.5 mm x 10 cm x 8 cm) wurden 15 Proben mit je 3 µg Protein im elektrischen Feld aufgetrennt. In die erste Bahn erfolgte die Auftragung eines Molekulargewichtsstandards. Die beiden Gelkassetten wurden in die Elektrophoreseapparatur eingesetzt. In den Puffertank wurde Elektrodenpuffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 1 % SDS, pH 8.3, Temperatur 4 °C) gefüllt. Die angelegte Spannung (Bio-Rad Power supply 1000/500, Richmond, USA) betrug 100 V für 0.5 h und 150 V für eine weitere Stunde bei einer Stromstärke von 500 mA.

Anschließend erfolgte der Elektrotransfer der aufgetrennten Proteine auf Nitrozellulosemembran BA 85 (Schleicher & Schuell, Dassel) in einer Mini Trans-Blot Kammer (Bio-Rad Laboratories, Richmond, USA) für 1.1 h bei 100 V und 4 °C. Der Transferpuffer enthielt 25 mM Tris, 192 mM Glycin pH 8.3, 20 % Methanol und 0.01 % SDS. Daran schloß sich eine 10minütige Färbung der auf Nitrocellulose übertragenen Proteine mit Ponceaurot an. Bis zur Verarbeitung am nächsten Tag lagerten die Membranen bei -20 °C. Zur Kontrolle eines vollständigen Proteintransfers wurde das Gel mit Coomassie Brilliant Blau G250 nach Standardprozedur angefärbt.

2.7. Quantitativer immunchemischer SERCA2a-Nachweis

Die bei -20 °C gelagerten und mit Ponceaurot angefärbten Membranen wurden zur Entfärbung in 0.5 l TBS (150 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7.4) für 10 min bei Raumtemperatur gewaschen.


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Anschließend erfolgte die Blockierung unspezifischer Proteinbindungsstellen der Nitozellulose in 100 ml 0.05 % TBST (TBS mit Tween-20) und 3% Ovalbumin für 1.5 h. Dann wurde dreimal je 10 Minuten in 0.5 l TBST gewaschen, bevor die Inkubation mit dem primären SERCA2a-Antikörper erfolgte. Die Membranen wurden für 1.5 h in 10 ml TBS mit 1 % Rinderserumalbumin, 1:5000 verdünntem Kaninchen anti-SERCA2a anti-Serum in verschließbaren 50 ml Polypropylenzentrifugenröhrchen auf einem Kipproller (Stuart Scientific, Surrey, GB) inkubiert. Danach folgte mehrmaliges Waschen: zweimal je 10 min in TBST, 5 min in 100 ml 3%iger Ovalbuminlösung (gleicher Ansatz wie oben) und zweimal je 10 min in TBS. Die Nitozellulose wurde dann für 1 h mit Anti-Kaninchen IgG-Meerretich-Peroxidasekonjugat (Verdünnung 1:5000) in 10 ml TBS mit 0.1 % Ovalbumin inkubiert. Es folgte ein zweimaliges Waschen mit 0.5 l TBST und 0.5 l TBS für jeweils 10 min in einer Kunststoffschale. Alle weiteren Schritte zur Sichtbarmachung des immunoreaktiven SERCA2a-Proteins mit Hilfe eines Enhanced Chemoluminescence Analysis Kit (ECL) sind in der Dunkelkammer durchgeführt worden. Bei der ECL-Reaktion kommt es unter alkalischen Bedingungen zur Peroxidase/H2O2-katalysierten Oxidation des zyklischen Diacylhydrazids Luminol ( Abb. 5 ). Dabei befindet sich Luminol kurzzeitig in einem angeregten Zustand. Im Beisein von chemischen Verstärkern wird unter Emission von Lichtquanten dieser Zustand wieder verlassen. Durch Auflegen eines Röntgenfilms auf den mit ECL-Kit behandelten Blot kommt es zur Schwärzung. Die Intensität des emittierten grünen Lichts ist dabei proportional der SERCA2a-Antigenmenge, so daß nach Scannen des entwickelten, belichteten Röntgenfilms relative Veränderungen zwischen untersuchten Proben quantitativ erfaßt werden können.

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Abb. 5: Prinzip der Chemoluminiszenz
AK, Antikörper; MPO, Meerretich-Peroxidase; aus: Produktbeilage der Firma Amersham, Little Chalfont, GB
Der 1. AK bindet spezifisch an die SERCA2a-Proteinbande auf der Nitrozellulose. Daran heftet sich der mit der MPO konjugierte 2. AK. In einer MPO/H2O2 katalysierten Reaktion wird Luminol oxidiert und zur Emission von Lichtquanten angeregt. Dieses Licht schwärzt einen aufgelegten Röntgenfilm

In der vorliegenden Arbeit betrug die Expositionszeit der Membranen mit dem ECL-Kit 1 min, während die Belichtungszeit für den mittelempfindlichen Film (NIF 18x24 cm, Segrate, Italien) je nach Signalstärke zwischen 10 s und 70 s variierte. Die optische Dichte der immunoreaktiven Banden wurde durch einen Scanner (Modell DNA 35, PDI, Huntington Station, NY, USA) digitalisiert und mit dem Programm Quantity One (PDI, Huntington Station, NY, USA) quantifiziert. Die erhaltenen Werte entsprechen der optische Dichte pro mm2 (OD x mm2). Um die Linearität zwischen Proteinkonzentration und Intensität des optischen Signals zu überprüfen, wurden in einem separaten Versuch definierte Mengen von Homogenat (1.5-6 µg Protein pro Bahn) aufgetragen und ausgewertet.


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2.8. Oxalat-stimulierte Ca2+-Aufnahme in Membranvesikel des sarkoplasmatischen Retikulums

Bei -80 °C gelagerte Homogenate wurden in Eiswasser aufgetaut und sofort für Ca2+-Transportmessungen eingesetzt. Der von der SERCA2a-katalysierte ATP-abhängige Transport von Ca2+ in SR-Membranvesikel wurde als Oxalat-stimulierte 45Ca2+-Aufnahme nach einer von Will und Mitarbeitern beschriebenen Methode gemessen (100) . Das Ca2+-Aufnahmemedium mit einem Ansatzvolumen von 250 µl enthielt 40 mM Imidazol, 5 mM MgCl2, 100 mM KCl, 10 mM NaN3, 0.2 mM EGTA, 6 mM Kreatinphosphat, 5 mM Tris-ATP, 0.1 mM 45CaCl2 (spez. Aktivität: ~5 µCi/mol ) und 10 mM K-oxalat. Nach Vorinkubation der Reaktionslösung bei 37 °C für 2 min startete die Ca2+-Aufnahme in die Vesikel durch schnelle Zugabe von 10 µl Homogenat zu 240 µl Aufnahmemedium. Das in das Lumen des Vesikels transportierte radioaktive Ca2+ wird dort von passiv aufgenommenen Oxalatanionen gebunden und als schwer lösliches Kalziumsalz zur Ausfällung gebracht ( Abb. 6 ).

Abb. 6: Schema zur Oxalat-stimulierten Aufnahme von 45Ca2+ in Membranvesikel des SR
SERCA2a, sarko(endo)plasmatische Retikulum Ca2+-ATPase; PLB, Phospholamban; P, Phosphorylierung; Mg-ATP, Magnesium-Adenosintriphosphat; Ox, Oxalatanion; SR, sarkoplasmatisches Retikulum; CaOxdarr, präzipitiertes Kalziumoxalat. Netto Ca2+-Aufnahme = SERCA2a-katalysierte 45Ca2+-Aufnahme - Ca2+-Efflux


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Durch die Präzipitation dieses Salzes bleibt die freie Ca2+-Konzentration im Vesikel niedrig, so daß der Efflux von Ca2+ vernachlässigbar klein ist. Die pro Zeiteinheit aufgenommene Ca2+-Menge ist folglich ein Maß für die SERCA2a-katalysierte Ca2+-Transportaktivität des SR. Durch die Wirkung des Oxalats wird der SR Ca2+-Transport etwa 100fach verstärkt, was die Transportmessungen in Homogenaten erst ermöglicht. Nach 0.5, 1, 1.5 und 2 min wurde von der Reaktionslösung jeweils 0.05 ml abgenommen und durch einen 0.45 µm Membran-Filter (Schleicher & Schuell, Dassel) unter Benutzung einer Vakuumpumpe filtriert ( Abb. 7 ).

Abb. 7: Versuchsaufbau zur Messung der Oxalat-stimulierten Ca2+-Aufnahme
Nähere Erläuterungen siehe Text.

Die mit 45Ca2+ angereicherten Vesikel blieben als Filterrückstand zurück. Zweimaliges Waschen mit je 3 ml einer eiskalten Waschlösung (100 mM KCl, 2 mM EGTA, 40 mM Imidazol, 1.25 mM NaN3, pH 7.0) entfernte unspezifisch gebundenes Ca2+ von den Filtern. Die Raten der Ca2+-Aufnahme sind zusätzlich durch Messungen in Anwesenheit von 2 µM katalytischer Untereinheit der Proteinkinase A (PKA) und durch Zugabe von 10 µM eines spezifischen inhibitorischen Peptids der Proteinkinase (PKI) ergänzt worden. Alle Meßwerte sind Doppelbestimmungen. Die Filter wurden anschließend in Szintillations-Meßküvetten


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überführt und bei 60 °C für 30 min getrocknet. Nach Zugabe von 5 ml Szintillatorlösung Rotiszint erfolgte die Messung der ß-Strahlung im Flüssigkeits-Szintillationszähler Wallac System 1400 (Pharmacia, Turku, Finnland). Die Ca2+-Transportrate ließ sich durch lineare Regression der zu vier verschiedenen Zeitpunkten ermittelten transportierten Ca2+-Mengen berechnen ( Abb. 11 , Kap. 6.5). Die ermittelten Ca2+-Transportraten sind in nmol Ca2+/mg Protein/min angegeben.

2.9. Statistik

Die statistische Überprüfung der Meßwerte aus den drei Gruppen SO, MI und Etomoxir erfolgte mit Hilfe des Programms Graph-Pad InStat (San Diego, CA, USA). Um die Signifikanz der Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen zu prüfen, erfolgte zuerst eine Varianzanalyse für unabhängige Stichproben (ANOVA). Bei p<0.05 wurden Gruppenunterschiede mit dem Student-Newman-Keuls-Test statistisch geprüft. Für nicht-normalverteilte Stichproben kam der Kruskal-Wallis-Test zum Einsatz. Die linearen Regressionsanalysen erfolgten mit Hilfe des parametrischen Pearson-Tests. Statistische Signifikanz wurde angenommen bei p<0.05. Wenn nicht ausdrücklich gekennzeichnet, sind alle Werte in der vorliegenden Arbeit als Mittelwerte ± Standardabweichung (SD) angegeben.


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