Geil, Dominik: Thema: ”Charakterisierung der Ca2+-Transportaktivität des sarkoplasmatischen Retikulums nach experimentellem Myokardinfarkt“

Aus dem Institut für Physiologie
des Universitätsklinikums Charité
Direktor Prof. Dr. med. P. B. Persson


Dissertation
Thema:
”Charakterisierung der Ca2+-Transportaktivität des sarkoplasmatischen
Retikulums nach experimentellem Myokardinfarkt“

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor medicinae
(Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von Herrn Dominik Geil ,
geb. am 04.12.1969 in Lahnstein

Dekan: Prof. Dr. med. M. Dietel

Gutachter:
Prof. Dr. med. P.B. Persson
Prof. Dr. sc. med. C. Pfeiffer
Prof. Dr. rer. nat. E.-G. Krause

eingereicht: August 1997

Datum der Promotion: 03.06.1998

Zusammenfassung

Zur Charakterisierung der myokardialen SR Ca2+-Transportaktivität nach experimentellem Myokardinfarkt wurde 10-15 Wochen alten Ratten die linke Koronararterie unterbunden und sechs Wochen später die Funktion und Expression der Ca2+-ATPase des sarkoplasmatischen Retikulums untersucht. Ein Teil der Tiere wurde mit dem Carnitin-Palmitoyl-Transferase-1- Inhibitor Etomoxir behandelt, der die mitochondrale Oxidation von langkettigen Fettsäuren hemmt und dadurch verstärkt Glukoseoxidation bewirkt. Diese Stoffwechselumstellung sollte die Schädigung der myokardialen Funktion und die gestörte zelluläre Ca2+-Homöostase nach Myokardinfarkt vermindern.

Die mit Etomoxir behandelten Tiere wiesen nach sechs Wochen eine deutlich verminderte Infarktgröße auf. Durch die CPT-1-Hemmung entstand eine starke biventrikuläre Hypertrophie. Darüber hinaus ergaben sich Hinweise auf den Erhalt einer normalen Wandspannung des linken Ventrikels und einer verbesserten Kontraktilität gegenüber der unbehandelten Gruppe.

Unter Etomoxir zeigte die für die diastolische Ca2+ Senkung verantwortliche ATP-abhängige Ca2+-Rückbindung in das SR verbesserte Transportraten. Damit korrelierte der immunchemisch gemessene erhöhte SERCA2a-Proteinspiegel.

Die Ergebnisse lassen vermuten, daß es infolge einer Behandlung mit Etomoxir nach Myokardinfarkt zu einer verbesserten Zellstoffwechsellage des ischämisch nicht irreversibel geschädigten Myokards kommt. Dafür scheint die verstärkte Glukoseoxidation bei Hemmung der Oxidation langkettiger Fettsäuren im Herzmuskel verantwortlich zu sein. Die Größe des infarzierten Areals wird begrenzt, dadurch lassen sich zum Teil verbesserte hämodynamische Parameter und gesteigerte SR Ca2+-Transportraten und SERCA2a-Proteinspiegel erklären. Auf die Hämodynamik hat sicherlich auch die durch Etomoxir erfolgte myokardiale Hypertrophie einen wesentlichen Einfluß.

Für weitere Studien bleibt abzuklären, durch welchen Mechanismus Etomoxir seine verbessernde Wirkung nach Myokardinfarkt entfaltet. Außerdem ist zu prüfen, ob nach akutem Myokardinfarkt beim Menschen mit dem Prinzip der chronischen Verschiebung der myokardialen Substratverwertung von Fettsäure- nach Glukoseoxidation eine verbesserte Überlebensrate und das Hinauszögern bzw. Verhindern einer Dekompensation des Herzens zu erreichen ist.

Abstract

To characterise the activity of sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ after myocardial infarction the left coronary artery of 10-15 week old male rats was ligated; six weeks later function and expression of the SR Ca2+-pump ATPase (SERCA2a) transport in the surviving myocardium was investigated. Part of the animals were treated with the carnithin palmitoyltransferase-1 (CPT-1) inhibitor etomoxir (8mg/kg/d for six weeks) to decrease the oxidation of long chain fatty acids. Due to the drug-induced shift from fatty acid to carbohydrate utilization an attenuated myocardial dysfunction and an improved SR Ca2+ handling homeostasis in the surviving myocardium could be expected.

The etomoxir treated rats showed a decreased infarct size six weeks after coronary ligation. Due to CPT-1 inhibition a significant biventricular hypertrophy was observed. In addition, the treatment normalized elevated LVEDP and improved contractility. Compared to sham-operated controls treatment with etomoxir caused an enhanced SR Ca2+ uptake activity that correlated with increased immunoreactive SR Ca2+-ATPase levels.

The results suggest that chronic inhibition of CPT-1 after myocardial infarction improves the metabolism of reversible damaged tissue. It appears that increased oxidation of glucose and inhibition of long chain fatty acid oxidation is responsible for this effect. Limitation of the infarct size induces improvement of haemodynamic parameters, increases SR Ca2+ uptake and protein levels of SERCA2a.

Further studies are required to find out whether etomoxir is able to delay the development of congestive heart failure in humans and whether it could decrease mortality in patients after myocardial infarction.

Keywords:
etomoxir, myocardial infarction, Ca2+-pump ATPase, rat heart


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Inhaltsverzeichnis

TitelseiteThema: ”Charakterisierung der Ca2+-Transportaktivität des sarkoplasmatischen Retikulums nach experimentellem Myokardinfarkt“
Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis
1 Einleitung
1.1.Herzinsuffizienz als eine Folge von koronarer Herzerkrankung und Myokardinfarkt beim Menschen
1.2.Pathophysiologie der Herzarbeit
1.3.Tiermodell zur Untersuchung chronischer Veränderungen nach Myokardinfarkt
1.4.Ca2+-Homöostase und Funktion des sarkoplasmatischen Retikulums (SR)
1.5.Funktion des sarkoplasmatischen Retikulums bei Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz
1.6.Substratoxidation im Herzmuskel
1.7.Fettsäureoxidation in der Herzmuskelzelle
1.8.Der Carnitin-Palmitoyl-Transferase-1-Hemmstoff Etomoxir
1.9.Aufgabenstellung
2 Untersuchungsgut und Methodik
2.1.Verwendete Chemikalien
2.2.Durchführung des experimentellen Infarktes
2.3.Behandlungsmuster und Messung der Hämodynamik
2.4.Präparieren der Homogenate
2.5.Proteinbestimmung
2.6.SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Elektrotransfer
2.7.Quantitativer immunchemischer SERCA2a-Nachweis
2.8.Oxalat-stimulierte Ca2+-Aufnahme in Membranvesikel des sarkoplasmatischen Retikulums
2.9.Statistik
3 Ergebnisse
3.1.Allgemeine Charakteristika der Versuchstiere
3.2.Hämodynamik- und Frequenzmessung
3.3.Relaxationsverhalten von Papillarmuskelpräparaten nach Myokardinfarkt
3.4.Beziehung zwischen Infarktgröße und Hypertrophiegrad
3.5.Ca2+-Transport in Membranvesikel des sarkoplasmatischen Retikulums
3.5.1.Transportaktivität der SERCA2a in Herzmuskelhomogenaten
3.5.2.Beziehung zwischen Infarktgröße und Ca2+-Transport in das sarkoplasmatische Retikulum
3.6.Western-Blot Analyse der SERCA2a
4 Diskussion
4.1.Allgemeine Charakteristika der Versuchstiere
4.2.Hämodynamik- und Frequenzmessung
4.3.Beziehung zwischen Infarktgröße und Hypertrophie
4.4.Ca2+-Transport in das sarkoplasmatische Retikulum und Western-Blot Analyse
5 Zusammenfassung
Bibliographie Literaturverzeichnis
Selbständigkeitserklärung
Anhang A Veröffentlichungen
Danksagung

Tabellenverzeichnis

Tab. 1: Hemmstoffe der mitochondralen Carnitin-Palmitoyl-Transferase-1
Tab. 2: Übersicht der verwendeten Chemikalien und Wirkstoffe
Tab. 3: Allgemeine Charakteristika der Versuchstiere.
Tab. 4: Darstellung von Herzfrequenz (HF) und aortalem Blutfluß (AF).
Tab. 5: Relaxationsparameter von linksventrikulären Papillarmuskelpräparaten chronisch infarzierter Ratten

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Schema der Ca2+-Bewegungen in einer Herzmuskelzelle
PKA, cAMP-abhängige Proteinkinase; Ca2+/CAM-PK, Ca2+-Calmodulin abhängige Proteinkinase; SR, sarkoplasmatisches Retikulum; SERCA2a, sarko(endo)plasmatische Retikulum Ca2+-ATPase Isoform 2a; PLB, Phospholamban; P, Phosphorylierung; NCX, sarkolemmaler Na+/Ca2+-Austauscher; PMCA, Plasmamembran Ca2+-ATPase
Abb. 2: Schematische Darstellung der vorgeschlagenen Sekundärstruktur der SR Ca2+-ATPase
Erläuterungen siehe Text. Modifiziert entnommen aus (59)
Abb. 3: Schema der Wechselwirkung zwischen Fettsäure- und Glukoseoxidation im Myokard
PDK, Pyruvatdehydrogenasekomplex. Modifiziert aus: (57)
Abb. 4: Strukturformel von Etomoxir
Abb. 5: Prinzip der Chemoluminiszenz
AK, Antikörper; MPO, Meerretich-Peroxidase; aus: Produktbeilage der Firma Amersham, Little Chalfont, GB
Der 1. AK bindet spezifisch an die SERCA2a-Proteinbande auf der Nitrozellulose. Daran heftet sich der mit der MPO konjugierte 2. AK. In einer MPO/H2O2 katalysierten Reaktion wird Luminol oxidiert und zur Emission von Lichtquanten angeregt. Dieses Licht schwärzt einen aufgelegten Röntgenfilm
Abb. 6: Schema zur Oxalat-stimulierten Aufnahme von 45Ca2+ in Membranvesikel des SR
SERCA2a, sarko(endo)plasmatische Retikulum Ca2+-ATPase; PLB, Phospholamban; P, Phosphorylierung; Mg-ATP, Magnesium-Adenosintriphosphat; Ox, Oxalatanion; SR, sarkoplasmatisches Retikulum; CaOxdarr, präzipitiertes Kalziumoxalat. Netto Ca2+-Aufnahme = SERCA2a-katalysierte 45Ca2+-Aufnahme - Ca2+-Efflux
Abb. 7: Versuchsaufbau zur Messung der Oxalat-stimulierten Ca2+-Aufnahme
Nähere Erläuterungen siehe Text.
Abb. 8: Veränderte linksventrikuläre hämodynamische Parameter sechs Wochen nach experimentellem Myokardinfarkt
Alle Werte sind als Mittelwert ± SD dargestellt (n=6-12). SO, scheinoperierte Tiere; MI, Tiere mit unbehandeltem Myokardinfarkt; MI+Etomoxir, Tiere mit Myokardinfarkt und Etomoxir-Behandlung vom ersten postoperativen Tag an; LVEDP, linksventrikulärer enddiastolischer Druck; +dP/dtmax, maximale Druckanstiegsgeschwindigkeit; -dP/dtmin, maximale Druckabfallgeschwindigkeit; Die Parameter wurden unter Ketamin/Xylazin-Narkose im Labor der Inneren Medizin an der Charité gemessen.
* p<0.05 vs. SO; **p<0.01 vs. SO; *** p<0.001 vs. SO; 1) p<0.05 vs. MI
Abb. 9: Beziehung zwischen Infarktgröße und relativem linksventrikulärem Gewicht
KG, Körpergewicht; SO, scheinoperierte Tiere; MI, Tiere mit unbehandeltem Myokardinfarkt; MI+Etomoxir, Tiere mit Myokardinfarkt und Etomoxir-Behandlung vom ersten postoperativen Tag an; Gerade über alle Werte; Korrelationskoeffizient für Werte der unbehandelten und behandelten Tiere mit Myokardinfarkt: r=0.07; p>0.05;
Abb. 10: Korrelation zwischen Größe des linksventrikulären Infarkts und relativem rechtsventrikulärem Gewicht
KG, Körpergewicht; SO, scheinoperierte Tiere; MI, Tiere mit unbehandeltem Myokardinfarkt; MI+Etomoxir, Tiere mit Myokardinfarkt und Etomoxir-Behandlung vom ersten postoperativen Tag an; Kurve über alle Werte; Korrelationskoeffizient für Werte der unbehandelten und behandelten Tiere mit Myokardinfarkt: r=0.56; p<0.05; n=6-12
Abb. 11: Zeitabhängigkeit des Oxalat-stimulierten SR Ca2+-Transportes
Drei repräsentative Proben aus den Versuchsgruppen. SO, scheinoperiertes Tier; MI, Tier mit unbehandeltem Myokardinfarkt; MI+Etomoxir, Tier mit Myokardinfarkt und Etomoxir-Behandlung vom ersten postoperativen Tag an; die Punkte repräsentieren Mittelwerte aus Doppelbestimmungen. Dargestellte Messung erfolgte unter PKA-Einfluß.
Abb. 12: SR Ca2+-Transportaktivität unter Kontrollbedingungen sowie in Gegenwart von 10 µM Peptidinhibitor (PKI) der Proteinkinase A und 2 µM katalytischer Untereinheit der Proteinkinase A (PKA)
Alle Werte sind als Mittelwert ± SD dargestellt (n=6-12). SO, scheinoperierte Tiere; MI, Tiere mit unbehandeltem Myokardinfarkt; MI+Etomoxir, Tiere mit Myokardinfarkt und Etomoxir-Behandlung vom ersten postoperativen Tag an;
* p<0.05 vs. SO
Abb. 13: Stimulierung des SR Ca2+-Transportes durch Proteinkinase A-abhängige Phosphorylierung von Phospholamban
Alle Werte sind als Mittelwerte ± SD dargestellt. (n=6-12); PKA, 2 µM katalytische Untereinheit der Proteinkinase A; PKI, 10 µM Peptidinhibitor der Proteinkinase A; SO, scheinoperierte Tiere; MI, Tiere mit unbehandeltem Myokardinfarkt; MI+Etomoxir, Tiere mit Myokardinfarkt und Etomoxir-Behandlung vom ersten postoperativen Tag an.
Abb. 14: Einzelwertdarstellung der Oxalat-stimulierten SR Ca2+-Transport-geschwindigkeit
Querbalken zeigt den Mittelwert an. SO, scheinoperierte Tiere; MI, Tiere mit unbehandeltem Myokardinfarkt; MI+Etomoxir, Tiere mit Myokardinfarkt und Etomoxir-Behandlung vom ersten postoperativen Tag an. Die 45Ca2+-Reaktionslösung enthielt kein PKA oder PKI.
Abb. 15: Korrelation zwischen Infarktgröße und Oxalat-stimuliertem SR Ca2+-Transport
SO, scheinoperierte Tiere; MI, Tiere mit unbehandeltem Myokardinfarkt; MI+Etomoxir, Tiere mit Myokardinfarkt und Etomoxir-Behandlung vom ersten postoperativen Tag an; Die 45Ca2+-Reaktionslösung enthielt kein PKA oder PKI. Gerade über alle Werte; Korrelationskoeffizient für Werte der unbehandelten und behandelten Tiere mit Myokardinfarkt: r=0.55; p<0.05, n=6-12
Abb. 16: Western-Blot Analyse der SERCA2a in Homogenaten
Oben : Exemplarischer Western-Blot der immunoreaktiven SERCA2a. Detektion mittels ECL-Kit. Dargestellt sind drei repräsentative Banden aus den unten aufgezeigten Gruppen.
Unten : Immunoreaktives SERCA2a-Signal. Alle Werte sind als Mittelwert ± SD dargestellt (n=5-7). SO, scheinoperierte Tiere; MI, Tiere mit unbehandeltem Myokardinfarkt; MI+Etomoxir, Tiere mit Myokardinfarkt und Etomoxir-Behandlung vom ersten postoperativen Tag an; OD, optische Dichte.
* p<0.01 vs. SO

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