Golembowski, Sven: Mikromanipulation und Einzelzellanalysen ankutanen B-Zell-Lymphomen
Molekularbiologische Untersuchung der Immunglobulingene

Aus der Dermatologischen Universitätsklinik und Poliklinik

der Medizinischen Fakultät (Charité) der Humboldt-Universität zu Berlin

Direktor Prof. Dr. med. W. Sterry


DISSERTATION
Mikromanipulation und Einzelzellanalysen ankutanen B-Zell-Lymphomen
Molekularbiologische Untersuchung der Immunglobulingene

zur Erlangung des akademischen Grades doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Humboldt-Universität zu Berlin

von Herrn Sven Golembowski , geb. am 16.09.1967 in Bernburg

Dekan: Prof. Dr. med. M. Dietel

Gutachter:
PD Dr. S. Jahn
Prof. Dr. A. Radbruch
UD Dr. L. Cerroni

eingereicht: im Mai 1997

Datum der Promotion: 01. Dezember 1997

Schlagwörter:


Seiten: [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72] [73] [74] [75] [76] [77] [78] [79] [80] [81] [82] [83] [84] [85]

Inhaltsverzeichnis

Titelseite Mikromanipulation und Einzelzellanalysen ankutanen B-Zell-Lymphomen
Molekularbiologische Untersuchung der Immunglobulingene
1 Einleitung
1.1.Das kutane B-Zell-Lymphom
1.1.1.Die Geschichte
1.1.2.Die Klassifikation der kutanen B-Zell-Lymphome
1.1.3.Klinik der primär kutanen B-Zell-Lymphome
1.1.3.1.Das kutane Keimzentrumszell-Lymphom
1.1.3.2.Das kutane Immunozytom
1.1.3.3.Das großzellige kutane B-Zell-Lymphom der unteren Extremität
1.1.3.4.Das kutane Plasmozytom
1.1.3.5.Das intravaskuläre großzellige B-Zell-Lymphom
1.1.4.Das Modell der antigengetriebenen MALT-Lymphome - die Arbeitshypothese
1.2.Die B-Lymphozyten
1.2.1.Die Entwicklung der B-Lymphozyten
1.2.2.Die Entstehung der Antikörperdiversität
1.2.3.Der B-Zell-Rezeptor, der Antikörper
2 Aufgabenstellung
3 Material und Methoden
3.1.Charakterisierung der untersuchten Patienten
3.1.1.Patient UK - kutanes Keimzentrumszell-Lymphom am behaarten Kopf
3.1.2.Patientin IL - Großzelliges kutanes B-Zell-Lymphom der unteren Extremität
3.2.Verwendete Geräte, Reagenzien und Chemikalien
3.2.1.Für die Färbung
3.2.2.Für die Mikromanipulation
3.2.3.Für den Proteinase-Verdau und die PCR
3.2.4.Für die Sequenzierung
3.2.5.Für die DNA-Extraktion und Klonierung
3.3.Die Methoden
3.3.1.Schnitt und Anfärbung der kryokonservierten Bioptate
3.3.2.Die Mikromanipulation der Einzelzellen
3.3.3.Die Einzelzell-PCR
3.3.4.Die Direktsequenzierung
3.3.5.Die DNA-Extraktion, PCR, Klonierung
3.3.6.Die Keimbahngen-Analyse
4 Ergebnisse
4.1.Etablierung der Methode
4.1.1.Die Hybridomzellinie CB03
4.1.2.Reaktive B-Lymphozyten aus einem kutanen T-Zell-Lymphom
4.2.Sequenzanalyse von Tumorzellen aus kutanen B-Zell-Lymphomen
4.2.1.Lymphomzell-Analyse des Patienten UK
4.2.1.1.Keimbahngen-Analyse für Patient UK
4.2.1.2.Mutationsanalyse der Immunglobulingene der Lymphomzellen des Patienten UK
4.2.2.Lymphomzell-Analyse der Patientin IL
4.2.2.1.Keimbahngen-Analyse für Patientin IL
4.2.2.2.Mutationsanalyse der Immunglobulingene der Lymphomzellen der Patientin IL
5 Diskussion
5.1.Mutationsanalyse
5.1.1.Mutationsfrequenz
5.1.2.Andauernde Mutationen (ongoing mutation) und intraklonale Diversität
5.1.3.Mutationsmuster
5.2.Einordnung der Daten in die gegenwärtige Klassifikation primär kutaner Lymphome
5.2.1.Keimzentrumszell-Lymphom vs. Marginalzonenzell-Lymphom
5.2.2.High-grade vs. low-grade Tumorzellen
5.2.3.Rolle des bcl-2 Proteins
5.3.Zur Methode
5.3.1.Einzelzell- vs. Populationsanalysen
5.3.2.Sensitivität und Spezifität der PCR-Diagnostik
5.3.3.(Un-)Zuverlässigkeit der Daten
6 Zusammenfassung
Bibliographie A Literaturverzeichnis
Anhang A Abkürzungsverzeichnis
Selbständigkeitserklärung
Danksagung
Lebenslauf

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1 EORTC-Klassifikation der primär kutanen B-Zell-Lymphome, siehe detaillierte Beschreibung der einzelnen Entitäten in Kapitel Klinik der primär kutanen B-Zell-Lymphome. siehe
Tabelle 2 Immunhistochemische und molekularbiologische Befunde der beiden Patienten UK und IL; *...mit aus der Hautbiopsie extrahierter Gesamt-DNA
Tabelle 3 Oligonukleotidprimer für die Einzelzell-PCR zur Amplifikation der Immunglobulingene, nach Küppers et al. siehe ; angegeben in 5’-3’-Richtung; Primer VH1,7 bindet an VH1- und VH7-Familienmitgliedern; Y: C+T, R: A+G, K: G+T
Tabelle 4 Oligonukleotidprimer zur Sequenzierung von in pCR™II klonierten PCR-Produkten
Tabelle 5 Oligonukleotidprimer zur Amplifizierung des Keimbahngens V5-51 des Patienten UK und des Keimbahngens V3-7 der Patientin IL; Lead...leader, 5’-Primer; RSS...Rekombinationssignalsequenz, 3’-Primer
Tabelle 6 Daten der CB03-Hybridomzell-Analyse; Erläuterungen im Text
Tabelle 7 Ergebnis der Einzelzelzellanalysen von polyklonalen B-Zellen aus der Biopsie der Patientin MW mit kutanem T-Zell-Lymphom. *...Wegen der erwarteten geringen Effizienz sind bewußt mehr als nur eine zu untersuchende Zelle in einige der PCR-Gefäße während der Mikromanipulation überführt worden, wodurch mehrere Amplifikate möglich sind.
Tabelle 8 Übersicht der Einzelzellanalyse des Patienten UK (kutanes Keimzentrumszell-Lymphom); unterschiedliche Buchstaben in eckiger Klammer der 1. Spalte repräsentieren unterschiedliche Mikromanipulationstage. *...Mehr Amplifikate als untersuchte Zellen aufgrund von Verunreinigungen; siehe Text.
Tabelle 9 R/S-Ratio der VH-Gene der Lymphomzellen des Patienten UK, wiederum zusammengefaßt nach Kabat und MacCullam
Tabelle 10 Übersicht der Einzelzellanalyse der Patientin IL (großzelliges kutanes B-Zell-Lymphom der unteren Extremität)
Tabelle 11 R/S-Ratios des VH-Gens der Lymphomzellen der Patientin IL
Tabelle 12 Zusammenfassung der statistischen Mutationsanalyse aller analysierten Tumorsequenzen. Für Erläuterungen siehe Diskussion.

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1 B-Zell-Ontogenese im Knochenmark, nach Rolink et al. siehe , Daten teilweise postuliert in Anlehnung an Experimente mit murinen Lymphozyten; RAG...Rekombinase aktivierende Gene, TdT...terminale Desoxynucleotidyl-Transferase, SLC...surrogate light chain
Abbildung 2 V(D)J-Rekombination der Gene für den variablen Teil der schweren Kette eines Immunglobulins
Abbildung 3 Das Antikörpermolekül am Beispiel des IgG
Abbildung 4 Patient UK; in loco-Rezidiv des Keimzentrumszell-Lymphoms am Capillitium 2 Jahre nach der Exzision und Spalthautdeckung des Primärtumors
Abbildung 5 histologisches Präparat in HE-Färbung des Tumorrezidivs; 15fach vergrößert. sichtbar das diffuse, bis in die Subcutis reichende Infiltrat
Abbildung 6 Giemsa-Färbung zur Darstellung der Zytomorphologie; 300fach vergrößert; deutlich werden die kleinen reaktiven T-Zellen entlang der Blutgefäße
Abbildung 7 Patientin IL; Lokalbefund September 1995; Biopsienarbe sichtbar
Abbildung 8 histologischer Befund; HE-Färbung; 30fach vergrößert
Abbildung 9 links: Giemsa-färbung des großzelligen B-Zell-Lymphoms der unteren Extremität; 300fach vergrößert
Abbildung 10 Histologischer Schnitt (10 µm); CD20 gefärbt; Vergrößerung 450fach; zu pickende Zelle umrandet; am Bsp. der Patientin IL
Abbildung 11 Die zu pickende Zelle ist freigelegt
Abbildung 12 Die Zelle wurde aufgenommen
Abbildung 13 Die Zelle in der Glaskapillare
Abbildung 14 Primeransatz am Immunglobulingen für die seminested PCR
Abbildung 15 Abgeleitete Aminosäuresequenzen der VH-Gene des B-Zell-reichen T-Zell-Lymphoms der Patientin MW im single-letter code. Aminosäureaustausche im Vergleich zu den Keimbahn-VH-Genen (in Klammern) sind fett und kursiv dargestellt. Die hochgestellten Ziffern geben die Anzahl der Mutationen auf Nukleotidsequenzebene wieder. Nur fettgedruckte Sequenzen sind funktionell. Sequenzen ohne “W” (Tryptophan) als letzte Aminosäure sind nicht im Leseraster. *...Stop codon; CDR...complementarity determining regions siehe ; H1,2...loops siehe ; CD1,2...contact definition siehe
Abbildung 16 2% Agarose-Gel. Aufgetragen sind 5 µl der PCR-Produkte 2. Runde von 4 Zellen der Patientin IL, wovon die beiden unteren ein Amplifikat erwarteter Länge (ca. 320 bp) der VH3-Familie zeigen. M...Marker; NK...Negativkontrolle
Abbildung 17 Elektropherogramm der Direktsequenzierung des sense-Stranges des IgH-PCR-Produktes einer Tumorzelle (Verschlüsselungs-Nr. 25) des Patienten UK. Die über den Kurven angegebene Nukleotidsequenz in Großbuchstaben wurde automatisch durch die Software zugeordnet. Kleinbuchstaben entstanden bei der manuellen Nachbearbeitung.
Abbildung 18 Keimbahngen° und Tumorgen* des Patienten UK zum Vergleich auf 2%igem Agarose-Gel aufgetragen.
Abbildung 19 oben: Keimbahngen V5-51UK mit für jede Position notierter intrinsischer R/S-Ratio. unten: Zusammenfassung der R/S-Ratio über das gesamte Gen, unterteilt in die Bereiche definiert durch Kabat (CDR vs. FR) und MacCallum (contact definition). Zahlen in Klammern geben die Positionen dieser Bereiche an.
Abbildung 19 oben: Keimbahngen V5-51UK mit für jede Position notierter intrinsischer R/S-Ratio. unten: Zusammenfassung der R/S-Ratio über das gesamte Gen, unterteilt in die Bereiche definiert durch Kabat (CDR vs. FR) und MacCallum (contact definition). Zahlen in Klammern geben die Positionen dieser Bereiche an.(Die Sequenzangabe erfolgt erst ab Position 21, da die aus der Einzelzellanalyse gewonnene Sequenzinformation des Tumorgens erst ab dieser Position vorliegt. Abbildung 21 siehe zeigt die vollständige Sequenz.)
Abbildung 20 oben: Keimbahngen V3-7IL mit für jede Position notierter intrinsischer R/S-Ratio; unten: Zusammenfassung der R/S-Ratio über das gesamte Gen
Abbildung 21 Nukleotidsequenzen der VH-Regionen der Tumorzellen von den Patienten UK und IL. Die erste Spalte enthält die Bezeichnung der Sequenzen in chronologischer Reihenfolge der entsprechenden Biopsien, aus denen sie stammen. Sie sind gegen das putative Keimbahngen des jeweiligen Patienten (1. Zeile) als Homologievergleich angeordnet: ein Bindestrich kennzeichnet Homologie, abweichende Nukleotide sind ausgeschrieben. Kleinbuchstaben repräsentieren stumme Mutationen. Auch die bereits veröffentlichten Keimbahngene (kursiv, 2. Zeile) werden mit denen des Patienten verglichen, um einen möglichen allelen Polymorphismus darzustellen.
Abbildung 21 Nukleotidsequenzen der VH-Regionen der Tumorzellen von den Patienten UK und IL. Die erste Spalte enthält die Bezeichnung der Sequenzen in chronologischer Reihenfolge der entsprechenden Biopsien, aus denen sie stammen. Sie sind gegen das putative Keimbahngen des jeweiligen Patienten (1. Zeile) als Homologievergleich angeordnet: ein Bindestrich kennzeichnet Homologie, abweichende Nukleotide sind ausgeschrieben. Kleinbuchstaben repräsentieren stumme Mutationen. Auch die bereits veröffentlichten Keimbahngene (kursiv, 2. Zeile) werden mit denen des Patienten verglichen, um einen möglichen allelen Polymorphismus darzustellen.Referenzen zu den angegebenen Keimbahngenen: DP-73 und DP-54, siehe V5-51 und V3-7, siehe DN1 und DIR, siehe JH5b siehe , JH3a siehe
Abbildung 21 Nukleotidsequenzen der VH-Regionen der Tumorzellen von den Patienten UK und IL. Die erste Spalte enthält die Bezeichnung der Sequenzen in chronologischer Reihenfolge der entsprechenden Biopsien, aus denen sie stammen. Sie sind gegen das putative Keimbahngen des jeweiligen Patienten (1. Zeile) als Homologievergleich angeordnet: ein Bindestrich kennzeichnet Homologie, abweichende Nukleotide sind ausgeschrieben. Kleinbuchstaben repräsentieren stumme Mutationen. Auch die bereits veröffentlichten Keimbahngene (kursiv, 2. Zeile) werden mit denen des Patienten verglichen, um einen möglichen allelen Polymorphismus darzustellen.Referenzen zu den angegebenen Keimbahngenen: DP-73 und DP-54, siehe V5-51 und V3-7, siehe DN1 und DIR, siehe JH5b siehe , JH3a siehe EMBL-Datenbank accession numbers der von uns sequenzierten Gene: V5-51UK...Y12817; UKVH5a...Y11556; UKVH5b...Y11557; UKVH5c...Y11558; V3-7IL...Y12818; ILVH3...Y10020
Abbildung 22 Abgeleitete Aminosäuresequenzen der VH-Regionen der Tumorzellen von den Patienten UK und IL. Aminosäureaustausche im Vergleich zu den Keimbahn-VH-Genen (in Klammern) sind fett und kursiv dargestellt.

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