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Kapitel 3. Material und Methoden

3.1. Patientengut und Untersuchungsmaterial

Dieser Arbeit liegen Untersuchungen an 49 Mammakarzinomen zugrunde. Dabei handelt es sich um 43 invasiv duktale sowie 6 invasiv lobuläre Mammakarzinome verschiedener histopathologischer Differenzierungsgrade (G1: 14 Karzinome; G2: 26 Karzinome; G3: 9 Karzinome). Die Tumorgröße lag zwischen 6 und 73mm.

Alle Patientinnen wurden infolge ihres Tumorleidens in der Chirurgischen Klinik der Charité behandelt. Das Alter der Patientinnen betrug 34 bis 84 Jahre (im Mittel: 62 Jahre).

Die vorliegenden Gewebsproben stammen ausschließlich aus den Jahren 1994 und 1995. Alle Fälle wurden im Pathologischen Institut der Charité im Rahmen der Routine-diagnostik begutachtet und befundet.

Es wurde weiterhin darauf geachtet, daß bei allen verwendeten Fällen sowohl eine biochemische (ER-EIA) als auch eine immunhistochemische (ER-ICA) Analyse der Östrogenrezeptoren vorgenommen wurde. Beim Enzym-Immuno-Assay wurde ein Rezeptorgehalt von über 20 fmol/mg Gesamtprotein als positives Ergebnis gewertet.

3.2. Aufarbeitung des Materials

Ausgangspunkt der Aufarbeitung war in 10%iger Formalinlösung fixiertes und in Form von Paraffinblöcken archiviertes Tumormaterial.

Von diesen Blöcken wurden mit Hilfe eines Rotationsmikrotoms vom Typ Microm® HM 350 3µm dicke Schnitte hergestellt, welche auf SuperFrost/Plus® Objektträger auf-gezogen wurden.

Zur topologischen Orientierung wurde von jedem Fall ein Schnitt mit Hämatoxylin-Eosin (HE) gefärbt.

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3.3. Die Simultanfärbung

3.3.1. Die Östrogenrezeptorfärbung - eine immunhistochemische Technik

Materialien

Primär-Antikörper :

Immunotech® Monoclonal Antibody: Estrogen Receptor Nr. 1344

Sekundär-Antikörper und Immunmarkierungssubstanz :

DAKO LSAB®2 Kit K 0674:

Link-Reagenz: biotinylierter Sekundär-Antikörper

Label-Reagenz: Streptavidin mit Alkalischer Phosphatase

Substrat/Chromogen :

SIGMA FAST™: Fast Red TR/Naphtol AS-MX

TRIS-Puffer :

9g TRIS-Base (SIGMA®T1503)

68,5g TRIS-HCl (SIGMA®T3253)

57,5g NaCl (Serva®A30183)

Zitratpuffer : (pH=6,0) zum Autoklavieren

Stammlösung: 18,91g Zitronensäure und 120,55g Na-Zitrat-di-Hydrat auf 5l

Stammlösung 1:10 verdünnen

Aqua dest

Ein gründliches Entparaffinieren der Schnitte ist notwendig, weil Paraffinreste die unspezifische Hintergrundfärbung erhöhen.

Um die Sensitivität der Methode am Paraffinmaterial zu erhöhen, ist sowohl für eine verbesserte immunhistochemische Färbung [Bier et al. 1995 ] als auch für eine verbesserte Versilberungsreaktion [Öfner et al. 1994 ] ein Autoklavieren der Proben erforderlich, um die nukleären Antigene zu demaskieren. Dieser Arbeitsschritt erfolgt nur einmal und wird vor der immunhistochemischen Färbung durchgeführt.

Der pH-Wert des zum Autoklavieren verwendeten Zitratpuffers muß genau 6,0 betragen. Schon geringe Abweichungen beeinträchtigen nach eigenen Erfahrungen das Färbeergebnis.

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Die aufgetropften Antikörperlösungen dürfen nicht unmittelbar am Rand des Präparates enden, sondern müssen darüber hinaus reichen. Ansonsten kommt es zu lokalen Austrocknungseffekten (sogenannten “edge”-Effekten ) mit verstärkter unspezifischer Hintergrundfärbung.

Färbeablauf

1. Entparaffinieren : 30 Minuten in Xylol
2. Absteigende Alkoholreihe zur Rehydratisierung
3. Immersion in TRIS-Puffer
4. Autoklavieren : 5 Minuten in Zitrat-Puffer (pH=6,0)
5. Immersion in TRIS-Puffer
6. Inkubation mit Primär-Antikörper : Verdünnung 1:50 200 µl pro Schnitt, 45 Minuten bei 37°C in Feuchtkammer
7. Spülen : 3×2 min in TRIS-Puffer
8. Inkubation mit biotinyliertem Sekundär-Antikörper : entspricht der Link-Reagenz aus dem DAKO LSAB®2 Kit K 0674 2-3 Tropfen pro Schnitt für 30 Minuten bei 37°C in Feuchtkammer
9. Spülen : 3×2 min in TRIS-Puffer
10. Inkubation mit Immunmarkierungssubstanz : (Streptavidin mit Alkalischer Phosphatase gekoppelt) entspricht der Label-Reagenz aus dem DAKO LSAB®2 Kit K 0674 2-3 Tropfen pro Schnitt für 30 min bei 37°C in Feuchtkammer
11. Spülen : 3×2 min in TRIS-Puffer
12. Inkubation mit Substrat/Chromogen-Lsg .: (SIGMA FAST™Fast Red TR/Naphtol AS-MX) für 5 Minuten
13. Spülen mit TRIS-Puffer und Überführen in Aqua dest

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3.3.2. Die AgNOR-Färbung - eine Versilberungstechnik

Materialien

1. Silbernitrat (Merck® 1.01512.)
2. Blattgelatine (farblos)
3. Ameisensäurelösung

Es ist darauf zu achten, daß keine überlagerte Gelatine verwendet wird. Dies würde zu einer negativen Beeinflussung des Färbeergebnisses führen [Rüschoff 1992 ]. Die Gelatine muß zuvor vorsichtig auf einer Thermoplatte mit Magnetrührer aufgelöst werden.

Die Silber-Kolloid-Gebrauchslösung muß frisch angefertigt werden, daß heißt maximal eine bis zwei Stunden vor Anwendung.

Das Standard-Färbeschema des histochemischen Labors des Instituts für Pathologie der Charité zur AgNOR-Darstellung wurde in zwei Punkten modifiziert. Zum ersten entfällt das Autoklavieren der Schnitte vor Inkubation mit der Silber-Kolloid-Gebrauchslösung, da dieser Arbeitsschritt schon vor der Östrogenrezeptorfärbung erfolgte. Zum zweiten wird nach der Versilberungsreaktion keine aufsteigende Alkoholreihe durchgeführt. Das würde zwangsläufig zu einem “Ausbleichen” der Immunfärbung führen.

Das endgültige Eindecken der doppelt gefärbten Präparate erfolgt aus dem Aqua dest zuerst mit Crystal-Mount™, welches die empfindlichen Färbungen konserviert und danach mit Kanadabalsam.

Färbeablauf

1. Herstellen der Färbelösung
   • Lösung A: 5g AgNO3 in 20ml Aqua bidest
   • Lösung B: 200mg Gelatine in 10ml 1% HCOOH-Lsg.
   • Lösung B in Lösung A
2. Inkubation der Schnitte mit der Färbelösung in einer Glasküvette
   • Färbung bei Dunkelheit und Raumtemperatur
   • nach Standardzeit von 20 Minuten mikroskopische Kontrolle der dots
   • Färbezeit 30min
3. Spülen 3×5 min in Aqua dest
4. Eindecken mit Kanadabalsam nach Konservierung mit Crystal-Mount™

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3.3.3. Das Färberesultat

Östrogen-positive Zellkerne stellen sich im mikroskopischen Bild “rot” oder “orangerot” dar. Demgegenüber stehen östrogen-negative Zellkerne mit einer “zartgelben” Färbung. Diese gelbliche Farbe ist als Artefakt der Versilberungsreaktion aufzufassen. Durch diesen Umstand ist der östrogen-negative Zellkern auch als solcher sichtbar und später auch meßtechnisch abgrenzbar, obwohl keine eigentliche Kern-färbung durchgeführt wurde.

Sowohl in östrogen-positiven, als auch in östrogen-negativen Zellkernen zeigen sich die AgNORs als kleine “schwarzbräunliche” punktartige Strukturen (siehe Abbildung 1).

Abb. 1 Zellen eines G2-differenzierten Mammakarzinoms. Simultanfärbung für Östrogenrezeptoren und AgNORs. 105µm×140µm

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3.4. Meßmethodik

3.4.1. Das Bildverarbeitungssystem AMBA

Software Das Softwaresystem AMBA ist Teil des Bildverarbeitungssystems AMBA und wurde im Labor für automatisierte Mikroskopbildanalyse des Pathologischen Institutes der Charité Berlin entwickelt. Die aktuelle Windows-Version von AMBA wird von der IBSB GmbH Berlin angeboten.

Die Hauptkomponenten dieses Systems sind [Roth et al. 1989 ]:

1. die höhere Programmiersprache LAMBA
2. ein Editor zur Quellprogrammerarbeitung
3. ein Compiler zur Erzeugung lauffähiger Programme
4. ein Steuerteil für Dialog und Programmabarbeitung
5. ein Paket von Unterprogrammen

Das System ist vor allem für histometrische und karyometrische Messungen konzipiert.

So läßt sich für jede Fragestellung ein spezielles Meß- und Verarbeitungsprotokoll entwickeln. Der Entwickler kann dabei aus einer Reihe von Prozeduren wählen. Durch ein hohes Maß an Interaktivität kann man unter geringem Zeitaufwand ein “reibungs-loses Laufen” des entwickelten Programmes überprüfen und Änderungen vornehmen.

Hardware

Tabelle 4 gibt Übersicht über das aktuelle Hardwareprofil des Bildverarbeitungssystems AMBA im Labor für automatisierte Mikroskopbildanalyse des Instituts für Pathologie der Charité.

Tab. 4 Hardwareprofil des Bildverarbeitungssystems AMBA

Personal Computer	CPU Pentium 100MHz 32MB RAM MS DOS V 6.20 Windows for Workgroups 3.11
Framegrabber/Graphikkarte	Matrox Comet
Bildverarbeitungssoftware	AMBA (IBSB GmbH, Berlin)
Farbmonitor	Sony Trinitron Multiscan 17 sf
Mikroskop	Jenaval (Carl Zeiss Jena)
Kamera	Sony 3CCD-Color Video Camera

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Abb. 2 Blockschaltbild des Bildverarbeitungssystems AMBA

3.4.2. Interaktive AgNOR-Vermessung mit dem Programm AMBA\norcolor

Für die Vermessung von AgNORs in farbig markierten Zellen wurde das Programm AMBA\ orcolor entworfen. Dieses Programm wurde unter AMBA geschrieben und speziell an die Aufgabenstellung angepaßt.

Als generelles Problem stellte sich zunächst die Zellkernsegmentierung heraus. Wogegen sich “rote” östrogen-positive Kerne von AMBA gut segmentieren ließen, zeigten die “zartgelben” östrogen-negativen Kerne im Farbbild einen nur schwachen Kontrast zum Hintergrund.

Die Verwendung eines RGB-(Farb)-Bildes mit der Ablage jedes Teilbildes (Rot, Grün, Blau) in einem separaten Bildspeicher der Grafikkarte ermöglichte das Überprüfen der Kontraststärke der östrogen-negativen Zellkerne im jeweiligen Teilbild.

Im Rot-Bild zeigten zwar die östrogen-positiven Kerne maximalen Kontrast, die östrogen-negativen Zellen waren jedoch nahezu unsichtbar. Im Blau-Bild wurden beide Zellarten nicht außerordentlich kontrastreich dargestellt. Im Grün-Bild zeigten die

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Auch zur Segmentierung der AgNORs wurden die drei RGB-Bildkomponenten hinsichtlich des maximalen Kontrastes überprüft und das Rot-Bild gewählt. Der Untersucher sieht diese grünen und roten Teilbilder nicht. Ihm wird während des gesamten Untersuchungsablaufes das native gesamte RGB-Bild präsentiert.

Die Segmentierung sowohl der Kerne als auch der AgNORs erfolgt unter AMBA automatisch mit Hilfe einer Konturfolgerechnung. Die Erkennung des Objektes wird hierbei von einem hierarchischen Klassifikator überwacht. Dem Untersucher wird das jeweilige Segmentierungsergebnis mit Hilfe eines farbigen Overlays angezeigt. Versagt die automatische Segmentierung, ist eine interaktive Korrektur möglich. Mit der Bestätigung der erfolgreichen Segmentierung des jeweiligen Zellkerns oder der AgNORs durch den Untersucher wird im Hintergrund des Programmes der Ver-messungsprozeß des Objektes in Gang gesetzt.

Die Vermessung eines simultan gefärbten Präparates erfolgte grundsätzlich in zwei Arbeitsgängen. Im ersten Schritt wurden nur östrogen-positive Zellen, im zweiten Schritt nur östrogen-negative Zellen vermessen.

Die Klassifikation der Zellen als “östrogen-positiv” oder “östrogen-negativ” erfolgte im Farbbild durch das Auge des Untersuchers. Als “östrogen-positiv” wurden dabei alle Tumorzellkerne bezeichnet, welche eine Rotfärbung zeigten, egal ob sich diese als schwach oder stark darstellte. Als “östrogen-negativ” wurden jene Tumorzellkerne definiert, die keine Rotfärbung aufwiesen.

Es wurden jeweils einhundert Zellen einer Zellklasse in die Messungen einbezogen. Waren weniger als einhundert Zellen einer Klasse verfügbar, wurden nur alle verwert-baren Zellen gemessen.

Die Mikroskop- und Kameraeinstellungen wurden über die gesamte Meßserie konstant gehalten. Es wurde mit Köhlerscher Beleuchtung und vierhundertfacher Ver-größerung (Objektiv×40; Projektiv×10; Bildausschnitt: 105µm×140µm) gearbeitet.

Die prinzipiellen Arbeitsschritte der Vermessung werden im Folgenden kurz erläutert.

1. Zuerst werden im Testpräparat im Vergleich zum HE-Schnitt die entsprechenden Tumorbereiche ausgewählt und markiert.
2. Nach Einstellen des zu vermessenden Bildausschnittes im Präparat erfolgt eine Abstimmung der Helligkeit, des Kontrastes und des Fokus mit visueller Kontrolle des Monitorbildes.
3. Durch den “Scan”-Befehl wird jetzt der gewählte Ausschnitt in den Bildspeicher der Graphikkarte eingelesen.

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4. Die automatische Segmentierung des einzelnen Zellkerns wird eingeleitet, indem man mit der Maus das Fadenkreuz (Cursor) im Monitorbild in Deckung mit der Kontur eines Zellkerns bringt und die linke Maustaste betätigt. Gelingt die automatische Segmentierung nicht sofort, lassen sich die Schwellenwerte für die Konturfolge einfach interaktiv verschieben. Weiterhin besteht die Möglichkeit einer manuellen Konturfolge und des Einfügens von Trennungslinien mit der rechten Maustaste.
5. Die erfolgreiche Kernsegmentierung wird nun mit der mittleren Maustaste bestätigt.
6. Mit dieser Bestätigung wird automatisch die Fläche des Zellkerns bestimmt und nachfolgend die automatische Segmentierung der AgNORs im Zellkern durch-geführt. Der Schwellenwert für die AgNOR-Segmentierung läßt sich an dieser Stelle ebenfalls interaktiv verändern. Aus Standardisierungsgründen wird jedoch diese Schwelle nur einmal pro Präparat eingestellt.
7. Die adäquate AgNOR-Segmentierung wird wiederum mit der mittleren Maustaste bestätigt, womit eine automatische Vermessung der AgNORs hinsichtlich Anzahl, Fläche und Verteilung durchgeführt wird. An dieser Stelle des Programmes besteht die Möglichkeit, eine fehlerhafte Messung des zuletzt vermessenen Zellkerns aus dem Meßprotokoll zu eliminieren.

Es wurden jeweils alle der klassenzugehörigen Tumorzellkerne im Bildauschnitt in die Messungen einbezogen. Nach Abarbeitung eines Ausschnittes wurde zum nächsten Areal gewechselt und mit der Schrittfolge von vorn begonnen.

In einem Datenfenster werden zu jedem Zeitpunkt die Anzahl der schon vermessenen Zellkerne ausgegeben. Abgebrochen wurde entweder nach einhundert Zellen, oder wenn nach Durchsuchen von fünf Gesichtsfeldern kein weiterer östrogen-positiver oder östrogen-negativer Zellkern zu finden war.

3.4.3. Beschreibung der gemessenen AgNOR-Parameter

Anzahlmerkmale:

Nr.	Merkmal	Erklärung	Einheit
1	NORNMB_M	unkorrigierte Anzahl der AgNORs pro Zellkern, d.h. AgNOR-Cluster werden als ein AgNOR gezählt; Mittelwert	Anzahl
2	NORNBC_M	korrigierte Anzahl der AgNORs pro Zellkern, d.h. AgNOR-Cluster werden als zwei AgNORs gezählt; Mittelwert	Anzahl
3-13	NOR_Kx (x=1...10)	Anzahl der Zellkerne mit x AgNORs (11 Gruppen: x=0; x=1; ...; x=10)	Promille

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Flächenmerkmale:

Nr.	Merkmal	Erklärung	Einheit
14	AREA_M	Zellkernschnittfläche; Mittelwert	µm2
15	S_AREA_M	Summe der Schnittflächen aller AgNORs pro Zellkern; Mittelwert	µm2
16	MAXNOR_M	Anschnittsfläche des größten AgNORs im Zellkern; Mittelwert	µm2
17	MEANAR_M	Mittlere Anschnittsfläche der einzelnen AgNORs; Mittelwert (S_AREA_M/NORNBC_M)	µm2
18	SNAR_R_M	Verhältnis der Schnittfläche der einzeln gelegenen AgNORs zur Summenfläche der AgNORs;Mittelwert (MEANAR_M/S_AREA_M)	Promille
19	AR_RAT_M	Verhältnis der AgNOR-Summenfläche zur Zellkernfläche; Mittelwert (S_AREA_M/AREA_M)	Promille
20	MN_RAT1_M	Verhältnis max. AgNOR-Fläche im Zellkern zur Zellkernfläche; Mittelwert (MAXNOR_M/AREA_M)	Promille
21	MN_RAT2_M	Verhältnis max. AgNOR- Fläche zur AgNOR- Summenfläche; Mittelwert (MAXNOR_M/S_AREA_M)	Promille
22	SIZRAT_M	Verhältnis mittlere AgNOR- Fläche pro Kern zur Zellkernfläche; Mittelwert (MEANAR_M/AREA_M)	Promille

Lokalisationsmerkmale: Merkmale, welche die Lage der AgNORs im Zellkern und zueinander beurteilen.

Nr.	Merkmal	Erklärung	Einheit
23	CENTER_M	Anzahl der zentral im Zellkern gelegenen AgNORs; Mittelwert	Anzahl
24	CENT_R_M	Anteil der zentral im Zellkern gelegenen AgNORs an der korrigierten Gesamtzahl der AgNORs; Mittelwert	Promille
25	BORDER_M	Anzahl der randständigen AgNORs pro Zellkern; Mittelwert	Anzahl
26	BORD_R_M	Anteil der randständig gelegenen AgNORs an der korrigierten Gesamtzahl der AgNORs; Mittelwert	Promille
27	LOCAT_M	Abstand der AgNORs vom Zentrum der Ellipse (welche die idealisierte Zellkernform darstellt) im Verhältnis zur langen Achse; Mittelwert	µm2
28-38	LOC_Kx (x=0;100;...;1000)	Anzahl der AgNORs, die innerhalb eines bestimmten Flächenringes mit Ellipsen- bzw. Zellkernzentrum als zentralem Bezugspunkt liegen, Aufteilung des Zellkerns in 11 zirkuläre Flächenbereiche	Anzahl
39	MDIST_M	mittlerer Abstand der AgNORs zueinander; Mittelwert	µm2
40	MAXDIS_M	maximaler Abstand zweier AgNORs zueinander; Mittelwert	µm2

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3.5. Statistik

Die statistische Bearbeitung der erhaltenen Meßwerte wurde mit dem Statistik-programm NCSS 5.1 (copyright 1991 by Dr. Jerry L. Hintze, 329 North 1000 East Kaysville, Utah 84037 [801] 5460445) durchgeführt.

Der im Bildverarbeitungssystem AMBA angelegte Datenfile wurde nach Abschluß der Messungen in ein ASCII-Format transformiert und in NCSS eingelesen.

Zur Ermittlung des Signifikanzniveaus und zum Vergleich der Gruppenmittelwerte wurde der t-Test für gleiche oder ungleiche Varianzen durchgeführt. Lag das Ergebnis des F-Tests bei F>0,1, so wurde der t-Test für gleiche Varianzen durchgeführt. Bei F<0,1 wurde von ungleichen Varianzen ausgegangen.

Korrelationen wurden mit dem Pearson-Korrelationskoeffizienten r für metrische Korrelationen oder dem Spearmans-Korrelationskoeffizienten für Rangkorrelationen überprüft. Die Koeffizienten können dabei Werte zwischen \|-\|1 und +1 annehmen.

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