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Kapitel 5. Diskussion

5.1. Stellenwert von AgNORs und Östrogenrezeptorstatus

Die Prognoseeinschätzung von Tumorkrankheiten ist wesentliche Voraussetzung für eine optimale Therapie. Dazu können sowohl klinische als auch pathohistologische Kriterien herangezogen werden. Jedoch können auch heute selbst durch kombiniertes Betrachten der Prognosefaktoren nur grobe Einschätzungen über den weiteren Krank-heitsverlauf gegeben werden. So ist auch eine Verbesserung der Prognoseeinschätzung beim Mammakarzinom notwendig.

Der sich daraus ableitende Anspruch an die Forschung besteht einerseits in der Suche nach neuen aussagekräftigen Prognoseindikatoren und andererseits in deren Validierung und dem Prädiktivitätsnachweis bereits bekannter putativer Kriterien durch den Vergleich mit verläßlichen Parametern, insbesondere jedoch durch Korrelation mit der Rezidivwahrscheinlichkeit oder Überlebenszeit.

Seit der Etablierung einer verbesserten Färbetechnik durch Ploton et al. 1986 werden AgNORs als Prognosemarker zunehmend interessant. Die große Anzahl von Studien über die Bedeutung von AgNOR-Parametern bei verschiedenen Organtumoren in den letzten Jahren belegt die Aktualität der Problematik [Martin et al. 1991 ]. AgNOR-Merkmale kennzeichnen in erster Linie das Proliferationsverhalten von Tumoren [Martin 1994 ]. Standardarbeiten auf diesem Gebiet bewiesen einen engen Zusammenhang zwischen AgNOR-Mengen und Proliferationsraten verschiedener Organtumoren [Derenzini et al. 1989b und 1990 ]. Ebenfalls sind Hinweise auf die Zelldifferenzierung nachweisbar [Reeves et al. 1984 ].

AgNORs sind bis heute in der Regel nicht Bestandteil der Routinetumordiagnostik des Pathologen. Die Ursachen dafür sind vielfältig.

Die anfänglich fehlende Standardisierung der Methode im Färbe- und Auswertungs-prozeß führte einerseits zu heterogenen Daten innerhalb einer Untersuchungsserie und andererseits zu einer fehlenden Vergleichbarkeit der Ergebnisse zwischen ver-schiedenen Arbeitsgruppen. Das “International Committee on AgNOR-Quantitation” formuliert deshalb seit 1994 Richtlinien zur standardisierten AgNOR-Analyse [Aubele et al. 1994b ].

AgNOR-Mengen können durch eine Vielzahl von Parametern beschrieben werden. Obwohl AgNOR-Anzahlen und AgNOR-Summenflächen diejenigen Parameter sind, welche mit den Tumorproliferationsraten korrelieren [Derenzini et al. 1989b und 1990 ], steht der Nachweis prognostischer Prädiktivität noch aus. Ein Zusammenhang zur Prognose des Mammakarzinoms hinsichtlich Überlebenszeit und metastasenfreiem

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Der Östrogenrezeptorstatus ist ein Routineparameter bei der Beurteilung des Mamma-karzinoms. Praktisch hilft der Östrogenrezeptorstatus bei der Auswahl der Patientinnen, denen eine endokrine Therapie von Nutzen sein kann [Bloom et al. 1980 ]. Die Expression von Östrogenrezeptoren ist grundsätzlich ein Merkmal für höhere Tumordifferenzierung [Remmele et al. 1986 ] und gibt Hinweise auf eine bessere Prognose [Allegra et al. 1979 ].

5.2. Material und Färbetechnik

Als Untersuchungsmaterial wurde in Form von Paraffinblöcken archiviertes Gewebe von Mammakarzinomen gewählt. Durch die Ausschlußkriterien schrumpfte die Anzahl der verfügbaren Fälle letztendlich auf 49.

Hinsichtlich des histologischen Tumortyps entsprechend der WHO-Klassifikation [WHO 1982] wurden ausschließlich duktale und lobuläre Mammakarzinome ver-schiedener histopathologischer Differenzierung einbezogen, um die Frage an einem homogenen Material zu untersuchen und damit die Aussagefähigkeit zu erhöhen. Diese beiden Tumortypen bilden zusammengerechnet ungefähr 87% aller bösartigen Mamma-tumoren.

Die Färbungen für Östrogenrezeptoren und AgNORs sind etablierte Methoden in den histologischen Labors des Instituts für Pathologie der Charité.

Die Östrogenrezeptorfärbung ist eine immunhistochemische Methode und bedient sich monoklonaler Antikörper gegen die Rezeptoren. Seit einigen Jahren besteht die Möglichkeit der Anwendung am Paraffinschnitt. Dazu ist jedoch eine Antigen-demaskierung mit Hilfe von Enzymen oder durch Autoklavieren der Präparate not-wendig.

Die moderne AgNOR-Färbung wird nach der Methode von Ploton et al. 1986 und der Modifizierungen von Öfner et al. 1994 am Paraffinschnitt durchgeführt. Dabei werden die argyrophilen Strukturproteine der Nukleolus-organisierenden Regionen in einem Ein-Schritt-Verfahren versilbert. Für einen kräftigen Färbeerfolg ist auch hier ein Autoklavieren der Proben erforderlich.

Das methodische Ziel lag in einer sinnvollen und reproduzierbaren Verbindung beider Färbemethoden zu einer Simultanfärbung.

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In entsprechenden Vortests wurde die Abhängigkeit des Färbeergebnisses von der Reihenfolge der Färbungen untersucht. Immunhistochemische Färbungen sind empfind-lich gegenüber vielerlei Einflüssen. Das farbige Reaktionsprodukt reagiert nach unseren Erfahrungen zum Beispiel auf eine aufsteigende Alkoholreihe mit einem deutlichen Verbleichen. War der pH-Wert des Zitratpuffers, der zum Autoklavieren verwendet wird, nicht exakt auf 6,0 eingestellt, mußten starke Sensitivitätseinbußen in Kauf genommen werden. Die ersten Testpräparate wurden deshalb zuerst versilbert und nachfolgend immunhistochemisch behandelt, um das empfindliche Farbreaktions-produkt der Immunfärbung zu schützen. Entgegen unserer Hypothese zeigten sich bei dieser Abfolge nur schwache und blasse Farben. Wahrscheinlich werden durch die Chemikalien der Versilberungsreaktion entweder die Epitope des primären Anti-Östrogenrezeptor-Antikörper alteriert oder das farbige Reaktionsprodukt chemisch umgesetzt. Wurde die Östrogenrezeptorfärbung zuerst durchgeführt, erhielt sich eine kräftige Rotfärbung auch über die AgNOR-Reaktion hinaus. Somit wurde diese Variante für die Färbung der Präparate eingesetzt. Die AgNOR-Markierung selbst zeigte sich von der Reihenfolge der Färbungen mikroskopisch unbeeinflußt.

Der Fixierungs- und Einbettungsprozeß in Paraffin hat für Gewebe verschiedene Konsequenzen. Einerseits zeigt sich im Vergleich zum Gefrierschnitt eine deutlich verbesserte Histomorphologie. Andererseits kommt es zu einem beträchtlichen Sensitivitätsverlust für alle immunhistochemischen Protein- und Rezeptornachweise. Die Ursache dafür scheint in einer Veränderung der Oberflächenstruktur der betroffenen Proteine durch Fixierung und Einbettung zu liegen. Der Anti-Rezeptor-Antikörper “findet” folglich sein Epitop nicht mehr. Ein ähnlicher Prozeß scheint sich bei den AgNOR-Proteinen abzuspielen, denn die Silberimprägnationen fallen bei Paraffin-schnitten grundsätzlich schwächer aus. Unabhängig voneinander beschrieben Arbeits-gruppen die Demaskierung der alterierten Proteinstrukturen durch reine Energiezufuhr zum Beispiel mit Hilfe des Autoklavierens für die Immunhistochemie [Bier et al. 1995 ] und auch für die Versilberung [Öfner et al. 1994 ]. Da also für beide Teilfärbungen ein Autoklavieren erforderlich ist, wurde dieser Arbeitsschritt nur einmal vor Durchführung beider Färbungen angewendet.

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5.3. Meßmethodik

Die digitale Bildanalyse ist die Methode der Wahl zur Quantifizierung von AgNOR-Mengen [Aubele et al. 1994b ]. Neben Präzision und hoher Reproduzierbarkeit bietet sie die Möglichkeit der Erfassung einer ganzen Reihe von beschreibenden AgNOR-Parametern. Die AgNOR-Konfiguration läßt sich durch Anzahl-, Flächen-, und Lageparameter charakterisieren. Praktisch wichtig sind vor allem AgNOR-Flächenparameter, da sie gut reproduzierbar sind und unabhängig von verschiedenen Färbe- und Meßeinflußfaktoren einen Ergebnisvergleich verschiedener Arbeitsgruppen ermöglichen, insbesondere wenn sie relativ betrachtet werden. Das ist ein weiterer entscheidender Vorteil im Vergleich zur Zählmethode, wo nur AgNOR-Anzahlen mit dem Auge des Untersuchers ermittelt werden können. Doch selbst diese Zählung wird von der Erfahrung des Untersuchers beeinflußt, hat also eine subjektive Komponente.

Seit 1989 werden im Labor für Automatisierte Mikroskopbildanalyse des Instituts für Pathologie der Charité AgNORs mit dem Bildverarbeitungssystem AMBA vermessen. Jedoch wurden alle Messungen bisher an einem Schwarz-Weiß-System durchgeführt. Im Schwarz-Weiß-Bild des Monitors sind östrogen-positive und östrogen-negative Zellen nicht voneinander zu unterscheiden. Deshalb wurde die Problemstellung mit dem Farb-Bildverarbeitungssystem AMBA gelöst.

Die Darstellung des histologischen Bildauschnitts als Farbbild ermöglicht eine einfache Separation von östrogen-positiven und östrogen-negativen Zellen. Als problematisch stellte sich zunächst die Zellkernsegmentierung heraus. Das Segmentieren ist ein Verfahren der Bildanalyse, welches dem Rechner ermöglicht, ein gewähltes Objekt auch zu “erkennen”, also aus dem Bildzusammenhang zu segmentieren. Für die Segmentierung sind spezielle Merkmale des Objektes nötig. Zur Zellkernsegmentierung lassen sich geometrische (Form; Größe) und densitometrische (Extinktionen) Parameter sowie Texturmerkmale und die Farbe heranziehen. Das Farbbild bot jedoch nur suboptimale Bedingungen zur Segmentierung der “zartgelben” östrogen-negativen Zellen. Dieses Farbbild besteht aus drei Teilbildern (Rot-; Grün-; Blaubild), welche jeweils in einem separaten Bildspeicher der Grafikkarte abgelegt werden. Alle Teilbilder wurden einzeln nach ihren Segmentierungsbedingungen überprüft. Im Grün-Bild zeigten östrogen-negative Zellen optimale Voraussetzungen. Die “roten” östrogen-positiven Zellen wiesen im Grün-Bild einen noch hinreichend starken Kontrast auf.

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Alle diese Erfahrungen wurden im Meßprogramm AMBA\ orcolor umgesetzt und mit dem vorhandenen AgNOR-Vermessungsprogramm kombiniert. Mit dem Programm AMBA\ orcolor ist es möglich, AgNORs in beliebig verschiedenfarbig markierten Zellkernen zu vermessen. Dabei konnte ein optimales Verhältnis zwischen Auto-matisierung des Meßprozesses und sinnvoller Interaktivität hergestellt werden.

5.4. Gegenseitige Beeinflussung der Färbemethoden

Ein zentraler Teil dieser Studie bestand in der Untersuchung der Frage, ob sich Östrogenrezeptormarkierung und AgNOR-Färbung beeinflussen. Dabei war theoretisch sowohl ein Einfluß der Rezeptorfärbung auf das AgNOR-Färbeergebnis als auch umgekehrt eine Veränderung der Östrogenrezeptormarkierung durch die AgNOR-Versilberungsreaktion zu untersuchen.

Um einen möglichen gegenseitigen Einfluß nachzuweisen, wurden serielle Schnitte von zehn Testfällen mit den jeweiligen Einzelfärbungen und der Simultanfärbung behandelt und nachfolgend im Vergleich untersucht.

Zuerst wurde die AgNOR-Ausstattung von Tumorzellen von Präparaten mit Simultanfärbung und mit einzelner AgNOR-Färbung am Bildanalysesystem bestimmt. Weder hinsichtlich der AgNOR-Anzahlen noch der AgNOR-Summenflächen zeigten sich signifikante Unterschiede. Es konnte somit geschlußfolgert werden, daß die AgNOR-Darstellung durch die zusätzliche Östrogenrezeptormarkierung nicht beeinflußt wird. AgNORs in immunhistochemisch markierten Zellen sind also im Vergleich zu den AgNORs in allein versilberten Präparaten unverändert.

Munakata et al. 1994 versuchten ebenfalls eine kombinierte Färbemethode für immunhistochemische und AgNOR-Markierungen zu etablieren. Anstatt der Östrogen-rezeptoren wurde das Ki-67-Antigen dargestellt. Die Untersuchung der gegenseitigen Beeinflussung der Färbemethoden wurde weitgehend analog zur hier angewandten Methode durchgeführt. Jedoch zeigten sich hinsichtlich der AgNOR-Flächen hoch-signifikante Unterschiede zwischen einerseits simultan Ki-67- und AgNOR-gefärbten Zellen und andererseits einzeln AgNOR-markierten Zellen. Die mittleren AgNOR-Flächen pro Zellkern waren bei simultan gefärbten Zellen deutlich größer. Keinen signifikanten Unterschied gab es beim Vergleich der mittleren AgNOR-Anzahlen. Es besteht jedoch kein Widerspruch zu unseren Ergebnissen. Munakata et al. 1994 verwendeten zur Antigendemaskierung der Ki-67-Epitope im Paraffinschnitt eine Mikrowellenbestrahlung. Diese Technik wurde zwangsläufig bei der Simultanfärbung,

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Der mögliche Einfluß der AgNOR-Reaktion auf die Markierung der Östrogenrezeptoren wurde in einem zweiten Teil dieser Reproduzierbarkeitsstudie untersucht. Dazu wurden fünf östrogen-negative und fünf östrogen-positive Testfälle einerseits simultan gefärbt und andererseits nur mit der Rezeptorfärbung behandelt.

Bei den fünf östrogen-negativen Testfällen konnten auch nach durchgeführter Simultanfärbung keine östrogen-positiven Zellen nachgewiesen werden. Demnach führt die zusätzliche AgNOR-Reaktion zu keiner Sensitivitätserhöhung der Rezeptor-markierung. Bei den fünf östrogen-positiven Testfällen wurden in den simultan gefärbten und einzeln östrogen-markierten Präparaten die Anzahlen positiv markierter Zellen pro Gesichtsfeld mit einem Zählprogramm im Vergleich bestimmt. Auch hier gab es keinen signifikanten Unterschied zwischen beiden Vergleichsgruppen. Das bedeutet, daß es durch die zusätzliche AgNOR-Reaktion auch zu keinem Sensitivitäts-verlust kommt. Da die AgNOR-Reaktion zeitlich nach der Östrogenrezeptorfärbung durchgeführt wird, ist ein Einfluß auf die Spezifität der Östrogenrezeptormarkierung sehr unwahrscheinlich. Auch Munakata et al. 1994 konnten keinen Einfluß der AgNOR-Reaktion auf die immunhistochemische Markierung feststellen.

Es wurde somit nachgewiesen, daß keine gegenseitige Beeinflussung von AgNOR-Reaktion und Östrogenrezeptorfärbung stattfindet. Damit waren Vermessungen von AgNORs in immunhistochemisch markierten Zellen methodisch gerechtfertigt.

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5.5. Unterschiede zwischen östrogen-positiven und östrogen-negativen Zellen

Im eigentlichen Meßteil dieser Studie wurden die AgNORs in Tumorzellen von 49 Mammakarzinomen am Bildverarbeitungssystem mit Hilfe des Programms AMBA\ or-color vermessen. Die Meßdaten für östrogen-negative und östrogen-positive Zellen wurden dabei separat erfaßt und abgelegt. Der nachfolgende Vergleich beider Zell-populationen zeigte hochsignifikante Unterschiede in vielen beschreibenden AgNOR-Parametern.

Östrogen-negative Zellen und östrogen-positive Zellen des Mammakarzinoms unter-scheiden sich hinsichtlich ihrer AgNOR-Anzahlen . Dabei zeigen östrogen-negative Zellen deutlich höhere Anzahlen einzelner AgNORs. Der größte Anteil östrogen-negativer Zellen hat drei AgNORs im Zellkern. Dagegen weisen die meisten östrogen-positiven Zellen nur ein AgNOR oder AgNOR-Cluster auf. Große AgNOR-Anzahlen sind Merkmale von Zellen niedrigen Differenzierungsgrades [Reeves et al. 1984 ]. Die Korrelation zwischen AgNOR-Anzahlen und Tumorproliferationsraten [Derenzini et al. 1989b ] kennzeichnet die östrogen-negativen Tumorzellen als stärker proliferierende Subpopulation. Umgekehrt weisen die niedrigeren AgNOR-Anzahlen bei östrogen-positiven Zellen auf eine geringere Proliferationstendenz und damit auch auf eine verbesserte Prognose.

Unterschiede bestehen ebenfalls bei den AgNOR-Flächen . Jedoch sind diese Ausdruck komplexer Zusammenhänge, welche durch die etablierten Parameter nur ungenügend beschrieben werden können. Die AgNOR-Summenfläche pro Zellkern bei östrogen-negativen Zellen sind zwar geringfügig, jedoch signifikant geringer als bei östrogen-positiven Zellen. Dies steht auf den ersten Blick im Widerspruch zu dem Ergebnis, daß östrogen-negative Zellen im Mittel höhere AgNOR-Anzahlen besitzen. Die Betrachtung weiterer Flächenparameter bietet jedoch ein Erklärungsmodell.

1. Die Flächen der einzeln liegenden AgNORs sind bei östrogen-negativen Zellen kleiner als bei östrogen-positiven Zellen.
2. Die Fläche des größten AgNORs im Zellkern ist bei östrogen-positiven Zellen weitaus größer als bei östrogen-negativen Zellen. Es zeigte sich aber, daß die bei östrogen-positiven Zellen gemessenen “größten AgNORs” so große Flächen aufwiesen, daß sie keinen Einzel-AgNORs entsprechen konnten. Diese großen Flächen entsprechen AgNOR-Clustern. Durch diese verstärkte Clusterung bei östrogen-positiven Zellen kommt es aber bekanntlich zu einem optischen “Ineinanderfließen” der Einzelstrukturen und damit zu einem methodisch bedingten Überschätzen der wahren Fläche (siehe Kapitel 1.2; Seite 9-10).

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Da aber die AgNOR-Summenfläche pro Zellkern bei östrogen-positiven Zellen durch den clusterungsbedingten Fehler zu groß bestimmt wird, ist eine Diskussion und Interpretation dieser Meßwerte im Vergleich zu den östrogen-negativen Zellen nicht zulässig. Jedoch lassen sich andere Schlußfolgerungen ziehen. Reeves et al. 1984 zeigten, daß niedrig differenzierte Zellen Einzel-AgNORs geringerer Fläche im Vergleich zu Zellen höherer Differenzierung aufweisen. Da die Einzel-AgNORs östrogen-negativer Zellen bei der vorliegenden Untersuchung deutlich kleiner als bei östrogen-positiven Zellen sind, ist dies ein weiterer Beleg höherer Malignität der östrogen-negativen Zellen.

Bei östrogen-positiven Zellen des Mammakarzinoms kommt es zu einem besonderen Clusterungsphänomen . Rüschoff et al. 1994 beobachteten eine starke Clusterung der AgNORs ausschließlich in hochdifferenzierten Zellen von Urothelzellinien. Dies steht im Einklang mit den vorliegenden Untersuchungen am Mammakarzinom. Man kann davon ausgehen, daß östrogen-positive Zellen im Vergleich zu östrogen-negativen Zellen höher differenziert sind [Remmele et al. 1986 ; Osborne et al. 1990 ]. Eine ausgeprägte Clusterung war nur bei östrogen-positiven Zellen zu finden. Damit wäre im allgemeinen die Clusterung von AgNOR-dots im Zellkern als ein weiteres Kriterium einer höheren Zelldifferenzierung aufzufassen.

Östrogen-negative und östrogen-positive Zellen unterscheiden sich auch in der räumlichen Lage ihrer AgNORs im Zellkern. Da auch AgNOR-Anzahlen und Clusterungsphänomene die AgNOR-Lageparameter beeinflussen, lassen sich diese Ergebnisse jedoch nur schwer interpretieren oder verallgemeinern.

Variationskoeffizienten ausgewählter AgNOR-Merkmale beschreiben die Variabilität der Meßwerte und die Reproduzierbarkeit der Meßmethode [Öfner et al. 1995c ] und haben auch prognostische Relevanz im Hinblick auf den weiteren Verlauf einer Tumorkrankheit [Aubele et al. 1994a ]. Obwohl diese Parameter offensichtlich auch biologische Sachverhalte beschreiben, besteht weiterhin Uneinigkeit über deren direkte Aussagekraft. Weiterhin sind Variationskoeffizienten relativ unabhängig gegenüber verschiedenen Störeinflüssen. Auch hier konnten deutliche Unterschiede zwischen den beiden untersuchten Zellgruppen festgestellt werden. Die Variationskoeffizienten der mittleren korrigierten AgNOR-Anzahl sowie der mittleren Fläche des größten AgNORs bei östrogen-negativen und östrogen-positiven Zellen sind hochsignifikant verschieden. Diese Unterschiede belegen also auf den Tumor selbst bezogen nicht nur das Vorhandensein verschiedener AgNOR-Verteilungsmuster, sondern sie geben ebenfalls

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Die Untersuchung möglicher Zusammenhänge zwischen AgNOR-Parametern und der Östrogenpositivität des Tumors (beschrieben durch den Estrogen-Receptor-Immuno-Cytochemical-Assay) zeigte weitere wichtige Zusammenhänge. Dazu war jedoch wiederum die Unterscheidung von östrogen-negativen und östrogen-positiven Zellen notwendig, da sich bei der Gegenüberstellung mit dem Gesamttumor keine oder nur sehr schwache Korrelationen zeigten. Je größer die Östrogenpositivität des Tumors ist, desto geringer ist bei östrogen-negativen Zellen die mittlere AgNOR-Anzahl. Das bedeutet, daß eine höhere Differenzierung des Gesamttumors mit einer niedrigeren Proliferationstendenz auch der maligneren, östrogen-negativen Zellen einhergeht. Das gilt ebenso umgekehrt. Die AgNOR-Ausstattung östrogen-positiver Zellen korreliert nicht mit dem ER-ICA. Ihre AgNOR-Anzahlen bewegen sich hier unabhängig von der Positivität des Gesamttumors immer auf niedrigem Niveau und steigen auch bei sehr geringen ER-ICA-Werten nicht an. Man kann daraus schlußfolgern, daß die Population östrogen-positiver Zellen nur einen geringeren Beitrag zur Proliferation und Progression des Tumors leistet. Je höher also der Anteil östrogen-positiver Zellen ist, desto geringer ist die Proliferationstendenz des Tumors. Gleichzeitig wird mit steigender Östrogen-positivität des Tumors das Teilungsverhalten der östrogen-negativen Zellen einge-schränkt.

Bei der Betrachtung östrogen-positiver Zellen fiel auf, daß mit zunehmender Östrogenpositivität des Tumors die Flächen der AgNOR-Cluster größer werden. Dies ist ein weiterer Beleg dafür, daß eine höhere Zelldifferenzierung mit einer verstärkten Clusterung von AgNORs einhergeht.

Interessante Ergebnisse lieferte auch die Untersuchung von Zusammenhängen zwischen AgNOR-Parametern und anderen histopathologischen Malignitätskriterien des Tumors. Dazu wurden die AgNOR-Merkmale (getrennt betrachtet für “Gesamttumor”, “Östrogen-negative Zellen” und “Östrogen-positive Zellen”) dem Kerngrading nach Black und Asire [Black et al. 1957 ], dem histopathologischen Grading nach Bloom und Richardson [Bloom et al. 1957 und 1962 ] sowie der Mitoserate und der immunhistochemisch bestimmten Wachstumsfraktion (Ki-67) gegenübergestellt. Zusammenhänge konnten nur bei der korrigierten AgNOR-Anzahl und der AgNOR-Summenfläche pro Zellkern festgestellt werden. Diese korrelierten aber mit allen der genannten Malignitätsmarkern. Überraschend zeigte sich jedoch, daß hohe Korrelationen ausschließlich beim Vergleich mit der östrogen-negativen Zellpopulation zu verzeichnen waren. Je maligner sich das Mammakarzinom darstellt, desto größer ist bei östrogen-negativen Zellen die AgNOR-Anzahl und die AgNOR-Summenfläche. Demnach sind in diesem Kontext die mittlere korrigierte AgNOR-Anzahl pro Zellkern und die mittlere AgNOR-Summenfläche pro Zellkern als zusätzliche Malignitäts-kriterien des Mammkarzinoms aufzufassen. Die Tatsache, daß die AgNOR-Ausstattung östrogen-positiver Zellen von diesen Zusammenhängen unbeeinflußt bleibt, unter-streicht nochmals ihre untergeordnete Rolle im Hinblick auf die Tumorprogression.

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5.6. Beziehungen zwischen Östrogenrezeptoren und Wachstumsfraktion beim Mammakarzinom

Auf die Beziehungen zwischen Östrogenrezeptorstatus und Wachstumsfraktion (Ki-67) des Tumors kann weiterhin nur indirekt über die AgNOR-Mengen geschlußfolgert werden.

Der Zusammenhang zwischen der Wachstumsfraktion (Ki-67) und den AgNOR-Mengen wird heute allgemein anerkannt. Dervan et al. 1989 und Rüschoff et al. 1990 konnten beim Mammakarzinom deutliche Korrelationen zwischen AgNOR-Anzahlen beziehungsweise AgNOR-Summenflächen und dem Ki-67-Index nachweisen.

Nach den Ergebnissen der vorliegenden Studie korrelieren AgNOR-Anzahlen und AgNOR-Summenflächen ebenfalls deutlich mit der Wachstumsfraktion des Tumors. Dies gilt jedoch nur für die östrogen-negative Zellfraktion.

Munakata et al. 1994 und Haroske et al. 1996b konnten in ähnlichen Studien mit einer Simultanfärbung des Ki-67-Antigens und der AgNORs nachweisen, daß Zellen die zur Wachstumsfraktion des Tumors gehören, deutlich höhere AgNOR-Anzahlen und AgNOR-Flächen aufweisen als Ki-67-negative Zellen.

Betrachtet man nun die vorliegenden Ergebnisse, welche die östrogen-negative Zellpopulation als Subgruppe mit stark erhöhten AgNOR-Anzahlen identifiziert und zieht weiterhin die Korrelation der AgNOR-Mengen östrogen-negativer Zellen zur Wachstumsfraktion hinzu, so legt dies einen Zusammenhang zwischen Wachstums-fraktion und östrogen-negativen Zellen des Mammkarzinoms nahe. Eine Identität zwischen Wachstumsfraktion und östrogen-negativer Zellgruppe ist eher unwahr-scheinlich. Jedoch könnte die Wachstumsfraktion der Tumorzellen eine Teilmenge der östrogen-negativen Zellfraktion sein (oder umgekehrt). Der Nachweis bleibt weiteren Untersuchungen vorbehalten.

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5.7. Schlußfolgerungen und Konsequenzen für die AgNOR-Vermessung beim Mammakarzinom

Östrogen-negative und östrogen-positive Zellen des Mammakarzinoms unterscheiden sich deutlich hinsichtlich ihrer AgNOR-Ausstattung (siehe Tabelle 12).

Tab. 12 Hauptunterschiede zwischen östrogen-negativen und östrogen-positiven Zellen hinsichtlich ihrer AgNOR-Merkmale.

AgNOR-Merkmal	Östrogen-neg. Zellen	Östrogen-pos. Zellen
• Anzahl	hoch	niedrig
• Größe	kleiner	größer
• Clusterung	gering	ausgeprägt

Die AgNORs östrogen-negativer Zellen des Mammakarzinoms haben spezielle Eigen-schaften. Im Kontext mit anderen Eigenschaften lassen sie sich als “bösartigere” und möglicherweise prognosebestimmende Zellfraktion charakterisieren.

1. Die östrogen-negative Zellpopulation ist dabei die Subgruppe mit einer im Vergleich erhöhten Proliferationstendenz. Dies basiert in erster Linie auf dem Vorhandensein deutlich größerer AgNOR-Mengen im Zellkern. Die Unter-suchungen von Derenzini et al. 1989b und 1990 weisen klare Beziehungen zwischen AgNOR-Mengen und Tumorproliferationsraten nach.
2. Weiter untermauert werden diese Thesen durch die Korrelationen zwischen den AgNOR-Mengen östrogen-negativer Zellen und anderen Malignitätskriterien, unter anderem dem Bloom-Richardson-Grading und der Wachstumsfraktion (Ki-67).
3. Bei östrogen-negativen Zellen sind bestimmte Differenzierungsmerkmale nicht vorhanden (Östrogenrezeptoren, AgNOR-Clusterung).
4. Es besteht wahrscheinlich eine Beziehung zwischen östrogen-negativen Zellen und der Wachstumsfraktion (Ki-67) des Tumors.

Folglich haben östrogen-negative Zellen wahrscheinlich einen stärkeren Einfluß auf die Progression der Tumorkrankheit und damit auf die Prognose. Der Beweis dafür konnte am vorliegenden Tumormaterial leider nicht erbracht werden, da noch keine follow-up-Daten zur Verfügung stehen. Das ist ein weiterer Anstoß für zukünftige Unter-suchungen.

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1. Diese Zellgruppe ist vor allem durch ihre niedrigeren AgNOR-Anzahlen gekenn-zeichnet und damit auch geringer proliferationsaktiv. Diese AgNOR-Mengen bewegen sich unabhängig von der Östrogenpositivität des Gesamttumors immer auf niedrigem Niveau und steigen auch bei sehr geringen ER-ICA-Werten nicht an.
2. Weiterhin sind östrogen-positive Zellen Träger verschiedener Merkmale einer höheren Zelldifferenzierung (Vorhandensein von Östrogenrezeptoren, AgNOR-Clusterung).
3. Es zeigten sich keine oder nur sehr schwache Korrelationen der AgNOR-Merkmale zu wichtigen Malignitätskriterien des Tumors.
4. Sobald ein Mammakarzinom östrogen-positive Anteile besitzt, ist selbst die Größe des prozentualen Anteils der östrogen-positiven Zellen sowie die Graduierung der Färbeintensität von untergeordnetem Interesse, da sie keine zusätzlichen prognostischen Informationen beinhalten [Bojar 1995 ].

Es ist mit hoher Wahrscheinlichkeit sinnvoll, nur die Zellpopulation zu isolieren und zu untersuchen, welche die Prognose der Tumorkrankheit diktiert. Demnach ist eine AgNOR-Vermessung ausschließlich in den östrogen-negativen Tumoranteilen vorzuschlagen.

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