Günther, Lukas: Thema: “Charakterisierung des Proliferationsverhaltens östrogen-positiver und östrogen-negativer Zellen des Mammakarzinoms durch Vermessung argyrophiler Nukleolus-organisierender Regionen (AgNORs)”

Aus dem Institut für Pathologie (Rudolf-Virchow-Haus)

des Universitätsklinikums Charité

der Humboldt-Universität zu Berlin

Direktor Prof. Dr. M. Dietel


Dissertation
Thema: “Charakterisierung des Proliferationsverhaltens östrogen-positiver und östrogen-negativer Zellen des Mammakarzinoms durch Vermessung argyrophiler Nukleolus-organisierender Regionen (AgNORs)”

Zur Erlangung des akademischen Grades doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Humboldt-Universität zu Berlin

von Herrn Lukas Günther , geb. am 11.05.1971 in Suhl

Dekan: Prof. Dr. med. M. Dietel

Gutachter:
Prof. Dr. med. H. Guski
Prof. Dr. med. H. Martin
PD Dr. med. G. Haroske

eingereicht: Juni 1997

Datum der Promotion: 19.12.1997

Schlagwörter:
AgNORs, Estrogenrezeptoren, Mammakarzinom, Bildanalyse

Keywords:
AgNORs, Estrogen receptors, breast cancer, Image analysis

Zusammenfassung

Es wurde eine neue Färbemethode zur simultanen Darstellung von Estrogenrezeptoren (ER) und argyrophilen Nukleolus-organisierenden Regionen (AgNORs) entwickelt, um die Proliferationscharakteristika ER-positiver und ER-negativer Tumorzellen unabhängig voneinander zu bestimmen. Um eine mögliche gegenseitige Beeinflussung beider Färbemethoden auszuschließen wurden Serienschnitte 10 invasiv duktaler Mammakarzinome entweder mit einer der einzelnen Methoden oder mit der Simultanfärbemethode ER/AgNORs gefärbt und nachfolgend vergleichend untersucht. Durch Vermessung der histologischen Schnitte mit Hilfe der digitalen Bildanalyse konnten reziproke Effekte ausgeschlossen werden. Es konnte nachgewiesen werden, daß die simultane Färbung beider Marker zu einem reproduzierbaren und spezifischen Färberesultat führt. Es ist somit gerechtfertigt, AgNORs in immunhistochemisch gefärbten Zellen zu messen.

Histologische Schnitte von 49 invasiven Mammakarzinomen wurden simultan für ER und AgNORs gefärbt. In jeweils 100 ER-positiven und ER-negativen Tumorzellkernen wurden die AgNORs mit Hilfe des Bildverarbeitungssystems AMBA vermessen. Zur Quantifizierung der AgNORs in immunhistochemisch gefärbten Zellkernen wurde das Programm AMBA\ orcolor angewendet. Die AgNOR-Konfiguration wird beschrieben durch Anzahl, Fläche und räumliche Verteilung innerhalb des Zellkerns. Zwischen ER-positiven und ER-negativen Zellen bestehen hochsignifikante Unterschiede. ER-negative Zellen des Mammakarzinoms besitzen eine größere Anzahl AgNORs (3,06 *0,67) verglichen mit den ER-positiven Zellen (1,65 *0,34). Nur die AgNOR-Parameter der ER-negativen Zellfraktion korrelierten mit anderen Malignitätsmarkern (Bloom-Richardson-Grading; Wachstumsfraktion (Ki-67)). Die ER-negativen Zellen lassen sich als Zellfraktion mit höherer Proliferationsaktivität charakterisieren. Die Ergebnisse zeigen, daß die ER-negativen Zellen des Mammakarzinoms einen entscheidenden Beitrag zur Tumorproliferation leisten und sehr wahrscheinlich die Progression der Tumorerkrankung bestimmen.

Summary

A new staining method for simultaneous demonstration of Estrogen receptors (ER) and argyrophilc Nucleolus-Organizer Regions (AgNORs) was developed to measure the proliferation characteristics of ER-positive and ER-negative tumour cell independently. To rule out possible reciprocal effects of the two staining procedures serial slides of 10 invasive ductale breast cancers were stained with either the single staining methods or the simultaneous ER/AgNOR-staining method and investigated comparatively. Measuring the slides by means of image analysis reciprocal effects could be excluded. It could be proved that a simultaneous staining of both markers leads to a reproducible and specific staining result. It is concluded that it is justified to measure AgNORs in immunohistochemically stained cells.

Specimens of 49 invasive breast cancers were stained simultaneously for Estrogen receptors (ER) and argyrophilc Nucleolus-Organizer Regions (AgNORs). AgNORs in 100 ER-positive and 100 ER-negative tumour cell nuclei were measured by means of the image analysis system AMBA. For the quantification of AgNORs within immunohistochemically stained nuclei the measuring program AMBA\ orcolor was used. AgNOR number, area and distribution within the nucleus describe the AgNOR-configuration. Highly significant differences between ER-positive and ER-negative tumour cells were found. ER-negative breast cancer cells have a larger amount of AgNORs within their nuclei (3,06 *0,67) compared to ER-positive cells (1,65 *0,34). A special clustering phenomenon in ER-positive cells was found. Only the AgNOR-parameters of the ER-negative cell fraction were found to be associated with other indicators of malignancy (Bloom-Richardson-Grading; Growth-Fraction (Ki-67)).

The ER-negative cells of breast cancer are characterised as the cell fraction with a higher proliferation activity. The results indicate that the ER-negative cells of breast cancer mainly contribute to the tumour proliferation characteristics and most likely to the progression of the tumour disease


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Inhaltsverzeichnis

TitelseiteThema: “Charakterisierung des Proliferationsverhaltens östrogen-positiver und östrogen-negativer Zellen des Mammakarzinoms durch Vermessung argyrophiler Nukleolus-organisierender Regionen (AgNORs)”
1 Einleitung
1.1.Prognosefaktoren beim Mammakarzinom
1.2.Nukleolus-organisierende Regionen (NORs)
1.3.Hormonrezeptorstatus
1.4.Zusammenhänge zwischen AgNOR-Ausstattung und Östrogenrezeptorstatus beim Mammakarzinom
2 Aufgabenstellung
3 Material und Methoden
3.1.Patientengut und Untersuchungsmaterial
3.2.Aufarbeitung des Materials
3.3.Die Simultanfärbung
3.3.1.Die Östrogenrezeptorfärbung - eine immunhistochemische Technik
3.3.2.Die AgNOR-Färbung - eine Versilberungstechnik
3.3.3.Das Färberesultat
3.4.Meßmethodik
3.4.1.Das Bildverarbeitungssystem AMBA
3.4.2.Interaktive AgNOR-Vermessung mit dem Programm AMBA\norcolor
3.4.3.Beschreibung der gemessenen AgNOR-Parameter
3.5.Statistik
4 Ergebnisse
4.1.Beeinflussung der Meßergebnisse durch die Simultanfärbung
4.1.1.Einfluß der Simultanfärbung auf die AgNOR-Darstellung
4.1.2.Einfluß der Simultanfärbung auf die Östrogenrezeptormarkierung
4.2.Unterschiede zwischen östrogen-positiven und östrogen-negativen Zellen hinsichtlich ihrer AgNOR-Ausstattung
4.2.1.AgNOR-Anzahl
4.2.2.AgNOR-Flächen
4.2.3.AgNOR-Lage
4.3.Das Verhalten der Variationskoeffizienten ausgewählter AgNOR-Merkmale
4.4.Beziehungen zwischen AgNOR-Ausstattung und Östrogenrezeptorstatus des Tumors
4.5.Beziehungen zwischen AgNOR-Merkmalen und anderen Malignitätskriterien
5 Diskussion
5.1.Stellenwert von AgNORs und Östrogenrezeptorstatus
5.2.Material und Färbetechnik
5.3.Meßmethodik
5.4.Gegenseitige Beeinflussung der Färbemethoden
5.5.Unterschiede zwischen östrogen-positiven und östrogen-negativen Zellen
5.6.Beziehungen zwischen Östrogenrezeptoren und Wachstumsfraktion beim Mammakarzinom
5.7.Schlußfolgerungen und Konsequenzen für die AgNOR-Vermessung beim Mammakarzinom
6 Zusamenfassung
Bibliographie A Literaturverzeichnis
Danksagung
Lebenslauf
Selbständigkeitserklärung

Tabellenverzeichnis

Tab. 1 Haupt-AgNOR-Proteine während Mitose und Interphase (nach Roussel et al. 1994 siehe )
Tab. 2 Einflußfaktoren auf das AgNOR-Färbeergebnis. (modifiziert nach Rüschoff 1992 siehe )
Tab. 3 Übersicht über die wichtigsten Methoden der semiquantitativen Evaluierung des Färbeergebnisses.
Tab. 4 Hardwareprofil des Bildverarbeitungssystems AMBA
Tab. 5 Mittlere AgNOR-Anzahlen und mittlere AgNOR-Summenflächen bei Einzelfärbung und Simultanfärbung.
Tab. 6 Verhalten des Variationskoeffizienten CV in Abhängigkeit von der Anzahl der ausgezählten Gesichtsfelder.
Tab. 7 Mittelwert und Standardabweichung sowie Signifikanzniveau p (t-Test) der AgNOR-Anzahlparameter.
Tab. 8 Mittelwert und Standardabweichung sowie Signifikanzniveau p (t-Test) der AgNOR-Flächenparameter
Tab. 9 Mittelwert und Standardabweichung sowie Signifikanzniveau p (t-Test) der AgNOR-Lageparameter.
Tab. 10 Mittelwert und Standardabweichung sowie Signifikanzniveau p (t-Test) der Variationskoeffizienten (CV) ausgewählter AgNOR-Lageparameter.
Tab. 11 Korrelation zwischen AgNOR-Merkmalen (bezogen auf “Gesamttumor”, “Östrogen-positive Zellen” und “Östrogen-negative Zellen”) und anderen histopathologischen Malignitätskriterien.
Tab. 12 Hauptunterschiede zwischen östrogen-negativen und östrogen-positiven Zellen hinsichtlich ihrer AgNOR-Merkmale.

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1 Zellen eines G2-differenzierten Mammakarzinoms. Simultanfärbung für Östrogenrezeptoren und AgNORs. 105µm×140µm
Abb. 2 Blockschaltbild des Bildverarbeitungssystems AMBA
Abb. 3 Korrelation zwischen der mittleren korrigierten AgNOR-Anzahl pro Zellkern bei AgNOR-Einzelfärbung (NORNBC_M einzel) und Simultanfärbung (NORNBC_M simultan).
Abb. 4 Korrelation zwischen den mittleren AgNOR-Summenflächen pro Zellkern bei AgNOR-Einzelfärbung (S_AREA_M einzel) und Simultanfärbung (S_AREA_M simultan).
Abb. 5 Reproduzierbarkeit der Bestimmung der Anzahl markierter Zellen pro Gesichtsfeld in Abhängigkeit von der Anzahl der ausgezählten Gesichtsfelder für einen Testfall. Die grüne Linie markiert den Mittelwert. Die roten Linien stellen das Verhalten der Variationskoeffizienten CV gemittelt über 5 Testfälle dar.
Abb. 6 Korrelation zwischen Gesamtanzahl östrogen-positiver Zellen in sechs Gesichtsfeldern bei einzelner Östrogenrezeptorfärbung (Anzahl einzel) und Simultanfärbung (Anzahl simultan).
Abb. 7 Mittlere korrigierte AgNOR-Anzahl pro Zellkern (NORNBC_M) bei östrogen-negativen (ER neg) und östrogen-positiven (ER pos) Zellen.
Abb. 8 Relative Zellkernanzahlen mit n AgNORs pro Zellkern (n=1;2;3;4;5) bei östrogen-negativen und östrogen-positiven Zellen.
Abb. 9 Mittlere AgNOR-Summenfläche pro Zellkern (S_AREA_M) [µm2] bei östrogen-negativen (ER neg) und östrogen-positiven (ER pos) Zellen.
Abb. 10 Mittlere Flächen des größten AgNORs im Zellkern (MAXNOR_M) [µm2] bei östrogen-negativen (ER neg) und östrogen-positiven (ER pos) Zellen.
Abb. 11 Korrelation zwischen der mittleren AgNOR-Summenfläche pro Zellkern (S_AREA_M) [µm2] und der mittleren korrigierten AgNOR-Anzahl pro Zellkern (NORNBC_M) aufgeschlüsselt nach östrogen-positiven (ER pos) und östrogen-negativen (ER neg) Zellen.
Abb. 12 Korrelation zwischen der mittleren korrigierten AgNOR-Anzahl pro Zellkern (NORNBC_M) und den Ergebnissen des Estrogen-Receptor-Immuno-Cytochemical-Assay (ERICA) [%] dargestellt für den Gesamttumor (links), für östrogen-negative (Mitte) und östrogen-positive Zellen (rechts).
Abb. 13 Korrelation zwischen der mittleren Anschnittsfläche des größten AgNORs im Zellkern (MAXNOR_M) [µm2] und den Ergebnissen des Estrogen-Receptor-Immuno-Cytochemical-Assay (ERICA) [%] dargestellt für den Gesamttumor (links), für östrogen-negative (Mitte) und östrogen-positive Zellen (rechts).
Abb. 14 Korrelation zwischen der mittleren korrigierten AgNOR-Anzahl pro Zellkern (NORNBC_M) und dem Bloom-Richardson-Grading (BR-Grading) [1;...;9] dargestellt für den Gesamttumor (links), für östrogen-negative (Mitte) und östrogen-positive Zellen (rechts).
Abb. 15 Korrelation zwischen der mittleren AgNOR-Summenfläche pro Zellkern (S_AREA_M) [µm2] und dem Bloom-Richardson-Grading (BR-Grading) [1;...;9] dargestellt für den Gesamttumor (links), für östrogen-negative (Mitte) und östrogen-positive Zellen (rechts).

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Wed Jun 3 18:16:15 1998