Heinke, Stephan : "Zur Modulation volumenaktivierter Chloridströme in Endothelzellen"

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Kapitel 1. Einführung

1.1. Volumenaktivierte Chlorid - Kanäle

Chloridkanäle sind Transportproteine mit hoher Selektivität für C- - Ionen, die ubiquitär in Eukaryoten vorkommen. Sie unterscheiden sich hinsichtlich Permeabilitätseigenschaften für verschiedene Anionen, Kinetik, Einzelkanal - Leitfähigkeit, Akivierungsmechanismen und Modulation (als umfassende Darstellung siehe: Nilius et al., 1996 (2)).

Volumenaktivierte C- - Kanäle (ICl,VOL) wurden erstmals von Doroschenko und Neher (1991) als durch Zellschwellung induzierte Chloridströme in Chromaffinzellen beschrieben. Diese Chloridleitfähigkeit wurde in vielen weiteren verschiedenen Zellarten beobachtet: in einer Reihe von Endothelzellen (z.B. HUVEC, EA, CPAE) , Epithelzellen (A6, HeLa, KB3), Blutzellen (RBL-2H3, Jurkat) (Nilius et al., 1994; Nilius, Oike, Zahradnik und Droogmans, 1994) ,Osteoklasten (Kelly et al., 1994) wie auch in Neuronen und Muskelzellen (Sorota, 1992; Vandenberg et al., 1994). Weitere gemeinsame Eigenschaften von ICl,VOL sind :

Das Vorhandensein volumenaktivierter Chloridströme ist eine Eigenschaft aller Zellen, wird jedoch während der Zellproliferation und Differenzierung stark verändert (Voets et al., 1997).

1.2. Aktivierung von ICl,VOL

Eine Zellschwellung zur Aktivierung des Stromes kann durch eine hypotone Lösung (HTS) extrazellulär, eine hypertone Lösung intrazellulär oder durch eine Erhöhung des Drucks intrazellulär (z.B. via Mikropipette) induziert werden.

In den meisten bisher daraufhin getesteten Zelltypen ist die Aktivierung von ICl,VOL abhängig vom Vorhandensein intrazellulären ATP 's. Die Hydrolyse des ATP scheint jedoch dabei keine Rolle zu spielen, da nach Substitution des ATP mit hydrolysierbaren Analoga wie ATPgS, AMP-PNP oder AMP-PCP der Strom weiterhin aktivierbar war (Oike, Droogmans und Nilius, 1994 ; Jackson et al., 1994) .

In einigen Zellarten (Chromaffin-Zellen, Ehrlich Ascites Tumorzellen, Endothelzellen) konnte durch die intrazelluläre Applikation von GTPgammaS ein Chlorid-Strom mit einer sehr ähnlichen Charakteristik wie ICl,VOL ohne Änderung des Zellvolumens aktiviert werden (Doroschenko, 1991; Doroschenko, Penner und Neher 1991; Doroschenko und Neher, 1992; Nilius, Oike, Zahradnik und Droogmans, 1994). GTPbetaS hingegen verhinderte oder verzögerte die Aktivierung dieses Stromes.


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GTPbetaS inhibierte jedoch auch die G-Protein-abhängige Aktivierung von zytosolischer PLA 2 , das von Lehtonen und Kinnunen (1995) als Mechano- oder Volumensensor vorgeschlagen wurde.

In Ehrlich Ascites Tumorzellen könnte die Aktivierung des Lipoxygenase-Signalweges eine Rolle bei der Aktivierung von ICl, VOL spielen. Durch Zellschwellung wird die PLA 2 aktiviert (Thoroed et al., 1994), dadurch werden Arachidonsäure und Eicosamide freigesetzt und via LTD 4 -Rezeptor ICl,VOL induziert (Hoffmann und Dunham, 1995). Die Bildung des LTD4 könnte dabei durch PLA 2 als Volumensensor geschehen.

In einigen Zelltypen wurde eine Inhibierung von ICl,VOL durch Aktivierung der Proteinkinase C (PKC) beschrieben, so in Zellen des proximalen Nieren-Tubulus von Rana temporaria und in HeLa-Zellen nach Überexpression des P-Glycoproteins durch Transfektion mit der entsprechenden cDNA (Hardy at al., 1995; Robson und Hunter, 1994).

Volumenaktivierte Chloridströme unterscheiden sich in der Inaktivierung bei positiven Haltepotentialen und in der Aktivierung bei negativen Haltepotentialen. Eine Ausprägung dieser Charakteristika zeigen vor allem polare Zellen. Die Inaktivierung wird durch niedrige pH-Werte extrazellulär verstärkt und durch den Austausch intrazellulärer organischer Anionen mit N-Methyl-D-Glukamin (NMDG) oder die extrazelluläre Applikation von ATP verzögert (Anderson et al., 1995). Weiterhin unterscheiden sich volumenaktivierte Chloridströme in Zeitverlauf und Amplitude nach repetitiven Applikationen von HTS (Nilius et al., 1994).

1.3. Funktionelle Rolle volumenaktivierter Chloridströme

1.3.1. Volumen - Regulation

Die wichtigste Funktion volumenaktvierter Chloridkanäle ist ihr Beitrag zur zellulären Volumenregulation. Das Zellvolumen verändert sich bei metabolischer Aktivität, Proteolyse, Glykolyse, während des Zellzyklus, bei Sekretion und Muskelaktivität. Unter pathophysiologischen Bedingungen verändert sich das Zellvolumen bei Ischämie, Azidose und im Rahmen von chronischen Stoffwechselstörungen wie Hyperglykämie (Banderali und Roy, 1992; McManus et al., 1995; Parker, 1993).

Einige Zellarten reagieren nach initialer Schrumpfung durch Erhöhung der Tonizität des extrazellulären Mediums mit einer regulatorischen Erhöhung des Zellvolumens ('Regulatory Volume Increase', RVI). In Endothelzellen geschieht das hauptsächlich durch Aktivierung eines NA+ -K+ - 2C- - Kotransporters (O'Neil und Klein, 1992).


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Wird das extrazelluläre Medium hypoosmolar, so schwellen die Zellen an. Auch hier zeigen einige Zelltypen eine Volumenregulation: nach initialer Schwellung erfolgt eine Verringerung des Zellvolumens, ein sogenannter 'Regulatory Volume Decrease' (RVD). Das geschieht durch einen Ausstrom von osmotisch aktiven Substanzen. Mehrere Mechanismen können zu diesem beitragen:

In der Folge strömt Wasser aus der Zelle und deren Volumen verringert sich (Deutsch und Chen, 1993). ICl,VOL könnten auch einen Weg für den Ausstrom negativ geladener organischer Substanzen aus der Zelle darstellen. So ist bekannt, daß Aminosäuren, Polyole und Methylamine über einen Natrium - unabhängigen Transportweg aus der Zelle gelangen können. Für Taurin beispielsweise beträgt das Permeabilitätsverhältnis PTaurin : PCl = 0,2-0,3 (Jackson und Strange, 1993; Banderali und Roy, 1992) .

Der minimal nötige Durchmesser der durch ein Kanalprotein gebildeten Pore müßte dazu 5,4-6,4 A° betragen (Arreola, 1995; Rasola et al., 1992). Das entspricht etwa den Ausmaßen eines auswärts gleichrichtenden C- - Kanals, ist jedoch größer als ein GABA - aktivierter C- - Kanal. Wegen ihrer wahrscheinlichen Funktion im Transport organischer, osmotisch aktiver Moleküle wurde deshalb der Name VSOAC (' volume - sensitive organic osmolyte channel ') für diese Leitfähigkeit vorgeschlagen (Jackson und Strange, 1995).

1.3.2. Einfluß auf Membranpotential und Konzentration intrazellulären Kalziums

Bei Aktivierung von ICl,Vol wird das Membranpotential (MP) in Richtung des Umkehrpotentials für C- verschoben. Da im Allgemeinen bei Zellschwellung eine Koaktivierung von K+ und C- - Kanälen erfolgt, resultiert ein MP zwischen deren Umkehrpotentialen. In Kardiomyozyten könnte ICl,Vol an der Repolariation und unter pathologischen Bedingungen an der Entstehung von Arrhythmien beteiligt sein (Zhang et al, 1993; Vandenberg et al., 1994; Zhou und Lab, 1994).

Eine Veränderung des MP bewirkt eine Veränderung der treibenden Kraft für extrazelluläres Kalzium zum Eintritt in die Zelle. Dieser Zusammenhang wurde erstmals durch Matthews et al. (1989) in Mastzellen beschrieben und ist möglicherweise für die Modulation von 'calcium-release activated calcium channels' (ICRAC) von Bedeutung. Diese können ebenfalls durch Zellschwellung aktiviert werden.


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Auf die daraus resultierende Frage, inwieweit die Konzentration freien intrazellulären Kalziums die Funktion volumenaktivierter C- - Kanäle moduliert, wird im Kapitel 2.1 dieser Arbeit näher eingegangen.

1.3.3. Proliferation

Ionenkanäle können die Zellproliferation modulieren. Als Mechanismen dazu wurden durch Dubois und Rouzaire-Dubois (1993) und Nilius und Droogmans (1994) der Einfluß auf das MP und damit auf die treibende Kraft für den Einstrom extrazellulären Kalziums in die Zelle genannt (von den Autoren wird so auch der Zusammenhang zwischen Expression von Kaliumkanälen und Eintritt der Zellen in die Zellteilung am Punkt G1 - S des Zellzyklus erklärt). Auch volumenaktivierte Chloridkanäle können einen modulatorischen Einfluß auf die Zellproliferation ausüben. Sie sind in den meisten proliferierenden Zellen vorhanden.

Durch den Zusatz von Blockern volumenaktivierter Chloridkanäle (NPPB, IAA-94, DIDS, Tamoxifen, Flufenacinsäure) in das Kulturmedium wird die Proliferation von Endothelzellen und T-Lymphozyten gehemmt (Garnier et al., 1993; Voets et al., 1995; Schuhmacher et al., 1995). In BC3H1 und C2C12 - Myoblasten verringert sich die Stromdichte stark, wenn die Zellen nach Reduzierung der Serumkonzentration des Kulturmediums oder durch Zusatz von Wachstumsfaktoren in das Differenzierungsstadium übergehen (Voets et al., 1997).

Als Mechanismus dafür wird die Regulation des Zellvolumens durch Aktivierung von Chlorid - und Kaliumleitfähigkeiten angenommen (Block und Moody, 1990). So zeigen die von Deutsch und Lee (1988) beschriebenen Experimente mit T-Lymphozyten bei Zellproliferation eine Kofunktion von Chlorid - und Kaliumleitfähigkeiten als Mechanismen für den im Abschnitt 1.3.1 dieser Arbeit dargestellten RVD. Wie die Autoren ausführten, besitzen nichtproliferierende Zellen bereits eine schwellungsinduzierte Anionenleitfähigkeit, welche einen Beitrag zum RVD leisten kann. Eine entsprechende Kaliumleitfähigkeit wird jedoch erst nach Stimulierung der Proliferation exprimiert.

1.3.4. Kontrolle des pH

Die Funktion und Struktur der meisten Makromoleküle ist stark abhängig vom pH, dessen Regulation ist daher eine wichtige Eigenschaft lebender Zellen.

In den meisten Zellen wird der pH konstant auf 7.2 gehalten. Als Regulationsproblem steht dabei hauptsächlich die Kompensation von Erhöhungen der intrazellulären Protonenkonzentration. Das geschieht durch Transport der Protonen nach extrazellulär oder von Bicarbonat nach intrazellulär.


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Diese Ionen werden von Transportmolekülen aktiv durch die Zellmembran transportiert. Sie nutzen dazu die Energie, die im transmembranären Natriumgradienten gespeichert ist.

Vier verschiedene Transportwege in Form transmembranärer Transportmoleküle sind bekannt (Alberts et al., 1994, Kap. 11, S. 518-522 ) :

Die C- - abhängigen Tranportmechanismen können bei Zellschwellung über eine lokale oder die gesamte Zelle betreffende Veränderung der C- - Konzentration moduliert werden, da der Chloridstrom sehr hohe Ausmaße erreichen kann (20 - 100 pA/pF). Auch ein Efflux von HCO3- durch volumenaktivierte Chloridkanäle ist möglich (Woodbury und Miles, 1993). Von Livne und Hoffmann (1990) wurde beobachtet, daß der intrazelluläre pH bei Zellschwellung nach initialem Anstieg sich substantiell verringerte. Nach Block von ICl,Vol konnte nur noch der initiale Anstieg beobachtet werden. Diese Verschiebung des pH stellt möglicherweise einen Mechanismus für die Inhibierung der Zellproliferation nach Block von ICl, VOL wie im vorherigen Abschnitt beschrieben dar, da dadurch Zellzyklus - modulierende Kinasen inhibiert werden und die Zelle im G0 / G1 - Stadium des Zellzyklus' verharrt.

1.4. Elektrophysiologische Charakterisierung

1.4.1. Messung des Stromes in ' whole cell ' - Konfiguration

Wird der durch die gesamte Zellmembran fließende volumenaktivierte Strom (‘whole cell' - Konfiguration) nach extrazellulärer Applikation einer hypotonen Lösung gemessen, so ergeben sich Stromdichten zwischen 2 und 100 pA/pF Membrankapazität. Die Zeit von der Applikation der hypotonen Lösung bis zur halbmaximalen Aktivierung des Stroms beträgt 30-120 s. Beide Parameter sind abhängig von Typ und Differenzierungsgrad der Zelle, wobei an undifferenzierten Zellen größere Ströme und eine schnellere Aktivierung beobachtet werden können (Nilius et al., 1994).

Charakteristika von ICl,VOL sind weiterhin die Auswärts-Gleichrichtung, die höhere Permeabilität für Jodit als für Chlorid (SCN- > I- > Br- > C- > F- > Gluconat) (Nilius, Sehrer und Droogmans, 1994) und die langsame Inaktivierung bei einem positivem Haltepotential (HP) von mehr als +40 mV. Zwischen verschiedenen Zelltypen unterscheidet sich der zeitliche Verlauf dieser Inaktivierung.


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Auf den Einfluß von pH und extrazellulären Kationen auf die Inaktivierung wurde bereits im Abschnitt 1.2 ('Aktivierung') hingewiesen.

1.4.2. Einzelkanal - Messungen

Aussagen zu Einzelkanal - Strömen von volumenaktivierten Chloridkanälen sind bis zum jetzigen Zeitpunkt in nur geringem Umfang möglich, da es technisch äußerst schwierig ist, solche Einzelkanal-Aktivitäten zu messen.

Volumenaktivierte Chloridkanäle mit Einzelkanal-Leitfähigkeiten von 0,1 und 8 pS wurden in Ehrlich Aszites Tumor Zellen sowie in Zellen des Choroid-Plexus durch Christensen und Hoffmann (1992) beschrieben. Die Ermittlung von Einzelkanal-Leitfähigkeiten aus makroskopischen Strömen ergab Werte um 2 pS an Chromaffin-Zellen, neutrophilen Granulozyten und T-Lymphozyten (Doroschenko und Neher, 1991; Kunzelmann et al., 1992; Lewis et al., 1993; Ho et al., 1994). Eine Überprüfung, ob die bereits bekannten Daten über die Permeabilität und der vermutete Porendurchmesser mit jenen der Einzelkanal-Leitfähigkeit übereinstimmen, ist bisher noch nicht im Detail erfolgt. Unter der Annahme einer niedrigen Einzelkanal-Leitfähigkeit kann eine Kanaldichte zwischen 10 und 60 Kanälen pro mm2 Zellmembran abgeschätzt werden. Dieser Wert liegt wesentlich höher als bei allen anderen bekannten Ionenkanälen.

Auswärts gleichrichtende volumenaktivierte Chloridkanäle mit einer Leitfähigkeit von 20 - 90 pS wurden für Epithelzellen, Gliazellen, Osteoblasten, Osteoklasten und Muskelzellen beschrieben (Jackson und Strange, 1995; Hoffmann und Dunham, 1995; Nilius et al., 1994).

Kanäle mit einer sehr großer Leitfähigkeit um 400 pS wurden in Kardiomyozyten (Coulombe und Coraboeuf, 1992) , solche mit 200 - 400 pS in Astrozyten (Jalonen, 1993) und Nierenepithelien (Schwiebert et al., 1994) beobachtet.

1.5. Pharmakologie volumenaktivierter Chloridkanäle

1.5.1. Übersicht

Eine Reihe klassischer Chloridkanal - Blocker wie DIDS (4,4'-Diisothiocyanostilben-2,2'-Disulfonsäure), SITS (4,4' -Acetamido -4' -Isothiocyano-stilben -2,2' -Disulfonsäure), 9-AC (9-Antrazencarboxylsäure), NPA (N-Phenylantrazillinsäure), IAA-94 (Indanyloacetsäure-94), DPC (Diphenylamin-2-Carboxylat) und MK-196 (3',5-Dichlorodiphenylaminocarboxylsäure) wirken nur in hohen Konzentrationen auf ICl, VOL .

Einige Substanzen haben blockierende Eigenschaften auf ICl, VOL abhängig von der Art der Zellen: NPPB (5-Nitor-2-(3-phenyprophylamino)benzoesäure), Flufenamin


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-säure, Nifluminsäure 1,9-Dideoxyforskolin sowie Verapamil, Quinin, Tamoxifen, Furosemid und Gossypol (Szücs et al., 1995 (2)).

Inhibitoren der PLA2 - Synthese stellen wirksame Blocker von ICl, VOL dar, so pBPB, RO 31-4639 und Cyclosporin A. Gleiches gilt für Ketokonazol, SKF-525A und Inhibitoren der Lipoxygenase (Jackson und Strange, 1995; Valverde et al., 1995; Hoffmann und Dunham, 1995).

Höhervalente Ionen wie Zn 2+, Mg 2+, Ca 2+, Gd 3+ und La 3+ reduzieren ebenfalls die Amplitude von ICl,VOL (Anderson et al., 1995). Auch mit hohen Konzentrationen von Nukleotiden konnte ein solcher Effekt in einer Reihe von Zellenarten beobachtet werden (Van Driesche et al., 1993).

An 'cultured pulmonary artery endothelium' (CPAE) wurde kürzlich gezeigt, daß Mibefradil, ein neuartiger Kalziumkanalblocker, neben dem Ca2+ - akivierten C- - Kanal auch ICl,VOL inhibiert (Nilius et al., 1997(2) ).

1.5.2. Cromoglycinsäure als Blocker volumenaktivierter Chloridkanäle

Chloridkanäle scheinen eine wichtige Rolle in der Kontrolle sekretorischer Funktionen in Mastzellen zu spielen (Romanin, 1991). Diese Kanäle können in Mastzellen durch intrazelluläre Applikation von Cromolglycinsäure (CL , Chromolyn) geblockt werden, was die Vermutung nahelegt, es handelt sich um einen spezifischen Blocker von Anionen-Kanälen mittelgroßer Leitfähigkeit (Reinspecht et al., 1992).

Chromoglycinsäure ist ein Antiallergikum, das durch Hemmung der Mediatorfreisetzung aus Mastzellen ('Membranstabilisierung') wirken soll. Jedoch werden auch antagonistische Wirkungen auf den 'plateled activating factor' (PAF) beschrieben. Klinisch wird es lokal an Schleimhäuten des Auges und des Respirationstraktes appliziert , als Indikationen gelten die allergische Konjunktivitis oder die allergische Rhinitis. Es wirkt jedoch nur prophylaktisch, ein direkter therapeutischer Effekt besteht nicht (Forth, Henschler und Rummel, 1990).

Endothelzellen bilden als Grenzstruktur zwischen Blut und Gewebe im kappilären Stromgebiet eine wichtige Rolle in allen inflammatorischen Prozessen: jede Entzündung geht einher mit einer Kapillardilatation und einer Steigerung der Kapillarpermeabilität (Transsudation und Exsudation). Neben diesen akuten Reaktionen kommt es bei chronischen Enzündungen auch zur Gefäßneubildung. Neben ' vascular endothelial growth factor' (VEGF) wirkt vor allem der 'fibroblast growth factor' (FGF) stimulierend auf die Endothelproliferation, FGFb wird hauptsächlich von Makrophagen sezerniert. Wie von Sorota (1992) gezeigt wurde, scheint auch Zellschwellung eine Rolle bei Entzündungsprozessen zu spielen, was über die Beeinflussung der Proteinsynthese oder der Zellproliferation geschehen könnte.


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1.6. Modulation volumenaktivierter Chloridströme

1.6.1. Modulation durch Phosphorylierung

Reversible Phosphorylierungen stellen die vorherrschende Strategie zur Aktivitätskontrolle von Proteinen in Eukaryoten dar. Auch einige Typen von Ionenkanälen können so in ihrer Funktion moduliert werden (Alberts et al., 1994 , Kap. 15, S. 752).

Bekannt ist bereits, daß intrazelluläres ATP zur Aktivierung und zur Verhinderung des 'run-down' von ICl,VOL notwendig ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß die Proteinkinase C (PKC) Chloridkanäle modulieren kann (Hardy at al., 1995; Robson und Hunter, 1994).

In Epithelzellen und Fibroblasten sind Tyrosinkinasen an der Aktivierung von volumenaktiverten Leitfähigkeiten beteiligt: Tyrosinkinase - Inhibitoren können eine schwellungsinduzierte Chloridleitfähigkeit unterdrücken, während Tyrosin - Phosphatase - Inhibitoren wie Vanadat sie potenzieren (Tilly et al., 1993) .

Unter den intrazellulären Signalproteinen, die an aktivierte Phosphotyrosine binden, gehören auch GTPase - aktivierende Proteine (GAP) und 'Guanine Nucleotide Releasing Proteins' (GNRP). GAP inaktivieren monomerische GTPasen der RAS - Familie, GNRP aktivieren sie. RAS wiederum aktiviert eine Serin / Threonin - Phosphorylierungskaskade, welche in einer Aktivierung von mitogen - aktivierten Proteinkinasen (MAP-Kinasen) mündet. MAP-Kinasen können nicht nur über diesen Signalweg, sondern auch über die G - Protein - vermittelte Aktivierung der PKC aktiviert werden. Durch den MAP - Kinasen - Signalweg werden die zeitlich nur sehr kurz wirksamen Aktivitätsveränderungen der Tyrosin - Kinasen und der RAS - GTPasen in zeitlich länger wirksame Signale umgewandelt. Die MAP - Kinasen bilden zusätzlich eine Art gemeinsame Endstrecke einer Vielzahl verschiedener extrazellulärer Signale, sie werden deshalb auch 'extracellular - signal - regulated - kinases' (ERK) genannt. Die aktivierte MAP - Kinase ist seinerseits Ausgangspunkt der Phosphorylierung einer großen Anzahl von anderen Proteinkinasen und von Gen - Regulatorproteinen wie JUN und Elk-1. (Alberts et al., 1994 ,Kap. 15, S. 759-770).

Kürzlich wurde ein Signalweg beschrieben, in dem mechanische Kräfte Adhaesionsproteine mit mechanosensorischen Eigenschaften wie Integrine aktivieren. Diese erzeugen dann intrazelluläre Signale zur Aktivierung von ICl,VOL. (Seufferlein und Rozengurt, 1994; Richardson und Pearson, 1995; McLees et al., 1995). Ein weiterer Mechanismus könnte die direkte Aktivierung von Tyrosinkinasen durch einen neuartigen streßabhängigen Signalweg mit Beteiligung von Phosphorylierungsreaktionen ähnlich denen der Proteinkinase HOG1 in Hefepilzen sein (Galcheva-Gargova at al., 1994). Dieser Signalweg wird durch osmotischen, aber auch chemischen Streß oder Hitzeschock aktiviert (Rouse et al., 1994).


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Zellen in Kultur reagieren auf eine breite Palette von Streßeinwirkungen mit der Synthese einer Gruppe von Proteinen, die in 2 Gruppen eingeteilt werden: Hitzeschockproteine (HSP) und Glukose - regulierende Proteine (GRP). Die HSP werden nochmals in 5 Subklassen eingeteilt und sind nicht nur durch Wärmeeinwirkung, sondern auch durch eine Reihe chemischer und zytotoxischer Stoffe induzierbar. Den gemeinsamen Aktivator der unterschiedlichen Stressoren stellt dabei der ' heat-shock transcription factor ' (HSF) dar. Eine Konformationsänderung erlaubt ihm die Bindung an eine 'heat - shock - element' genannte DNA-Sequenz, die dadurch aktivierte Phosphorylierung des HSF aktiviert die Transkription der HSP - RNA. HSP dienen u.a. der Reparatur von DNA-Defekten und der Reorganisation der Sekundär- und Tertiärstruktur zellulärer Proteine (HSP 70). Sie hydrolysieren dabei z.T. ATP. Ihre Bildung geht mit einer allgemeinen Suppression der Proteinsynthese und einer Reorganisation des Zytoskeletts einher (Alberts et al., 1994 ,Kap 5, S. 214-215, Kap 6, S. 249-250; Yiu et al, 1993). Da es unter pathologischen Bedingungen wie Hypoxämie und Azidose zu Volumenänderungen der betroffenen Zellen kommt, ist auch eine Modulation von ICl,VOL durch HSP möglich.

Auf die mögliche Rolle der Adhaesionskinase p125FAK in der Modulation von ICl,VOL wird im folgenden Abschnitt näher eingegangen.

1.6.2. Rolle des Zytoskeletts

Die bisher dazu veröffentlichten experimentellen Ergebnisse sind kontrovers. Die Depolymerisation von F-Aktin mit Cytochalasin B und C2 Clostridium-Toxin inhibierte die Aktivierung von ICl, VOL in Bronchoepithelzellen, humanen embryonalen Skelettmuskelzellen und Myoblasten (Hug et al., 1995). Neben Zellschwellung konnte ICl, VOL in Nierenepithelien auch durch die Zerstörung von F-Aktin-Filamenten aktiviert werden (Schwiebert et al., 1994). In PC12- Zellen konnte ICl,VOL durch Depolymerisation des F-Aktin mit Cytochalasin B ebenfalls direkt aktiviert werden.

Auch Annexin II moduliert volumenaktivierte Chloridströme in CPAE. Die Proteinfamilie der Annexine gehören zu den Ca2+ - und Membran- Phospholipid-bindenden Proteinen. Sie binden ebenfalls an F-Aktin. Nach Interaktion mit dem Protein P11 bildet Annexin II ein Heterotetramer und tritt dann in Interaktion mit dem Zytoskelett. Es gibt Hinweise auf eine Funktion in der Signalübertragung vom und auf das Membran-assoziierte Zytoskelett. Nach intrazellulärer Applikation eines synthetischen Proteins Ac 1-14 (dieses ähnelt der Bindungsstelle des Annexin II für P11 und bindet dieses ebenfalls) konnte eine deutliche Reduktion des ICl,VOL beobachtet werden, nicht jedoch nach Applikation eines veränderten Proteins Ac 1-14 mit stark reduzierter Affinität zu P11 (Nilius et al., 1996).


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Experimente in HUVEC - Endothelzellen mit Modulation von F-Aktin und Tubulin konnten jedoch keinen Zusammenhang zwischen Stabilisierung von F-Aktin mit Phalloidin, Depolymerisation mit Cytochalasin B , Polymerisation von Tubulin mit Taxol oder Depolymerisation mit Colcemid einerseits und Größe des HTS-induzierten Chloridstromes andererseits zeigen (Oike et al., 1994). Die Autoren gehen daher von einer direkten Aktivierung des Stromes durch die mechanische Spannung in der Zellmembran aus.

Eine Rolle bei der Modulation von ICl,VOL könnte das Zytoskelett auch über Adhaesionsproteine wie Integrine ausüben. Integrine sind sowohl mechanische Verbindung zwischen Extrazellularmatrix und Zytoskelett als auch Rezeptor für Signale von der Extrazellularmatrix. Die Signalübertragung erfolgt über die 'fokale Adhaesionskinase' p125FAK . Sie ist eine Tyrosinkinase und wird durch das Binden von extrazellulärer Matrix an Integrine auf der Zelloberfläche reguliert.

p125FAK gehört damit zu den fokalen Kontakten, die die extrazelluläre Matrix mit intrazellulären Aktinfilamenten verbindet und benötigt zur Aktivierung intakte F-Aktin-Mikrofilamente. Sie aktiviert intrazelluläre Signalwege, die für die Proliferation, Differenzierung, Bewegung, Form und Orientierung von Zellen von Bedeutung sind. Eine Funktion als Sensor für auf eine Zelle einwirkende mechanische Kräfte und als Modulator für volumenaktivierte Chloridströme wird daher auch diskutiert (Defilippi et al., 1994; Seufferlein und Rozengurt, 1994; Alberts et al., 1994, Kap. 19, S. 998-999).

1.6.3. Modulation durch intrazelluläres Kalzium

Die Rolle intrazellulären Kalziums bei der Aktivierung volumenaktivierter Chloridströme ist noch nicht völlig aufgeklärt. Bekannt ist, daß eine Erhöhung von [Ca2+i keine volumenaktivierten Chloridströme aktiviert (Nilius et al., 1992) und daß diese Ströme bei einem auf 50-100 nM gepuffertem [Ca2+i weiterhin aktivierbar bleiben (Nilius, Oike, Zahradnik und Droogmans, 1994). Volumenaktivierte Chloridkanäle waren in 'inside out' -Konfiguration (in der Öffnung einer Mikropipette befindet sich ein Stück Zellmembran, deren Außenseite zum Pipetten-Innenraum und deren Innenseite zur Badlösung der Messkammer gerichtet ist) nicht Kalzium-abhängig. Die pharmakologischen Eigenschaften und die Kinetik unterscheiden sich deutlich von jenen Ca2+ - aktivierter Chloridkanäle. So galt ICl,Vol bisher als Ca2+ - unabhängig.

In einer Reihe von Veröffentlichungen wurde dann jedoch gezeigt, daß Calmodulin-Antagonisten inhibitorische Effekte auf volumenaktivierte Ströme, so z.B. in HeLa-Zellen (Kirk und Kirk, 1994), oder allgemein auf Anionenleitfähigkeiten (Fuller et al., 1990) ausüben. Auch mit den in dieser Arbeit verwendeten 'cultured pulmonary artery endothelium' (CPAE) wurden solche Effekte mit dem Calmodulin-Antagonisten Trifluorparacin (TFP) beobachtet. Dies steht nicht im Widerspruch zu


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den genannten Ergebnissen, da die Ca2+ - Abhängigkeit bisher nicht direkt und über einen weiten Bereich von verschiedenen Ca2+ - Konzentrationen untersucht wurde.

1.6.4. Modulation durch Thrombin

In einer erst kürzlich erschienen Arbeit konnte der verstärkende Einfluß von Thrombin auf ICl,VOL gezeigt werden (Manolopoulos et al., 1997). In einer Konzentration von 1 U/l erhöhte sich der durch 13% HTS bereits aktivierte ICl,Vol. Nach Aktivierung durch 28% HTS konnte jedoch kein Effekt des Thrombin mehr beobachtet werden. Weitere Ergebnisse weisen darauf hin, daß der Effekt durch eine proteolytische Aktivierung des Thrombinrezeptors ausgelöst wird, aber Ca2+ - unabhängig ist. Ohne vorherige Aktivierung von ICl,Vol konnte mit Thrombin kein Strom aktiviert werden.

1.7. Molekulare Charakterisierung

1.7.1. Das Molekül ICl,N

Die morphologische Charakterisierung von volumenaktivierten Chloridkanälen ist bisher noch nicht sicher gelungen. Eine Reihe von Molekülen wurde in Beziehung mit ICl, VOL gebracht.

Das durch Paulmichl et al. (1992) erstmals beschriebene Molekül ICl,N (pICl,N) wurde in Mladin-Darby canine kidney - Zellen (MDCK) als 235-241 AS langes Protein (abhängig von der untersuchten Spezies) isoliert und als HTS-aktivierter Chloridkanal vorgeschlagen. Die Diskussion darum ist jedoch außerordentlich kontrovers.

Entsprechende mRNA wurde ebenfalls in PC12, RBL NIH 3T3 Fibroblasten und in Lungengewebe gefunden. In Expressions-Experimenten dieser RNA in Oozyten wurde ein auswärts-gleichrichtender Kanal mit Chlorid-Selektivität und Sensitivität zu den C- -Kanalblockern NPPB und DIDS beobachtet. Die Permeabilität sank in der Reihenfolge Thiocyanat >> Jodit > Bromid > Chlorid. Sie entspricht damit der typischen Permabilität von bei volumenregulatorischen Prozessen aktivierten C- - Kanälen in Säugetierzellen. Die Kinetik für positive Haltepotentiale über +40 mV entspricht mit schneller Aktivierung und folgender langsamer Inaktivierung der Kinetik schwellungsaktivierter C- - Kanäle in verschiedenen Epithelien. Ein wichtiges Indiz für einen Zusammenhang zu ICl,Vol ist das Vorhandensein eines Nukleotidrezeptors an der extrazellulären Seite des Moleküls. So kann dieser Strom durch extrazelluläre Nukleotide geblockt werden, was prinzipiell auch beim volumenaktivierten C- - Strom in Endothelzellen (HUVEC) der Fall ist (Paulmichl et al., 1993).

Mit Anti-IClN Antikörpern konnte der volumenaktivierte Choridstrom in nativen Xenopus-Oozyten geblockt werden. Damit kann dieser Kanal nicht mehr Säugetier-spezifisch sein.


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Funktionell ergaben sich aber deutliche Unterschiede zwischen ICl,N und ICl,VOL. Untersuchungen in CPAE zeigten zwar sowohl das Vorhandensein des Moleküls pICl,N als auch Übereinstimmungen in der Aktivierung und Pharmakologie beider Ströme. Jedoch die Inaktivierung bei Haltepotentialen > +50 mV und der blockierende Effekt von Azidothymidin ( 3'-Azidodesoxythymidin, AZT) und Aciclovir (9- [(2-Hydroxyethoxy)-methyl ]-guanin) sind bei ICl,VOL wesentlich geringer ausgeprägt als bei ICl,N (Szücs et al., 1995 (2)). In Untersuchung des endogenen ICl,VOL im Vergleich zum Strom nach Injektion von pICl,N RNA in Xenopus Oozyten zeigten sich ebenfalls deutliche Differenzen. Die Auswärts - Gleichrichtung des Stromes sowie unterschiedliche Permeabilitäten für NO3- und C- waren bei ICl,N mehr ausgeprägt als bei ICl,VOL. Weiterhin konnte ICl,N im Gegensatz zu ICl,VOL durch Cyclymat blockiert werden. Seine Kinetik bei Inaktivierung war pH - unabhängig. Der wichtigste Unterschied besteht jedoch darin, daß ICl,N in Kollagenase - defollikollierten Oozyten bereits exprimiert, jedoch nicht durch extrazelluläre Hypotonie moduliert werden kann, während ICl,VOL nicht in Kollagenase - defollikollierten Oozyten, sondern nur nach manueller Defollikulierung oder in follikelhaltigen Oozyten nach extrazellulärer Applikation von hypotoner Lösung beobachtet werden konnte (Ackermann et al., 1994; Krapivinsky et al., 1994; Voets et al., 1996). Es muß daher geschlußfolgert werden, daß ICl,N und ICl,Vol zwei verschiedene Ströme sind.

Es existieren weiterhin Modellvorstellungen, in der dieses Molekül ein Regulatorprotein für volumenaktivierte Chloridkanäle und kein eigentliches Kanalprotein darstellt:

So wurde beobachtet, daß in MDCK und Oozyten dieses Protein hauptsächlich (zu 70-80%) zytosolisch vorliegt. Der Anteil der mikrosomalen (die Zellmembran beinhaltenden) Fraktion betrug nur weniger als 5% . Dieses Verhältnis änderte sich auch nicht, wenn die Messungen an mit HTS - stimulierten Zellen durchgeführt wurden.

Weiterhin interagierte das Protein mit anderen zytosolische Proteinen (einem 43kD und einem 72kD-Molekül). Diese Interaktion war auch noch nach Denaturierung durch Hitze oder SDS vorhanden. Das ist sehr ähnlich den Interaktionen anderer zytosolischer Proteine zu Calmodulin-Komplexen oder Bindungen über -SH2 / -SH3 determinierte AS-Sequenzen, wie sie auch in der Bindung von RAS an Rezeptor-Tyrosinkinasen im MAP-Signalweg zur Transkriptionsaktivierung vorkommen.

Und drittens zeigte das Molekül pICl,N keine Ähnlichkeiten zu anderen Chloridkanalmolekülen.

1.7.2. Der Chloridkanal CIC-2

CIC-2 gehört zur Gruppe der CIC - Chloridkanal-Familie. Als gemeinsame Struktur


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wurden 12 hydrophobe, transmembranär angeordnete Untereinheiten mit intrazellulär lokalisierten N- und C-Termini vorgeschlagen. Funktionell bestehen zwischen den einzelnen Vertretern Unterschiede in Spannungsabhängigkeit, Anionenselektivität und Kinetik.

CIC-2 scheint ubiquitär vorzukommen, es wurde in allen daraufhin untersuchten Geweben und Zellinien nachgewiesen. Der Kanal ist unter physiologischen Bedingungen geschlossen und durch Hyperpolarisierung der Zelle unter -100 mV oder extrazellulärer Applikation hypotoner Lösung aktivierbar. Bei Expression des Kanals in Xenopus Oozyten ist dadurch ein Strom induzierbar, der eine Auswärts-Gleichrichtung und eine höhere Selektivität für C- als für J- zeigt. Damit unterscheidet er sich von anderen HTS-induzierten Chloridströmen (J- > C- ). Am N - Terminus des Kanalproteins wurden eine essentielle und eine modulatorische Untereinheit spezifiziert. Als Vorstellung über deren Funktion wurde ein Modell entworfen, in dem die N-terminale, essentielle Untereinheit an eine bisher noch nicht identifizierte Region des Kanalproteins bindet und so den Kanal blockt. Hyperpolarisation oder Hypotonizität beendet die Inaktivierung des Kanals durch Auflösung dieser Bindung.

Wegen der Aktivierbarkeit durch Hypotonizität und dem nahezu ubiquitärem Vorkommen wurde CIC-2 als Kanalprotein schwellungsaktivierter Chloridströme in Säugetierzellen vorgeschlagen. Die Spannungs- und Zeitabhängigkeit sowie die Anionenselektivität unterscheiden sich jedoch deutlich z.B. von ICl, VOL in CPAE , so daß dies sicher nicht zutrifft (Szücs et al., 1995 (2)).

Kürzlich wurde in Mandibulardrüsenzellen der Maus ein HTS-induzierter Strom beschrieben, dessen Anionenselektivität und Aktivierungsbedingungen dem des CIC-2 entsprechen (Dinudom et al.,1993). So könnte CIC-2 zwar nicht ubiquitär, aber in einigen speziellen Zelltypen wie dem ebengenannten volumenaktivierte Chloridströme verursachen.

1.7.3. Das P-Glycoprotein

Das P-Glycoprotein (auch 'Multi Drug Resitance Protein', MDR-1) ist ein Mitglied der ABC-Transporter-Familie und transportiert aktiv hydrophobe Moleküle durch die Zellmembran nach extrazellulär. Bei Veränderungen des Zellvolumens soll es auch als volumenaktivierter Chloridkanal fungieren. Diese Rolle ist jedoch fraglich: bei Expressions-Experimenten mit MDR1 - mRNA und dem komplementärem Proteinprodukt in HeLa - Zellen und KB3 - Zellen konnte zwar eine HTS-aktivierte Chloridleitfähigkeit nachgewiesen werden, in nicht mit dieser mRNA transvektierten Zellen ließ sich jedoch kein quantitativer Zusammenhang zwischen HTS-induziertem Chloridstrom und Vinblastinsekretion durch MDR-1 oder dem Ausmaß der Expression (gemessen mit RT-PCR und immunozytochemisch) herstellen. Das


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gleiche Ergebnis erbrachten diese Experimente hinsichtlich MDR-2 (De Greef et al., 1995).

Phospholemman , ein Molekül aus 72 Aminosäuren, wurde nach Überexpressions - Experimenten in Xenopus Oozyten ebenfalls als Chloridkanal vorgeschlagen. Jedoch ist zur Zeit noch unklar, ob es sich tatsächlich um einen Ionenkanal, einen spezifischen Aktivator eines Kanals oder einen unspezifischen und unphysiologischen Aktivator von Strömen in Oozyten handelt (Paulmichl et al., 1993; Jentsch, 1993; Pusch und Jensch, 1994) .

1.8. Charakteristik von volumenaktivierten Chloridströmen in Endothelzellen

In Endothelzellen wurden bisher 3 Klassen von Anionenkanälen beschrieben:

In CPAE wurde kürzlich ein [Ca2+i - aktivierter Chloridstrom beschrieben. Er ist durch direkte Erhöhung des [Ca2+i (z.B. durch die Ionophore Ionomycin oder durch direkte Beladung der Zelle via Pipette) und durch Stimulation mit ATP auslösbar, seine Aktivierung kann durch Ca2+ - Chelatoren wie BAPTA verhindert werden. Der Strom wird bei positivem HP langsam inaktiviert, bei negativem HP sehr schnell inaktiviert und zeigt eine starke Auswärts-Gleichrichtung. Er ähnelt damit sehr ICl,VOL , jedoch ist die Auswärtsgleichrichtung wesentlich stärker ausgeprägt und die pharmakologischen Eigenschaften unterscheiden sich. Beide Ströme sind koaktivierbar. Dieser Strom unterscheidet sich ebenfalls von Chloridkanälen der CIC-Familie (Nilius et al., 1997 (1); Nilius et al., 1997 (3)).

Die Charakterisik von ICl,VOL in Endothelzellen ist durch Nilius, Sehrer und Droogmans (1994) beschrieben worden und soll folgend zusammenfassend dargestellt werden. Die wesentlichen Kennzeichen sind:

ICl,VOL in Endothelzellen entspricht damit den gemeinsamen Kennzeichen volumenaktivierter Chloridströme. Daneben werden in vielen Zelltypen auch Kaliumleitfähigkeiten durch HTS induziert. Eine solche Leitfähigkeit spielt aber in CPAE-Endothelzellen keine Rolle (Nilius, Oike, Zahradnik und Droogmans, 1994).

CFTR (' Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator') - Kanäle mit geringer Leitfähigkeit und Regulation durch cAMP werden in Endothelzellen nicht exprimiert.

In einigen Zelltypen erfolgt nach initialer Schwellung durch Senkung der extrazellulären Tonizität ein regulatorische Volumensenkung ('Regulatory Volume Decrease' , RVD). Endothelzellen lassen jedoch einen solchen RVD vermissen, was mit fehlender Koaktivierung eines Kalium - Auswärtsstromes zu erklären ist (De Smet et al., 1994).

Eine spannungsabhängige Aktivierung besteht nicht. ICl,VOL ist bereits im Ruhezustand der Zelle teilweise aktiviert. Dieser 'Ruhestrom' läßt sich durch Applikation ein hypertonen extrazellulären Mediums reduzieren.


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