Heinke, Stephan : "Zur Modulation volumenaktivierter Chloridströme in Endothelzellen"

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Kapitel 2. Aufgabenstellung

Durch Zellschwellung aktivierte Chloridströme wurden erstmals an Chromaffinzellen beobachtet (Doroschenko und Neher, 1991). Diese Art von Strömen konnten in nahezu allen daraufhin untersuchten Zellarten nachgewiesen werden. Noch ist jedoch unklar, ob ihr Vorhandensein eine Eigenschaft jeder Zelle oder Ausdruck eines speziellen Funktions- oder Entwicklungsstadiums einer Zelle ist.

Volumenaktivierte Chloridkanäle wurden in einer breiten Palette von Zellarten in Stromkinetik und Pharmakologie charakterisiert, insbesondere in Endothelzellen (De Smet et al.,1994; Nilius Sehrer und Droogmans 1994; Nilius et al., 1994 (2), Oike et al., 1994). Auch zu ihrer funktionellen Rolle bei Volumenregulation, Proliferation, pH-Kontrolle und ihrem Einfluß auf das Membranpotential wurden eine Reihe von Hinweisen gesammelt (Jackson und Strange, 1995; Nilius et al., 1994; Anderson et al., 1994; Valverde et al., 1995; Hoffmann und Dunham, 1995). Ihre strukturelle Natur und der Signalweg zu ihrer Aktivierung sind jedoch noch nicht aufgeklärt. Auskünfte darüber würden auch zu einem noch besseren Verständnis ihrer Funktion beitragen.

Das Ziel dieser Arbeit bestand deshalb in Untersuchungen zur Modulation und zum Aktivierungsmechanismus volumenaktivierter Chloridströme in Endothelzellen. Diese Aufgabenstellung wurde in folgende Teilaufgaben untergliedert:

2.1.1. Abhängigkeit volumenaktivierter Chloridströme von [ Ca2+i

Viele Funktionen von Endothelzellen werden durch transiente Erhöhungen intrazellulären Kalziums ([Ca2+i) getriggert, so die Freisetzung von Boten - Substanzen in einer Reihe von interzellulären Signalwegen, so bei der Sekretion von PGI2, welches die Aggregation von Thrombozyten hemmt, oder der Synthese von EDRF, das u.a. eine Relaxation glatter Muskelzellen induziert (Newby und Henderson, 1990). Auch eine Reihe von Ionenkanälen in Endothelzellen werden direkt oder indirekt durch [Ca2+i aktiviert, so nichtselektive Kationenkanäle (Popp und Gögelein, 1992). Erhöhungen des [Ca2+i aktivieren keine volumenaktivierten Chloridströme (Nilius et al., 1992). Es konnte jedoch ein inhibitorischer Effekt von Calmodulin - Antagonisten auf volumenaktivierte Chloridströme beobachtet werden (Kirk und Kirk, 1994). Eine Aufgabe dieser Arbeit bestand daher in Untersuchungen zur Aktivierbarkeit volumenaktivierter Chloridströme über einem sehr weiten Bereich von intrazellulären Kalziumkonzentrationen.

2.1.2. Modulation von ICl,Vol durch Cromoglycinsäure

Eine Chloridleitfähigkeit ist in Mastzellen an der Kontrolle sekretorischer Funktionen beteiligt (Romanin, 1991). Diese Leitfähigkeit kann durch


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Cromoglycinsäure geblockt werden. Die Volumenerhöhung von Zellen scheint andererseits eine Rolle bei Entzündungsprozessen zu spielen (Sorota, 1992). Davon ausgehend bestand eine nächste Aufgabe in der Untersuchung der modulatorischen Effekte von Cromoglycinsäure auf volumenaktivierte Chloridströme in Endothelzellen.

2.1.3. Modulation von ICl,Vol durch Tyrosinkinasen, Proteinkinase C und Calmodulin

Protein - Phosphorylierungen zählen zu den grundlegenden intrazellulären Regulationsmechanismen unterschiedlichster Zellfunktionen, so auch von Ionenkanälen. Von Hardy at al. (1995) sowie Robson und Hunter (1994) wurde gezeigt, daß die Proteinkinase C (PKC) Chloridleitfähigkeiten modulieren kann. Dabei handelte es sich jedoch nicht um volumenaktivierte Leitfähigkeiten. Weiterhin gibt es Hinweise auf eine modulatorische Funktion von Tyrosinkinasen auf volumenaktivierte Chloridleitfähigkeiten (Tilly et al., 1993). Der Einfluß solcherartiger Regulationsmechanismen auf die Aktivierung von ICl,Vol in Endothelzellen war bisher noch unklar. Deshalb bestand eine weitere Aufgabe in der Untersuchung von ICl,Vol unter Modulation der PKC, der Tyrosinkinasen selbst, der Tyrosinkinase - Aktivierung via Hitzeschockproteine sowie nachgeschalteter intrazellulärer Signalproteine wie der MAP - Kinasen.

Eine Modulation der MAP - Kinasen - vermittelten Transkriptionsaktivierung könnte auch unter der Hypothese, daß die Aktivierung von ICl,VOL durch eine vermehrte Synthese des Kanalproteins und dessen Inkorporation in die Membran von statten geht, einen Einfluß auf ICl,VOL ausüben.

Zur Untersuchung der Rolle der fokalen Adheasionskinase p125FAK bei der Aktivierung von ICl,Vol sollten zusätzlich Experimente mit Lysophosphatsäure (LPA) erfolgen. Für p125FAK wurde wegen ihrer Funktion als Signaltransduktor zwischen Extrazellularmatrix und intrazellulären Signalwegen auch eine Funktion als Osmosensor vorgeschlagen (Defilippi et al., 1994). LPA führt zu einer gesteigerten Tyrosin - Phosphorylierung an Isoformen der MAP - Kinasen. Es aktiviert aber auch die Tyrosin - Phosphorylierung an der fokalen Adhaesionskinase p125FAK unabhängig von der PKC und von intrazellulärem Kalzium (McLees et al., 1995).

2.1.4. Veränderung der Membrankapazität bei der Aktivierung von ICl,VOL

Weiterhin unbekannt ist die Art der Veränderungen in der Zellmembran, die zur Aktivierung der Chloridleitfähigkeit führt. Als attraktive Hypothese gilt die Vorstellung, es handele sich bei ICl,Vol um ein Kanalprotein, daß primär vorwiegend zytosolisch vorliegt (Krapivinsky et al., 1994). Eine Aktivierung der Leitfähigkeit sollte dann durch die Inkorporation dieser Proteine in die Zellmembran erfolgen (Jackson und Strange, 1995; Hoffmann und Dunham, 1995).


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Es stellte sich deshalb einerseits die Frage, inwieweit durch eine Inhibierung der Proteintranslation und der Vesikelinkorporation die Aktivierung volumenaktivierter Chloridleitfähigkeiten beeinflußt wird und andererseits ob Veränderungen in der Membrankapazität als Maß für die Membranoberfläche unter der Aktivierung volumenaktivierter Chloridleitfähigkeiten zu beobachten sind. Dazu sollten Messungen des volumenaktivierten Chloridstromes nach pharmakologischer Beeinfussung der Vesikelinkorporation sowie die simultane Messung des volumenaktivierten Chloridstromes und der Membrankapazität erfolgen.
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