Heinke, Stephan : "Zur Modulation volumenaktivierter Chloridströme in Endothelzellen"

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Kapitel 3. Materialien und Methoden

3.1. Zellen

Für die Experimente wurde die etablierte Endothelzelllinie CPAE (Cultured Pulmonary Artery Endothelium, ATCC CCL 209) genutzt; sie wurde 1979 initiiert. Die Zellen stammen vom Pulmonalarterien - Hauptstamm des Rindes (bos taurus).

Die Zellen wurden bei einer Temperatur von 370C , einer CO2 - Konzentration von 10% und 99% Luftfeuchtigkeit kultiviert. Als Medium wurde DMEM (Gibco BRL Life Technologies, Paisly, Scottland) mit Zusatz von 20% FKS, 1% nicht essentielle Aminosäuren, 2 mmol/l L-Glutamin, 2 U/l Penicillin und 2 mg/ml Streptomycin verwendet. Das Medium wurde alle 48h gewechselt. Vor dem Aussäen auf Gelatin - beschichteten Kulturschalen wurden die Zellen durch Einwirkung von 0.5 g/l Trypsin in Ca2+ - und Mg2+ -freier Lösung über 180 s vom Boden der Kulturflasche abgelöst. In einem Zeitraum von 2-4 Tagen nach dem Aussäen wurden die Zellen dann für die Experimente genutzt. Es wurden nur nichtkonfluente Zellen verwendet.

3.2. Lösungen

Die verwendeten Lösungen sind in Tabelle 1 in ihrer Zusammensetzung aufgeführt. Der pH wurde in den NaC-haltigen Lösungen mit 1M NaOH , in den KCl haltigen mit 100 mM KOH und in den CsCl haltigen mit 100 mM CsOH eingestellt. Die Osmolarität der fertigen Lösungen wurde mit einem Wescor-5500-Osmometer (Schlag-Instrumente, Gladbach, BRD) gemessen. Die Experimente zum Kapitel 2 (Phosphorylierung, BAPTA, Proteinsynthese) wurden mit einer Krebslösung höherer Osmolaritität durchgeführt, um Spontanschwellungen der Zellen zu verhindern.

Zu jeder hypotonen Lösung wurde durch Zugabe von Mannitol zusätzlich eine Lösung mit der Ausgangsosmolarität verwendet, um die gleiche Konzentrationsveränderungen von membranpermeablen Ionen bei Lösungswechsel während des Experiments auszuschließen.

Für alle Experimente zur Modulation von ICl, VOL wurde anstatt der Standard - Pipettenlösung eine Pipettenlösung verwendet, in der Kalium durch Caesium ausgetauscht wurde (siehe Tabelle 1: Pipettenlösung mit 140 mmol Caesium). Dadurch wurden die Kaliumleitfähigkeiten blockiert. Obwohl das Caesium nur intern appliziert wurde, trat der gewünschte Effekt auch am einwärts - gleichrichtenden Kaliumkanal auf.

Zum Füllen der Pipettenspitze wurde in allen Experimenten jeweils eine Lösung verwendet, die der internen Lösung entsprach, jedoch kein ATP enthielt. Dadurch konnte eine Stimulierung der Zellen durch aus der Pipette diffundierendes ATP verhindert werden.


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Tabelle 3.2.1: Verwendete Lösungen

Name Inhalt   Osmolarität pH
Standardkrebslösung 140mM NaCl    
         
  6mM KCl,    
  1.5mM CaCl2,    
  1.2mM MgCl2    
  11.5mM Hepes    
  10mM Glukose 290 mOsm 7,3
HTS-1 (28%hypoton) 98 mM NaCl    
  6mM KCl,    
  1.5mM CaCl2,    
  1.2mM MgCl2    
  11.5mM Hepes    
  10mM Glukose 209 mOsm 7,3
Isotonische Lösung + 86mM Mannitol 290 mOsm 7,3
zur Lösung HTS-1
Krebslösung 325mOsm 150mM NaCl    
  6mM KCl,    
  1.5mM CaCl2,    
  1mM MgCl2    
  10mM Hepes    
  10mM Glukose 325 mOsm 7,3
HTS-2 (28%hypoton) 105mM NaCl    
  6mM KCl,    
  1.5mM CaCl2,    
  1.2mM MgCl2    
  11.5mM Hepes    
  10mM Glukose 234 mOsm 7,3
Isotonische Lösung zur Lösung HTS-2 + 90mM Mannitol 325mOsm 7,3

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Standart-Pipettenlösung
40mM KCI    
  100mM KAsparatat,    
  2mM Mgcl2    
  10mM Hepes    
  0,1mM EGTA    
  4mM Na2ATP 280 m=sm 7,2
Pipettenlösung mit 140 mval Caesium
  40mM CsCl    
  100mM CsAspartat    
  2mM MgCl2    
  10mM Hepes,    
  0,1mM EGTA    
  4mM Na2ATP 280 mOsm 7,2

Zur Perforation der Zellmembran im Bereich der Pipettenöffnung wurde die Pipettenspitze durch Kapillarkraft von der Spitze aus mit einer 0.4 mg ml-1 Nystatin enthaltende Pipettenlösung und der Rest der Pipette von deren Schaft her mit nystatinfreier Standard - Pipettenlösung gefüllt. Das Nystatin wurde von einer 100 g l- 1 Stammlösung (in DMSO) entnommen, und nach Zusatz zu Pipettenlösung über 30s mit Ultraschall mikronisiert. Die Lösungen wurde täglich frisch hergestellt, um einen Aktivitätsverlust des Nystatin zu vermeiden.

BAPTA - tetracaesium (1,2-Bis (2-aminophenoxy) ethan- N,N,N',N'-tetraacetsäure; Molecular Probes, Eugene, USA) wurde in H2O zu einer 100 mM Lösung bereitet und der Pipettenlösung zugesetzt , das nicht membranpermeable BAPTA-Acetometoxyester (BAPTA-AM; Molecular Probes, Eugene, USA) in einer Konzentration von 5 mM in DMSO gelöst.

Brefeldin A (BFA) (Sigma), von Penicillinum brefeldianum, wurde mit DMSO zu einer 42 mM Stammlösung bereitet. Angewendet wurde es in einer Konzentration von 525nM (6mg ml-1 ).

Cycloheximid (4- [2- (3,5-Dimethyl-2-oxocyclohexyl)-2-hydroxyethyl]-2,6-piperi-dined ione, Sigma) wurde zu 3.55 mM (1mg ml-1) in H2O gelöst und mit einer Konzentration von 35,5 mM (10 mg ml- 1 ) im Experiment verwendet.

Wortmannin (Sigma) wurde in einer Konzentration von 10 mM, hergestellt aus einer Lösung von 10 mM in DMSO, angewandt.


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PMA (phorbol 12-myristate13-acetat , Sigma) wurde in Konzentrationen von 100-500 nM aus einer 1-3 mM DMSO-Lösung appliziert.

Natrium- Arsenite - Lösung 0,1 N (NaAsO2 , E.Merck, Darmstadt, BRD) wurde in einer Konzentration von 0,3 mM angewendet.

Die schnelle Applikation der verschiedenen Lösungen während der Experimente erfolgte über ein Applikationssystem mit 5 elektromagnetischen Ventilen und der Möglichkeit zur Microprozessor-unterstützten Steuerung. Die Mündung des Applikationssystems in der Experimentierkammer wurde vor jedem Experiment 3-5mm seitlich der zu untersuchenden Zelle positioniert. Simultan zur Zuführung von Lösungen erfolgte das Absaugen aus der Experimentierkammer, so blieb der Flüssigkeitsspiegel in der Experimentierkammer stabil. Das gesamte Applikationssystem wurde einmal täglich und nach jedem Wechsel der Lösung über 30 min mit Aqua bidestillata gespült. Alle Experimente wurden bei Raumtemperatur zwischen 20-22 °C durchgeführt.

3.3. 'patch clamp' - Technik zur Messung von transmembranären Strömen

Die Messung von transmembranären Ionenströmen erfolgte unter Nutzung der 'wohle cell' -Variante der durch Hamill at al. (1981) beschriebenen 'patch clamp'-Technik . Es wurden Glaspipetten mit Widerständen zwischen 5 und 10 MOhm verwendet. Zur Herstellung der 'whole cell' - Konfiguration wurde die Zellmembran nach Formung des 'seals' durch plötzlichen Unterdruck in der Pipette rupturiert oder mit der Ionophore Nystatin (zur Anwendung siehe oben) perforiert.

Als Verstärker für den gemessenen Membranstrom diente ein EPC-7 (List Electronic, Darmstadt) oder ein EPC-9 (Heka Electronics, Lamprecht, Pfalz). Die Messwerte wurden in Echtzeit mit einer Abtastrate von 0,25 kHz digitalisiert, mit einem 100 Hz - Filter gefiltert und in einem PC gespeichert.

Als Protokoll für das Kommandopotential wurde standardmäßig eine Spannungsrampe genutzt. Diese war wie folgt strukturiert: von 0 mV zu einem Schritt über 1.2s bei -80mV und einem weiteren über 0.4 s bei -150 mV folgte eine lineare Rampe über 5.2 s von -150 zu + 100 mV, dann weiter mit 0 mV (Abbildung 3.3.1). Dieses Protokoll wurde alle 15 s wiederholt.

Die Messungen des Membranpotentials erfolgten im 'current clamp' Modus, die Messwerte wurden mit dem Programm 'FURA' auf dem zur Messung des [Ca2+i genutzten ATARI-Computersystems registriert. Für die Übertragung des MP-Wertes zum ATARI-System wurde der Analogausgang des EPC-9 genutzt.


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Abbildung 3.3.3-1: Aufbau der verwendeten Protokolls für das Kommandopotential (HP) in der Art einer Rampe. Die Zeitdauer für das Protokoll beträgt 6,8 Sekunden. Alle 15 Sekunden wurde das Protokoll wiederholt. Zwischen zwei Protokollen blieb das HP auf einem Wert von 0 mV.

3.4. Messung der intrazellulären Kalziumkonzentration

Die Zellen wurden mit 4 mM FURA 2 - AM (Molecular Probes, Eugene, USA) für 20 min bei Raumtemperatur und anschließend weitere 20 min bei 37 °C inkubiert. In der AM-Form ist das FURA verestert und damit membranpermeabel. In der Zelle wird der Ester durch intrazelluläre Esterasen hydrolysiert. Das unveresterte FURA ist nicht mehr membrangängig, auf diese Weise erfolgt eine Akkumulation des FURA in der Zelle (Grynkiewics at al., 1985). Die zweizeitige Inkubation wird durchgeführt, um eine gute Diffusion des FURA in die Zelle zu erreichen, gleichzeitig aber die Zeit zur Wirkung der Esterasen möglichst kurz zu halten. Denn während der Hydrolyse entstehen Aldehyde, die die Zelle schädigen können.

Nach der Inkubation wurden die Zellen 15 min mit Krebslösung gewaschen, um nicht hydrolysiertes FURA zu entfernen.

Das Messsystem für [Ca2+i basiert auf der Messung des durch FURA emmitierten Fluoreszenzsignals mit einem Photomultiplier (Hamamatsu, Japan). Das optische System besteht aus einem Invert-Mikroskop (Zeiss IM 10), einer Xenon-Leuchtquelle, einem Filterrad sowie Verstärker und Controller (Luigs & Neumann, BRD) für den Photomultiplier. Die Technik basiert auf einer Beschreibung durch Neher (1989). Die Zellen werden durch das Filterrad abwechselnd mit Licht der Wellenlängen 360 nm und 390 nm beleuchted. Das in den Zellen enthaltene FURA fluoresziert abhängig von der gebundenen Menge Kalzium. Diese ist abhängig von


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der Konzentration des freien Ca2+i in der zu messenden Lösung. Die Konzentration des freien Ca2+i wird wie folgt berechnet (Grynkiewics at al., 1985) :

( 1 )

KEFF ist die Bindungskonstante des FURA für Ca2+, R0 der Quotient aus den Intensitäten des Fluoreszenzsignals bei 360 und 390 nm bei einer nominalen Kalziumkonzentration von 0 mV , R1 entspricht diesem Quotienten unter vollständiger Sättigung des FURA mit Ca2+. Diese Werte werden wähernd eines Kalibrierungsvorgangs mit entsprechenden Lösungen ermittelt. R stellt dann den genannten Quotienten bei Messung der Messprobe dar. Die Hintergrund-Fluoreszenz (Auto-Fluoreszenz) wird vor Beginn des Experiments in einem zellfreien Bereich der Meßkammer gemessen und später während des laufenden Experiments automatisch von den Messwerten subtrahiert.

Zur Datenaufnahme und -Darstellung in Echtzeit wurde ein 8-Kanal Analog / Digital - Konverter (Labinterface LIH-12, Firma Heka, Lambrecht / Pfalz, BRD) in Verbindung mit einem ATARI Mega- 4 - PC genutzt. Damit konnten in Echtzeit mit einer Abtastrate von 2 Hz beide Fluoreszenzsignale (bei 360 und 390 nm), Pipettenstrom und Haltepotential digitalisiert, im ATARI-PC gespeichert und mit der errechneten freien [Ca2+i - Konzentration auf dem PC-Bildschirm dargestellt werden.

Zum Ausschluß von Artefakten durch externe Lichtquellen erfolgten die Messungen in einem verdunkelten Raum unter Rotlicht.

3.5. Kapazitätsmessungen

Für die Messung der Membrankapazität CM wurden zwei verschiedene Messysteme angewendet. Es wurden die Änderungen von CM als Ausdruck der Zellschwellung unter externer Applikation hypotoner Lösung untersucht.

3.5.1.1. A) System auf Basis der Applikation eines rechteckförmigen Gleichspannungsimpulses

Das EPC-9-System erlaubt die kontinuierliche Messung der Membrankapazität. Dabei wird über die Mikropipette nach Einstellung einer 'whole cell' Konfiguration ein rechteckförmiger 5 mV Gleichspannungsimpuls appliziert. Der dabei fließende Strom resultiert in seiner Summe aus der Ladung des 'Kondensators Zellmembran' und dem Stromfluß am seriellen Widerstand des Meßsystems RS.


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Aus der Zeitkonstante t dieser Stromantwort wird die Kapazität wie folgt berechnet:

( 2 ) t = RS* CM

RS wird aus dem Leckstrom, der am Ende des Impulses noch fließt ('Kondensator ist geladen'), errechnet. Softwaregestützt wird t durch einen stufenweisen Abgleich auf das gemessene Stromsignal bestimmt.

Zur Registrierung wurde die Möglichkeit genutzt, mit dem EPC-9 diesen Abgleich kontinuierlich hintereinander ausführen zu lassen. Die Abtastfrequenz ist nicht konstant, da der stufenweise Abgleich jeweils eine unterschiedlich lange Zeit in Anspruch nimmt (0 < t < 30s). Das Signal enthält einen relativ hohen Rauschanteil.

Die gemessenen Werte von Rs und Cm wurden automatisch über eine Analogschnittstelle des EPC 9 zum Analog - Digital - Wandler des Kalzium - Meßsystems übertragen und mit dem Programm FURA parallel zu den Intensitätswerten der Kalziummessung und zum gemessenen Membranstrom registriert.

3.5.1.2. System auf Basis der Applikation einer sinusförmigen Wechselspannung

Diese Methode basiert auf Messung von Höhe und zeitlicher Verschiebung des Stroms, der während eines sinusförmigen Wechselspannungsimpulses an einem Kondensator fließt. Der Vorteil der Messmethode gegenüber der des EPC-9-Systems liegt in stabiler Messfrequenz und exakteren Messergebnissen bei sich veränderndem Membranwiderstand.

Das in den hier vorgestellten Experimenten benutzte System wurde von Ing. Geert Raskin, Physiologisches Institut der KU Leuven, entwickelt. Es besteht aus folgenden Komponenten:

Zwei sinusförmige Spannungsimpulse (240 und 360 Hz) mit einer Amplitude von 5 mV wurden alternativ an die Zellmembran appliziert. Strom und Spannung wurden unter Verwendung einer Multiplex - Schaltung mit einer Frequenz von 17280 Hz


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analog - digital - gewandelt . Dieser Aufbau erlaubt die Nutzung von nur einer Schaltung für die Verstärkung und Filterung beider Signale und minimiert so die Phasenverschiebung durch das Gerät.

Die Membrankapazität wurde auf der Basis eines Schaltungsmodells bestehend aus parallel angeordneter equivalenter Membrankapazität CM und Membranwiderstand RM und in Serie dazu der Serienwiderstand RS errechnet. Diese Parameter können mit dem Messsystem 3 mal pro Sekunde ermittelt werden. Die Streuung der ermittelten Werte für CM betrug bei Messungen an einer Simulationsschaltung weniger als 0,8 pF.

Der Wert für CM wird vom PC zurück an die externe Schaltung übertragen und dort in ein analoges Gleichspannungssignal gewandelt. Dieses wird zum AD-Konverter des Kalzium-Messystems übertragen und mit dem Programm FURA parallel zu den Messwerten aus Kalziummessung und Strommessung registriert.

Das System arbeitete zufriedenstellend und wurde nach Ausreifung dem Erstgenannten vorgezogen. Die durch die unterschiedlichen Systeme ermittelten Kapazitätswerte gleicher Messobjekte unterschieden sich nicht. Dazu führten wir mehrere Serien von Probemessungen sowohl an einem eigens dazu ebenfalls von G.Raskin hergestellten Simulator als auch an Zellen unter realen Experimentierbedingungen (HTS-Applikation) durch.

Die Stromaktivierung und -deaktivierung wurde mit allen Systemen durch laufende Messung bei einem HP = +20 mV verfolgt und ebenfalls mit dem Programm FURA parallel zu CM registriert.

3.6. Messung der Zellhöhe

Um Aussagen zu Volumenänderungen von Zellen zu gewinnen wurde ein System zur Messung der Zellhöhe verwendet. Es basiert auf der automatischen Fokussierung von fluoreszierenden Teilchen durch ein 'piezoelectric focusing device' (PIFOC). In die Messkammer mit den am Boden haftenden Zellen wird eine zusätzliche Lösung eingebracht, die fluoreszierenden Teilchen enthält. Ein Teil der Teilchen setzt sich am Boden der Kammer ab, ein anderer Teil auf der Oberfläche der Zellen. Unter mikroskopischer Kontrolle werden Teilchen auf Zelloberflächen und am Boden als Messpunkte für das System festgelegt.

Bis zu 80 Zellen können so pro Experiment gleichzeitig vermessen werden. Unter dem Experiment wird der Abstand zwischen auf dem Boden der Kammer und auf der Oberfläche der Zellen abgelagerten Teilchen durch wechselnde Fokussierung mit Hilfe des PIFOC gemessen. Diese Distanz entspricht der Höhe der Zellen. Eine ausführliche Beschreibung des Systems wird durch Van Driesche et al. (1993) gegeben.


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3.7. Statistik

Die statistischen Auswertungen wurden mit dem PC-Programm ORIGIN für Windows, Version 3.7 (Microcal Software Inc. , Northhampton , MA, USA) ausgeführt, die Grafiken mit ORIGIN und GEODRAW angefertigt. Die Arbeit wurde mit dem Textsystem GEOWRITE editiert. GEODRAW und GEOWRITE sind Bestandteil der graphischen Benutzeroberfläche PC-Geoworks (Geoworks Inc. , Berkley, CA, USA).


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