Heinke, Stephan : "Zur Modulation volumenaktivierter Chloridströme in Endothelzellen"

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Kapitel 4. Ergebnisse

4.1. Der Einfluß intrazellulären Kalziums auf volumenaktivierte Chloridströme

Die Rolle intrazellulären Kalziums bei der Aktivierung volumenaktivierter Chloridströme ist noch nicht völlig aufgeklärt, jedoch galt ICl,VOL bisher als Ca2+ - unabhängig (siehe Einleitung). Experimente zur direkten Untersuchung der Kalzium-Abhängigkeit von ICl,Vol durch direkte Messung des [Ca2+i simultan zur Messung des volumenaktiverten Stromes mittels 'patch-clamp' - Technik unter Variation des [Ca2+i über einen weiten Bereich wurden bisher jedoch nicht durchgeführt.

In den hier beschriebenen Experimenten wurden die Stromamplituden des HTS-induzierten Chloridstromes unter Kontrollbedingungen und nach Pufferung des intrazellulären Kalziums durch die Kalzium-Chelatoren BAPTA und EGTA gemessen. Dazu erfolgten Messungen mit zuerst lediglich perforiertem und nachfolgend rupturiertem 'patch' an jeweils ein und der selben Zelle. Nach Ruptur der Zellmembran im Bereich der Pipettenöffnung wurde die Zelle mit der Pipettenlösung durchströmt, welche unterschiedliche, mit BAPTA oder EGTA gepufferte Kalziumkonzentrationen enthielt. Weiterhin erfolgten Messungen nach Inkubation der Zellen mit BAPTA - AM.

4.1.1. Inkubation mit BAPTA-AM

BAPTA ist in der AM-Form verestert und damit lipophil und membranpermeabel. In der Zelle wird der Ester durch intrazelluläre Esterasen hydrolysiert. Das unveresterte BAPTA ist nicht mehr membranpermeabel, auf diese Weise erfolgt unter Inkubation mit BAPTA eine Akkumulation in der Zelle. In dem hier vorgestellten Experimenten wurden die Zellen mit 50 mM BAPTA-AM über 1h durch Zusatz des Chelators in das Kulturmedium bei 37 °C inkubiert.

Der durch HTS induzierte Strom als Mittel von 5 Zellen betrug nach der Inkubation noch 6.2 + 1.3 pA/pF. Ein Strom unter 28% HTS war also noch auslösbar, jedoch nach Inkubation deutlich reduziert. Die Ergebnisse im Vergleich mit Ladung via Pipette und Kontrollösung (enthält 0.1 mM EGTA) zeigt die Abbildung 4.1-1.

4.1.2. Messung unter Pufferung des intrazellulären Kalziums mit BAPTA und EGTA via Pipette

Während der Inkubation mit BAPTA-AM entstehen in der Zelle durch Spaltung des Esters Aldehyde, das Prinzip entspricht dem der Inkubation mit FURA (Grynkiewics at al., 1985). Um einen schädigenden Einfluß dieser Aldehyde auf die Zelle als


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auslösende Ursache für die Verminderung des volumenaktivierten Chloridstromes auszuschliessen, wurde das [Cai durch Diffusion der BAPTA enthaltenden Pipettenlösung via rupturierten 'patch' gepuffert. Der Pipettenlösung wurden dazu 5 mM BAPTA zugesetzt.

Abbildung 4.1-1: CPAE, mit 28% HTS induzierter Strom bei einem HP von -80 mV, Vergleich zwischen Inkubation mit 50 mM BAPTA-AM über 1h, Ladung via Pipettenlösung (enthält 5 mM BAPTA), und Kontrollösung (enthält 0.1 mM EGTA).

Die Konzentration mußte so hoch gewählt werden, da im Vergleich zur Inkubation mit BAPTA-AM keine Akkumulation des BAPTA erfolgt. Ganz im Gegenteil diffundiert das BAPTA durch die relativ kleine Öffnung der Pipette nur langsam in das Zytosol.

Die extrazelluläre Lösung enthielt 5 mM Cs+. Der HTS-induzierte Strom wurde bei einem Haltepotential von -80 mV gemessen. Das entspricht nahezu dem Kalium-Umkehrpotential. Der Anteil von K+ - Strömen ist daher nur minimal. Das Umkehrpotential des HTS-induzierten Stromes liegt mit -19 mV nahe dem errechneten Chlorid-Umkehrpotential von -23 mV.

Das Experiment lief wie folgt ab: Der 'patch' wurde zuerst mit der Ionophore Nystatin perforiert. So erzeugte Membranperforationen sind nur für monovalente Ionen permeabel. BAPTA-Moleküle sind zu groß, um durch die Membranperforationen zu diffundieren.

Danach erfolgte die erste Applikation von HTS. Nach Auswaschen wurde der 'patch' rupturiert. Das ist nach Nystatinperforation relativ leicht auszuführen. Ein Eindringen des Nystatins in das Innere der Zelle wird dabei als nicht kritisch


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angesehen, da der Wirkungsmechanismus des Nystatins auf der extrazellulären Bindung an Membransterole und folgende Bildung einer für monovalente Ionen permeable Pore beruht (Forth et al., S. 681-690). Die durch Diffusion des Stoffes durch die im Bereich der Pipettenöffnungung rupurierte Membran intrazellulär erreichte Konzentration ist wesentlich geringer als die in der Pipette. Für Nystatin (MW=979) kann die Zeitkonstante dafür mit der von Fura-Pentapotassium (MW=832) verglichen werden (154 s; Fabio et al.,1994). Die Messungen in den hier vorgestellten Experimenten erfolgten etwa 10-200s nach Rupturierung des 'patches'. Weiterhin ist der Anteil von Cholesterol an den Membranen intrazellulärer Kompartimente (3-6%) wesentlich geringer als in der Zellmembran (17-23%; Alberts et al., 1994; Kap.10, S.482).

In allen Messungen konnte mit Öffnung der Membran für BAPTA eine sofortige Verringerung des [Ca2+i auf Werte unter 10 nmol/l beobachtet werden, das [Ca2+i war jedoch noch messbar. Dieser Effekt ist am Beispiel einer Zelle in der Abbildung 4.1-2 D zu verfolgen. Nach der Rupturierung erfolgte eine weitere Applikation von HTS. Abbildung 4.1-2 A zeigt den Strom während des Experiments bei einem Haltepotential von -80 mV .

Der unter HTS maximal aktivierte Strom ist nach Beladung der Zelle mit BAPTA via Pipette und folgender starker Verringerung des [Ca2+i wesentlich geringer, die Zeit zu seiner maximalen Aktivierung länger als während der HTS-Stimulation bei perforiertem 'patch', d.h. unter physiologischem [Ca2+i .

In der Zusammenfassung von 5 Experimente verringerte sich der Strom um folgende Beträge (Mittelwert / SEM): von 16.2 + 2.1 pA / pF im Nystatin-perforierten 'patch' auf 2.2 + 0.5 pA / pF nach Rupturierung. Die nach Rupturierung gemessenen Werte sind in Abbildung 4.1-1 im Vergleich zu Messungen nach Vorinkubation mit 50 mM BAPTA-AM über 1h und Kontrollmessungen mit Perforierung (Pipettenlösung mit 5 mM BAPTA , jedoch vor Rupturierung) dargestellt. Unter dem Einfluß von BAPTA kommt es kaum noch zur Aktivierung eines Stroms nach Applikation von HTS, und das unabhängig von der Art der Applikation des BAPTA.

Ein ähnlicher Effekt konnte in weiteren Experimenten beobachtet werden, in denen EGTA als Chelator des intrazellulären Kalziums verwendet wurde. Das EGTA wurde der Pipettenlösung zugesetzt, das Protokoll gleicht dem der Applikation von BAPTA via Pipette.

Es wurde jedoch wie folgt modifiziert: nach Formung eines Nystatin - perforierten 'patch' erfolgte die HTS-Applikation. War der HTS-induzierte Strom maximal aktiviert, so wurde der 'patch' rupturiert. Danach zeigte das [Ca2+i das gleiche Verhalten wie in den entsprechenden Experimenten mit BAPTA, es verringerte sich in wenigen Sekunden auf Werte nahe 0 nM. Daraufhin verringerte sich auch der aktivierte Strom, um trotz laufender HTS-Applikation nach etwa 1 min nahezu auf seinen Ausgangswert vor der HTS-Stimulation zu sinken (Daten nicht gezeigt).


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Abbildung 4.1-2: Experiment mit Applikation von 28% HTS beginnend unter Kontrollbedingungen bei Nystatin-perforiertem 'patch' (A). Nach Auswaschen Rupturierung, dadurch BAPTA-Beladung der Zelle via Pipettenlösung (enthält 5 mM BAPTA), dann erneute Applikation von 28% HTS (B).


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Die starke Verringerung von [Ca2+i auf Konzentrationen unter 10 nmol/l sowohl durch BAPTA als auch durch EGTA verhinderte also die Aktivierung oder führte zu einer Inaktivierung von ICl,VOL.

Eine nächste Reihe von Experimenten sollte zeigen, inwieweit [Ca2+i volumenaktivierte Chloridströme moduliert. Mit rupturierten 'patches' unter Anwendung von Pipettenlösungen unterschiedlicher Kalziumkonzentration wurde ICl,VOL gemessen. Dabei konnten in einem Konzentrationsbereich von 50 - 1000 nmol/l Ca2+ keine Veränderungen im maximal aktivierten Strom oder in der Kinetik von ICl,VOL beobachtet werden. Das heißt, ICl,VOL konnte bereits in Gegenwart von 50 nmol/l Ca2+ maximal aktiviert werden. Eine weitere Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration veränderte die Stromamplitude nicht weiter.


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4.2. Einfluß von Cromoglycinsäure auf volumenaktivierte Chloridströme in Endothelzellen

In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluß von Cromoglycinsäure (CL) auf volumenaktivierte Chloridströme in CPAE-Zellen untersucht. Die Abbildung 4.2-1C zeigt den Effekt von 100 mM CL auf den volumenaktivierten Strom an einer CPAE-Zelle. Der Strom verringert sich nur langsam , der volle Effekt ist erst nach etwa 100 s erreicht. Nach dem Auswaschen des CL erhöht sich der Strom ebenso langsam.

Abbildung 4.2-1: Effekt von NPPB (100 mM) und Cromoglycinsäure (CL , 100 mM) auf volumenaktivierte Chloridströme in CPAE.


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Im Strom - Spannungs - Diagramm (Abbildung 4.2-1 D) ist die Aktivierung eines Stromes mit einem Umkehrpotential von +7mV zu sehen, was fast dem errechnetem Umkehrpotential für Chlorid in diesen Experimenten (+9 mV) entspricht. Dieser Strom wird durch 100 mM CL also nur teilweise geblockt. In Kontrast dazu tritt der Effekt von NPPB in der gleichen Konzentration sehr schnell ein (nach weniger als 20 s) , der volumenaktivierte Strom wird fast vollständig geblockt (Abbildung 4.2-1 A, B). CL blockt also den volumenaktivierten Chloridstrom an Endothelzellen im Vergleich zum Effekt von NPPB nur geringgradig und langsam. Ähnliche Ergebnisse wurden unter extrazellulärer Applikation von Nedocromil, einem C-Analogon, beobachtet (keine Abbildung).

In weiteren Experimenten wurde die Aktivierung des volumeninduzierten Chloridstroms unter Anwesenheit von CL bereits vor Applikation der hypotonen Lösung beobachtetet. Die Zeit für eine halbmaximale Aktivierung des Stromes war unter 100 mM CL wesentlich verlängert: von 148 + 10 s (n=6) unter Kontrollbedingungen auf 253 + 25 s (n=6).

Zur Quantifizierung des Effektes wurde die Amplitude des HTS-induzierten Stromes unter CL geteilt durch jene ohne CL und als Funktion der C-Konzentration dargestellt. Die Punkte wurden nach folgender Gleichung ermittelt:

( 3 )

Ki stellt die C-Konzentration für halbmaximalen Block dar , [CL] die Konzentration von CL. Der Wert von Ki beträgt im besten Fit 310 ± 70 mM. Typische Messungen dazu unter verschiedenen C-Konzentrationen zeigt Abbildung 4.2-2.

Der für Ki ermittelte Wert zeigt eine geringere Sensitivität des volumenaktivierten Chloridstromes auf CL in Endothelzellen als jener in Mastzellen (Reinspecht et al., 1992).

Es wurden ebenfalls Experimente unter intrazellulärer Applikation von CL durchgeführt. Dazu wurde das CL der Pipettenlösung zugesetzt und die Zelle via rupturierten Patchs mit CL beladen. Im Gegensatz zur extrazellulären Applikation betrug Ki hier nur 5-10 mM. Die Abbildung 4.2-3 A zeigt die Konzentrationsabhängigkeit des Effektes intrazellulär applizierten CL auf den volumenaktivierten Strom an 3 verschiedenen Zellen, der volumenaktivierte Strom wurde nach Subtraktion des Stroms vor HTS durch die Membrankapazität dividiert. Einen Vergleich der Effekte bei intra- und extrazellulärer Applikation erlaubt Abbildung 4.2-3 B.

Abbildung 4.2-2: Effekt von extrazellulär appliziertem CL auf den HTS - induzierten Strom am Beispiel von 3 CPAE. Der helle Balken markiert die CL - Applikation.


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Abbildung 4.2-3: Effekte von intra- und extrazellulär applizierter CL, der Strom wurde in einem HP-Fenster von 90-100 mV gemessen.


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In Abbildung 4.2-4 sind die Ergebnisse eines Experimentes aufgezeigt, in dem nach Rupturierung mit 5 mM CL in der Pipettenlösung repetitiv mit HTS stimuliert wurde. Mit der Zeitspanne nach Rupturierung verringerte sich der HTS-induzierte Strom erheblich, um nach 14 min einen konstanten Wert zu erreichen.

Die Zeitkonstante dazu beträgt 140 s und ist vergleichbar mit der Diffusion des Salzes Fura-Pentapotassium (MW=832) aus der Pipettenlösung durch die Öffnung eines rupurierten Patches in die Zelle, die Zeitkonstante dafür beträgt 154s (Fabio et al.,1994).

Abbildung 4.2-4: Volumenaktivierter Strom bei intrazellulärer Applikation von Cromoglycinsäure (CL), gemessen in einem HP-Fenster zwischen +90 und +100 mV:

Das Diffundieren des CL durch den rupturierten Patch scheint der limitierende Schritt bei der Wirkung von CL intrazellulär zu sein. Diese Ergebnisse sowie die Tatsache, daß auch sehr hohe Konzentrationen von CL nur relativ geringe Effekte zur Folge haben lassen vermuten, daß CL seinen eigentlichen Wirkungsort intrazellulär hat und bei extrazellulärer Applikation erst langsam durch die Membran diffundiert.


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Zur Klärung dieser Vermutung diente folgendes Experiment: Die Zellen wurden im Kulturmedium bei 37 oC über 120 min mit 100 mM CL inkubiert, danach das CL ausgewaschen. Die HTS-induzierten Stöme waren geringer als in den Kontrollzellen: 12 + 3 pA/pF (n=3) im Vergleich zu 37 + pA/pF (n=7) in der Kontrolle. Jedoch stieg der Strom unter HTS nach sehr langer Auswaschzeit mit CL - freier Lösung auf 21+ 4 pA/pF (n=3) an . Das wiederum spricht gegen eine Diffusion des CL nach intrazellulär.


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4.3. Modulation volumenaktivierter Chloridströme durch Phosphorylierungsreaktionen

4.3.1. Modulation von Tyrosinkinasen

Volumenaktivierte Chloridströme sind in ihrer Charakteristik und zunehmend auch in ihrer Funktion untersucht. Die Mechanismen ihrer Aktivierung und ihre Modulation sind jedoch noch weitgehend ungeklärt.

Reversible Phosphorylierungen stellen die vorherrschende Strategie zur Aktivitätskontrolle von Proteinen in Eukaryoten dar. Die im folgenden dargestellten Experimente sollten untersuchen, inwieweit solche Mechanismen auch bei der Modulation volumenaktivierter Chloridströme eine Rolle spielen. Dazu wurde der Einfluß von an verschiedensten Punkten in bereits bekannte intrazelluläre Signalwege (siehe Einleitung) eingreifenden Stoffe auf volumenaktivierte Chloridströme in CPAE untersucht .

Durch Tilly et al. (1993) konnten Veränderungen an Ionenleitfähigkeiten durch Tyrosinkinase - induzierte Prozesse dokumentiert werden. In den hier beschriebenen Experimenten wurde sowohl die Tyrosinkinase inhibiert als auch Tyrosinkinase - induzierte Subprozesse direkt beeinflußt, da einige dieser Subprozesse wie z.B. der MAP - Kinase - Signalweg auch durch G - Protein - gekoppelte Rezeptoren induziert werden können (Cook et al., 1993; Winitz et al., 1993).

Herbimycin A ist ein Tyrosinkinase - Inhibitor (Uehara et al., 1989; June et al., 1990). Weder nach direkter Applikation noch nach Vorinkubation über 48h beeinflußte Herbimycin A in einer Konzentration von 1 mM den HTS - induzierten Chloridstrom (Daten nicht gezeigt).

Lysophosphatsäure (LPA) ist ein G - Protein - Agonist und führt dadurch zu einer gesteigerten Tyrosin - Phosphorylierung und Aktivierung der p42 - Isoform der MAP - Kinasen in der Endothelzell - Linie EAhy 926 (McLees et al., 1995). LPA induziert aber auch die Tyrosin - Phosphorylierung an der fokalen Adhaesionskinase p125FAK unabhängig von der PKC und von intrazellulärem Kalzium.

Es wurde der Effekt von 1 mM LPA nach Applikation auf CPAE - Zellen in isotoner Lösung untersucht. Weder nach 15 min noch nach 30 min Applikationsdauer wurde ein Chloridstrom induziert. Nach darauffolgender Applikation von hypotoner Lösung konnte ein Chloridstrom aktiviert werden, der dem unter Kontrollbedingungen entsprach. LPA beeinflußte also die Aktivierung des ICl,VOL nicht.


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Wortmannin blockt die Aktivierung von MAP - Kinasen in einer Reihe von Zelltypen (Ferby et al., 1994; Cross et al., 1994; Welsh et al., 1994) und greift so zentral in die Tyrosinkinase - induzierte Aktivierung der Transkription ein. Weiterhin inhibiert es die Phosphatidylinositol-(PI)-3-kinase (Arkaro und Wymann, 1995; Kanai et al., 1993), welche an Aktin - Elemente des Zytoskeletts koppelt. Wortmannin wurde in einer Konzentration von 10 mM über 6 und 12 min nach maximaler Aktivierung von ICl,VOL appliziert. In keinem der Protokolle konnte ein sicherer Effekt auf ICl,VOL beobachtet werden (Abbildung 4.3.1), die registrierten Unterschiede in den Mittelwerten des HTS-induzierten Stromes sind statistisch nicht signifikant.

Neben der MAP - Kinasen - Phosphorylierungskaskade wurde ein weiterer Tyrosinkinase - induzierter intrazellulärer Signalweg auf seine Rolle bei der Aktivierung von ICl,Vol hin untersucht. Dieser wird durch die p70 s6k - Kinase induziert. Sie kann selektiv durch Rapamycin inhibiert werden (Chung et al., 1992; Kuo et al., 1992; Price et al., 1992). Rapamycin wurde in einer Konzentration von 0,1 mM über 10 - 25 min nach maximaler Aktivierung von ICl,VOL appliziert. Es konnte keinerlei Veränderungen in der Höhe des Stromes registriert werden.

Abbildung 4.3-1: HTS-induzierte Ströme [pA] unter Kontrollbedingungen sowie nach 6 und 12 min Inkubation mit 10 mM Wortmannin.

4.3.2. Modulation durch streßinduzierte Phosphorylierungsreaktionen

Unter chemischem und thermischem Stress kommt es zu einer Phosphorylierung des 'heat-shock transcribtion factor' (HSF); dadurch wird die Synthese von Hitzeschockproteinen (HSP) induziert. Um einen möglichen Einfluß dieses Vorgangs oder der dadurch gebildeten HSP auf ICl,Vol festzustellen, wurden CPAE - Zellen chemischem und thermischem Stress ausgesetzt und nachfolgend der volumenaktivierte Strom mit Hilfe der 'patch clamp' -Technik untersucht. Simultan wurde die Konzentration des intrazellulären Kalziums gemessen (siehe dazu 'Materialien und Methoden').

Chemischer Streß zur Induzierung von HSP wurde durch Natriumarsenit erzeugt und damit dem Vorgehen von Yiu et al. (1993) und Levinson et al. (1980) gefolgt.


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Natriumarsenit induziert die Bildung aller HSP-Subtypen von HSP32 bis HSP110 (Yiu et al, 1993). Es wurden 0.3 mM Natriumarsenit über 30 min und länger appliziert. Ein Einfluß auf die Größe oder den Zeitverlauf des HTS-induzierten Strom konnte nicht beobachtet werden (Abbildung 4.3.2 A,B).

Zur Applikation von thermischem Stress in Form eines Hitzeschocks wurden die Zellen über 25 oder 60 min bei 42 bis 45 °C inkubiert. Wiederum war keinerlei Effekt auf ICl,VOL sichtbar, auch nach 60 min 45 °C waren weder in Zeitverlauf der Aktivierung noch in Strom - Spannungs - Kurve Veränderungen sichtbar (Abbildung 4.3.2 C).

Abbildung 4.3.2: HTS-induzierte Ströme nach Hitze - und chemischem Streß, gemessen bei - 80 mV Haltepotential.


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4.3.3. Modulation durch die Proteinkinase C

Den Ausgangspunkt für diese Experimente stellte die Arbeit von Hardy et al. (1995) dar. In ihr wurde die Regulation von volumenaktivierten Chloridströmen durch die PKC via Phosphorylierung des MDR - P - Glycoproteins gezeigt. PMA ist unmittelbar nach Kontakt ein Aktivator der PKC, bei Inkubation über mehrere Stunden kommt es dann zu einer Abregulation der PKC - Aktivität (Hardy at al., 1995).

Unter direkter Applikation des PMA wurden selbst mit Konzentrationen von 0.5 mM keinerlei Effekte beobachtet (Abbildung 4.3-3). Auch eine Abregulierung der PKC - Aktivität durch Inkubation der Zellen mit 200 nM PMA über 24 h bewirkte keine Änderung des volumenaktivierten Chloridstromes. Jedoch zeigten 4 von 13 Zellen nach repetitiver Applikation von HTS einen verstärkten 'run-down' (Abbildung 4.3-4).

Abbildung 4.3-3: Statistischer Vergleich der durch 28% HTS induzierten Ströme bei -80 mV HP unter Kontrollbedingungen , nach PMA - Applikation (ab maximalem HTS - induziertem Strom 0,2 - 0,5 mM über 2-8 min) und nach Inkubation mit 0,1 und 0,2 mM über 24h


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Abbildung 4.3-4: Zwei Messungen von durch 28% HTS induzierten Strömen bei -80 mV Haltepotential.


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4.4. Werden volumeninduzierte Chloridströme durch Inkorporierung eines Kanalproteins aktiviert ?

4.4.1. Änderungen der Membrankapazität bei der Aktivierung volumeninduzierter Chloridströme

Bei Exposition von Endothelzellen zu hypotoner Lösung wird eine Schwellung der Zelle und ein auswärts gleichrichtender Chloridstrom induziert. Der Aktivierungsmechanismus dieses Stroms ist noch nicht bekannt. Es wurde eine Theorie dazu vorgeschlagen, nach der eine Veränderung des Zellvolumens die Inkorporation von Kanalproteinen triggert. Diese Kanalproteine müßten dann primär überwiegend zytosolisch und nur zum Teil membrangebunden vorliegen und eine hohe Öffnungswahrscheinlichkeit besitzen.

Wenn die Proteine vom endoplasmatischen Retikulum (ER) nach ihrer Bildung von Vesikeln umhüllt werden und die Inkorporation in die Zellmembran durch die Fusion dieser Vesikel mit der Zellmembran erfolgt, dann müßten Änderungen der Membrankapazität CM mit der Aktivierung des Chloridstroms korrelieren.

Bei Exposition von Endothelzellen zu hypotoner Lösung fielen zwei Reaktionstypen hinsichtlich der Veränderung der Membrankapazität auf (Abbildung 4.4-1).

Die Mehrzahl der Zellen reagierte nach extrazellulärer Applikation einer 28% hypotonen Lösung bei einem Haltepotential von +20 mV mit der Aktivierung eines Stroms, jedoch ohne eine Veränderung von CM, d.h. die Veränderung von CM waren geringer als 2% der Membrankapazität unter isotoner Lösung (Gruppe 1, Abbildung 4.4.1, A1-C1). Die durchschnittliche Änderung von CM betrug zusammengefasst für 17 Zellen 1,1 ± 0,2 % des initialen Wertes vor Beginn der Zellschwellung. Es ist offensichtlich, daß für diese Zellen die Aktivierung des Stroms nicht mit der Veränderung von CM korreliert.

In den verbleibenden 5 Zellen konnte jedoch eine Vergrößerung der Membrankapazität beobachtet werden (Gruppe 2, Abbildung 4.4.1, A2-C2). Diese betrug jedoch niemals mehr als 14 % des initialen Wertes, auch nicht, wenn eine 50% hypotone Lösung appliziert wurde. Für diese Gruppe erhöhte sich CM im Mittel um 10,6 ± 0,9 %.

Die Korrelation zwischen Strom und Membrankapazität für die jeweiligen Experimente sind in Abbildung 4.4.1, C1 und C2 dargestellt. Deutlich sichtbar ist, daß die Aktivierung des Stroms wie auch seine Deaktivierung nach Rückkehr zu isotoner Lösung den Veränderungen von CM vorrausgeht. Es besteht daher kein Hinweis für eine Aktivierung oder Deaktivierung des Stroms durch Veränderungen der Membrankapazität.


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Abbildung 4.1-1: Vergleich der unterscheidlichen Reaktionen auf 28% HTS mit und ohne Veränderung der Membrankapazität am Beispiel zweier Zellen. Jeder Datenpunkt repräsentiert den Mittelwert von 10 folgenden Punkten.


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4.4.2. Der volumenaktivierte Strom korreliert mit den Veränderungen des Zellvolumens

Als Maß für das Zellvolumens wurden die Veränderungen der Zellhöhe gemessen, die durch Lösungen mit einer um 10, 28 und 50% reduzierten Osmolarität induziert worden waren. Die Zellhöhe in isotoner Lösung entspricht einem Wert von 100%.

Abbildung 4.4.2: Änderungen in Zellvolumen, Membrankapazität und volumen-aktiviertem Strom an CPAE unter Applikation von 10%, 28% und 50 % HTS.

In parallel dazu durchgeführten Experimenten wurde der volumenaktivierte Strom für die selben Osmolaritäten bei einem HP von +20 mV gemessen. Dieses


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Haltepotential wurde gewählt, weil es ausreichend weit vom C- - Umkehrpotential entfernt ist um einen hohen Chloridstrom zu induzieren und gleichzeitig eine zuverlässige Ermittlung von CM zu gestatten. Bei negativeren Potentialen wird der Strom durch die Annäherung an das C- - Umkehrpotential und seine auswärtsgleichrichtende Kinetik geringer, während die hohe Membranleitfähigkeit bei positiveren Potentialen zu einem hohen Fehler bei der Ermittlung von CM führt.

Das Verhältnis zwischen den gemessenen Parametern Strom, Volumenänderung und Membrankapazität sind in der Abbildung 4.1-2 dargestellt. Es besteht eine hohe Korrelation zwischen Volumenänderung und Strom (r= 0,99 ± 0,11 , Mittelwert ± Standartabweichung) . Jedoch korreliert CM weder mit den Veränderungen des Zellvolumens (r=0,64 ± 0,84) noch mit denen des Stromes (r=0,59 ± 3,83) . Während der Zellschwellung kam es also nicht zwingend zu Veränderungen der Membrankapazität. Es ist jedoch berechtigt, diesen Strom als volumenaktivierten Strom ICl, VOL zu bezeichnen.

4.4.3. Proteinstoffwechsel und volumenaktivierte Chloridströme

Es wurden die Effekte von Brefeldin A (BFA) und Cycloheximid, Modulatoren des Proteinstoffwechsels, auf volumenaktivierte Chloridströme an CPAE - Zellen untersucht.

BFA greift an zwei Stellen in den Proteinstoffwechsel ein: Erstens stoppt es den Proteintransport vom Endoplasmatischen Retikulum (ER) zum Golgi - Apparat und erhöht gleichzeitig den Rückfluß von Vesikelmaterial in die umgekehrte Richtung unter Substanzverlust des Golgi-Apperates. Eine wichtige Rolle spielt dabei die Ausbildung von Mikrotubuli zwischen 'transitional elements' genannten und funktionell zwischen ER und Golgi - System lokalisierten Zellkompartimenten. Der Prozeß ist sensitiv für Änderungen der zellulären ATP - Konzentration. Zweitens sind auch dem Golgi-Apparat nachgelagerte Prozesse im Proteinstoffwechsel, darunter vor allem Exozytoseleistungen, blockiert. Der grundlegende Mechanismus aller dieser Veränderungen ist die Inhibierung einer GDT - GTP - Austauschreaktion an einem ARF genannten Protein, wodurch die Ausformung von Vesikeln an deren Donormembran geblockt wird. Die Effekte von BFA am Golgi - System sind reversibel und beeinflussen die originäre Proteinsynthese nicht. (Lippincott-Schwartz et al., 1990; Pelham, 1991; Alberts et al., 1994 , Kap 13, S. 604, 642). Nach Inkubation einer Zelle mit BFA können zytosolisch vorliegende Proteine nicht mehr in die Zellmembran inkorporiert und neue funktionsfähige Proteine nicht mehr gebildet werden. Es wäre daher eine Verringerung des volumenaktivierten Chloridstromes bereits bei der ersten HTS - Applikation zu erwarten.

Es wurde der maximal durch 28% HTS aktivierbare Strom einer Gruppe von Zellen nach 2h Inkubation mit 6 mg/ml BFA mit dem einer Kontrollgruppe von Zellen


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ohne BFA - Inkubation verglichen. Die Kontrollgruppe wurde 2h mit der gleichen DMSO - Konzentration inkubiert, wie sie in der BFA - Gruppe verwendet wurde. Die beiden Gruppen unterschieden sich damit nur im Zusatz von BFA. Die Inkubation fand in Kulturmedium unter Kulturbedingungen, wie im Abschnitt 'Materialien und Methoden' beschrieben, statt. Nach 2h Inkubation wurden die Zellen im Meßstand installiert. Sämtliche im Meßstand verwendeten Lösungen hatten die gleichen BFA- bzw. DMSO - Konzentration wie das Kulturmedium während der Inkubation.

Der durch HTS induzierte Strom wurde aus der Differenz zwischen Maximalstrom unter HTS und dem Mittelwert des Stromes vor Applikation und nach Auswaschen von HTS errechnet. Dieser Wert wurde als Normalisierung durch die Membrankapazität dividiert. Die Messungen des Membranstroms erfolgten bei einem Haltepotential von -80 mV, um den Einfluß von Kaliumleitfähigkeiten auszuschließen (das entspricht nahezu dem errechneten Umkehrpotential für K+ von -79,6 mV).

Abbildung 4.4.3: Durch 28% HTS aktivierter Strom unter BFA und Cycloheximid. Die Messung des Stromes erfolgte bei einem Haltepotential von -80mV, danach erfolgte als Normalisierung eine Division durch die Membrankapazität.


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Nach Inkubation mit BFA betrug der volumenaktivierte Strom (Mittelwert ± SEM) 15.2 ± 3,95 pA/pF (n=9) und in der Kontrollgruppe 23,1 ± 3,37 pA/pF (n=7). Damit bestehen zwischen den Mittelwerten beider Gruppen kein signifikanter Unterschied (p=0,1675). Die Ergebnisse sind in Abbildung 4.4.3 dargestellt.

Auch bei wiederholter HTS - Applikation war ICl,VOL weiterhin auslösbar mit einer nur gering niedrigeren Amplitude , ohne Unterschied zu den Kontrollmessungen.

Zur Kontrolle dieses Resultats wurden in weiteren Experimenten CPAE - Zellen mit Cycloheximid inkubiert. Diese Substanz blockiert reversibel die Proteinsynthese durch Hemmung der Transkription in zytosolischen Ribosomen von Eukaryoten durch Block der Peptidbindung nach Ankopplung einer neuen Aminosäure an der tRNA (Alberts et al., 1994 , Kap 6 ,S 240).

Wie in den BFA - Experimenten wurden zwei Gruppen von Zellen gebildet, eine davon wurde mit Cycloheximid 10 mg/ml im Meßstand bei Raumtemperatur inkubiert. Zum Beginn der Applikation von HTS betrug die mittlere Inkubationszeit 55 min (minimal 20 min, maximal 85 min). Die Messung des Stromes erfolgte bei einem HP von -80 mV, die Errechnung des durch HTS aktivierten Stromes erfolgte wie in den eben beschriebenen Experimenten mit BFA.

Der normalisierte HTS - induzierte Strom betrug (Mittelwert ± SEM) 23,6 ± 2.25 pA/pF in der Cycloheximid - Gruppe und 40,1 +/- 4.08 pA/pF in den Kontrollmessungen. Im unpaaren T-Test ergibt sich eine signifikante Differenz zwischen den Mittelwerten (p=0,00268). Dabei sind jedoch die nicht normalisierten Ströme fast gleich (1601 ± 297,0 pA bzw. 1657 ± 306,9 pA) , erst bei Normalisierung wird die Signifikanzschwelle erreicht. Der Effekt entsteht also durch die unterschiedlichen Zellgrößen: die durchschnittliche Membrankapazität der Zellen in der Cycloheximid - Gruppe ist wesentlich größer als die der Zellen in der Kontrollgruppe (71.7 pF im Vergleich zu 39.6 pF). Die Zeit zwischen Aussäen der Zellen in die Kulturschalen und Durchführung des Experimentes ist zwischen den beiden Gruppen mit 4,1 Tagen (Cycloheximid) bzw. 3,3 Tagen (Kontrolle) nur geringfügig und nicht signifikant unterschiedlich.


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