Heinke, Stephan : "Zur Modulation volumenaktivierter Chloridströme in Endothelzellen"

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Kapitel 5. Diskussion

5.1. Physiologische Bedeutung von Osmolaritätsänderungen für Endothelzellen

Außer Tubuluszellen der Niere sind alle Zellen von Vertebraten in vivo von einem Milieu stabiler Osmolarität (290 mOsm) umgeben. Jedoch müssen vor allem wachsende und proliferierende Zellen oder solche mit sekretorischen Leistungen sich mit Osmolaritätsänderungen auseinandersetzen. Veränderte Konzentrationen von Makromolekülen und Aminosäuren sowie längerfristige Änderungen des MP verursachen Veränderungen der intrazellulären Osmolarität. Weiterhin können lokale Anisotonizitäten extrazellulär nicht ausgeschlossen werden, so z.B. bei mechanischer Verletzung eines Gefäßes. Die möglichen physiologischen Funktionen volumenaktivierter Chloridströme wurden in der Einleitung dieser Arbeit ausführlich dargestellt. Osmolaritätsveränderungen sind daher für Endothelzellen physiologisch bedeutsam. Wahrscheinlich geht die Bedeutung volumenaktivierter Chloridströme aber über den Rahmen der Osmolaritätsveränderungen hinaus, z.B. bei Scherstreß und anderen Aktivierungen von Endothelzellen unter isotonischen Bedingungen.

5.2. Die Rolle des intrazellulären Kalziums bei der Modulation volumenaktivierter Chloridströme

Aus den Ergebnissen von Nilius et al. (1992) und Nilius, Oike, Zahradnik und Droogmans (1994) wurde bisher geschlossen, daß volumenaktivierte Chloridströme kalziumunabhängig aktiviert werden. Diese Aussage galt für ein [Ca2+i von 50 nM und höher (eine ausführliche Darstellung dessen erfolgte bereits in der Einleitung). Die in dieser Arbeit dargestellten Experimente zeigen, daß intrazelluläres Kalzium zur Aktivierung volumenaktivierter Chloridkanäle notwendig ist. Die Mindestkonzentration ist niedriger als 50 nM. Bei höherem [Ca2+i verliert der Strom jedoch seine Sensitivität für intrazelluläres Kalzium. Eine Schwellenkonzentration von [Ca2+i ist also zur Aktivierung des Chloridstromes durch HTS nötig, er wird jedoch nicht durch Kalzium moduliert.

Diese Ergebnisse würden vordergründig eine Beteiligung von Calmodulin am Signalweg zur Aktivierung von ICl,Vol nahe legen; das ist jedoch sehr wahrscheinlich nicht der Fall. Zwar konnte mit den Calmodulin-Antagonisten Tamoxifen und Trifluorparazin (TFP) ICl,VOL blockiert werden, jedoch bildete sich dieser Effekt schnell und vollständig nach dem Auswaschen zurück. Dies spricht gegen einen Effekt via Calmodulin. Weiterhin blieb nach Inkubation mit KN-62, einem Inhibitor der Calmodulin-abhängigen Proteinkinase II, die Aktivierung von ICl,Vol unbeeinflusst


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(Szücs et al., 1995). Zudem liegen Konzentrationen von unter 50 nM noch unter der Affinität von Calmodulin.

Das Protokoll zur Ladung des BAPTA via Pipette wurde in ähnlicher Form mit EGTA wiederholt. Diese Experimente führten zu genau der gleichen Aussage wie jene mit BAPTA. Gleichzeitig konnte wiederum gezeigt werden, daß eine wesentliche Erhöhung des [Ca2+i über 50 nM hinaus keine Erhöhung von ICl,Vol bewirkt. Unspezifische Wirkungen des BAPTA in der Zelle als Ursache des beobachteten Effektes können daher ausgeschlossen werden.

5.3. Einfluß von Chromoglycinsäure auf volumenaktivierte Chloridströme in Endothelzellen

In Mastzellen wurde nach intrazellulär applizierter Chromoglycinsäure (CL) eine Blockierung von Chloridkanälen in der selben Konzentration beobachtet, mit der CL auch die Serotonin - Sekretion hemmt (Reinspecht et al., 1992). Der Chloridkanal - Blocker NPPB zeigte ebenfalls einen blockierenden Effekt auf Chloridkanäle und Mediatorsekretion. NPPB blockiert jedoch auch eine Reihe anderer Leitfähigkeiten.

In den in Kapitel 4.2 dargestellten Experimenten wurde der Effekt extrazellulär applizierten CL's auf ein anderes Chloridkanal - Modell, den volumenaktivierten Chloridstrom in Endothelzellen, untersucht. Auch hier konnte ein blockierender Effekt des CL auf die Chloridleitfähigkeit beobachtet werden.

Der beobachtete Effekt war, verglichen mit dem anderer Blocker dieser Leitfähigkeit wie NPPB, sehr langsam. Bis zur vollständigen Ausbildung des Effektes vergingen etwa 100s. Ein halbmaximaler Block resultierte bei einer Konzentration Ki = 15 mM. Diese liegt wesentlich höher als für die von Reinspecht et al. (1992) dargestellten intrazellulären Effekte an Mastzellen.

Chromoglycinsäure gilt als membranimpermeabel. Es kann daher ausgeschlossen werden, daß eine Permeation des CL nach extrazellulärer Applikation die Ursache für diese Diskrepanz sein kann. Eine indirekte Wirkung über eine Botensubstanz ist wahrscheinlicher.

5.4. Modulation volumenaktivierter Chloridströme durch Phosphorylierung

Der Signalweg zwischen extrazellulärer Applikation von hypotoner Lösung und Aktivierung des Chloridstromes ist noch weitgehend unklar. Folgende Indizien lassen einen intrazellulären Regulationsmechanismus vermuten:


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So ist zur Aktivierung und zur Verhinderung des 'run - down' von ICl,VOL intrazelluläres ATP notwendig (Nilius, Oike, Zahradnik und Droogmans, 1994). Weiterhin existieren Beispiele über die Induktion von Tyrosinphophorylierungen durch hypotone Lösung (Tilly et al., 1993). Es ist ebenfalls bekannt, daß eine

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Aktivierung der Proteinkinase C (PKC) volumenaktivierte Chloridströme modulieren kann (Hardy et al., 1995; Robson und Hunter,1994).

Im Kapitel 4.3 dieser Arbeit wurde der modulierende Effekt von Phosphorylierungsreaktionen und Aktivierung der PKC auf volumenaktivierte Chloridströme in CPAE - Zellen untersucht. In den vorgestellten Experimenten modulierte weder die Aktivierung der PKC durch PMA noch deren Ab - Regulierung mit der gleichen Substanz den volumenaktivierten Chloridstrom. Das entspricht den Resultaten anderer Untersucher, die in nicht transvektierten Zellen keine Veränderung von ICl, VOL nach Modulation der PKC beobachten konnten (Hardy at al., 1995). Nach Überexpression des P - Glykoproteins durch transiente Transfektion mit der korrespondierenden cDNA konnte aber eine solche Modulation beobachtet werden. Allerdings existierte kein Zusammenhang zwischen Expression des P - Glycoproteins und ICl, VOL in Endothelzellen (De Greef et al., 1995). Im Kontrast dazu stehen Ergebnisse an Zellen des proximalen Tubulus von Rana temporaria, in denen ICl,VOL durch die PKC modulierbar war (Robson und Hunter, 1994).

Auch die Experimente mit Modulation des Tyrosinkinase - assoziierten Rezeptor - Signalweges mit Wortmannin zeigten keinerlei Einfluß auf ICl,VOL in CPAE. Die Hypothese über die Einbeziehung der MAP - Kinasen in die Modulation von ICl,VOL konnte somit nicht bestätigt werden. Dieses Ergebnis wiederspricht scheinbar den Resultaten von Tilly et al. (1993). Dort wurde in der Zellinie 'human intestinal 407' die Triggerung der Tyrosinkinase - Aktivität durch einen hypotonen Schock beschrieben. In deren Folge kam es zu einer Aktivierung der MAP - Kinasen - Phosphorylierungskaskade. Letztlich wurde der Umkehrschluß (Hemmung der MAP - Kinasen bewirkt eine Verringerung von ICl,VOL) jedoch auch durch diese Autoren nicht experimentell belegt.

Die Ursache könnte darin liegen, daß durch HTS eine Aktivierung der MAP - Kinasen und des Chloridstromes erfolgt, beide Vorgänge aber unabhängig voneinander induziert werden.

Eine attraktive Hypothese zum Aktivierungsmechanismus von ICl,VOL ist eine Funktion von Integrinen als Mechanosensoren, z.B. für eine zunehmende Spannung in der Zellmembran unter Zellschwellung. Integrine sind eine Klasse transmembranärer Proteine, die Moleküle der extrazellulären Matrix am intrazellulären Zytoskelett verankern. Dort binden sie an Talin und a-Aktin. Ihre Funktion ist nicht nur mechanischer Natur, sie dienen auch als Mediatorelemente für Interaktionen zwischen extrazellulärer Matrix und Zytoskelett und sind an der Ausbildung der Zellform und Zellorientierung beteiligt.

Eine Aktivierung von Integrinen via Matrix führt zu Phosphorylierungsreaktionen an Tyrosinkinasen ähnlich der Funktionsweise von Wachstumsfaktor - Rezeptoren (Alberts et al., 1994, Kap.19, S. 995-999). Die Kenntnisse darüber sind noch gering. So erfolgt als frühzeitiger Schritt eine Aktivierung von p125FAK durch Tyrosin - Autophosphorylierung (Richardson und Parson, 1995). Es gibt Indizien dafür, daß nach Zelladhaesion eine PI-3-Kinase an das aktivierte p125FAK bindet. Wortmannin blockiert irreversibel die PI-3-Kinase. LPA führt zu einer gesteigerten Tyrosin - Phosphorylierung an Isoformen der MAP - Kinasen, aber auch an der fokalen Adhaesionskinase p125FAK unabhängig von der PKC und von intrazellulärem Kalzium (McLees et al., 1995). Der fehlende Einfluß von Wortmannin und LPA auf die Modulation von ICl,VOL ergibt aber keinen Hinweis auf eine Einbeziehung von Integrinen in den Mechanismus zur Aktivierung von ICl,VOL.

Der direkte Effekt der verwendeten Substanzen wurde im Rahmen der vorgestellten Experimente nicht untersucht. Eine solche Testung und anschließende Messung via 'patch clamp' wäre jedoch auch nicht möglich gewesen. Es existieren jeweils eine Anzahl von Veröffentlichungen über die Wirksamkeit der verwendeten Substanzen. LPA aktiviert die p42 - Isoform der MAP-Kinase in Endothelzellen, diese Aktivierung war deutlich reduzierbar durch die Applikation von PMA (McLees et al., 1995). Zudem beeinflusste ein PKC-Inhibitor-Peptit (PKC19-31-Inhibitor) den volumenaktivierten Chloridstrom in CPAE nicht (Daten nicht gezeigt). Wortmannin blockiert die Aktivierung von MAP-Kinasen in Skelettmuskelzellen (Cross et al., 1994). Eine prinzipielle Unwirksamkeit der verwendeten Substanzen in CPAE ist daher sehr unwahrscheinlich (C. de Greef, L. Raymakers; persönliche Mitteilung).

Insgesamt sind Effekte durch Modulation von Tyrosinkinasen experimentell nicht immer sicher auszulösen. So schließen negative Untersuchungsergebnisse ein Vorliegen entsprechender Signalwege nicht völlig aus (Alberts et al., 1994, Kap. 15, S. 733, 770; Nilius und Voets, persönliche Mitteilung).

Ein weiterer Gegenstand der Untersuchungen war der Einfluß neu entdeckter Phosphorylierungsreaktionen im Zusammenhang mit der Induktion von Hitzeschockproteinen (HSP). Dabei wird die Transkription von einer Subklasse von MAP - Kinasen induziert, die sich von den klassischen MAP - Kinasen unterscheiden (Rouse et al., 1994) . Einer der bestuntersuchtesten Vertreter der entsprechenden Proteinkinasen ist HOG1. Dieses Protein ist z.B. für die Adaptierung von Saccharomyces cerevisiae an osmotischen Streß notwendig (Brewster, 1993).

Weder unter chemischem Streß durch 0,3 mM Natriumarsenit noch unter Hitzeeinwirkung von bis zu 45 0C über 60 min konnte eine Veränderung des volumenaktivierten Chloridstromes beobachtet werden. Auch wurde kein Chloridstrom primär durch diese Vorgehensweise induziert.

Die Bildung von HSP auf osmotischen Stress hin wurde bisher noch nicht untersucht. Die Induktion von Hitzeschockproteinen hat somit keinen Einfluss auf die Aktivierung von ICl,VOL. Volumenaktivierte Chloridströme scheinen nicht in die Reaktion auf o.g. Stressoren eingebunden zu sein. Unter osmotischem Stress ist eine Bildung


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von HSP unabhängig von der Aktivierung von ICl,VOL aber denkbar. Dazu können die hier beschriebenen Experimente jedoch keine Aussage liefern.

Ein direkter Nachweis über die Bildung der HSP in CPAE konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht geführt werden. Die Bildung von HSP durch Hitzeinwirkung wurde bei einer großen Reihe von Zelltypen nachgewiesen. In den verwendeten Konzentrationen / Temperaturen werden in Pulmonalarterien - Endothelzellen des Schaafes und in anderen Zelltypen sicher HSP induziert (Wong et al., 1996; Yiu et al, 1993). Die Vorgehensweisen zu ihrer Induktion entsprachen jenen dieser Autoren und Levinson et al. (1980).

Die Hitzeeinwirkung wurde über einen weiten Bereich abgestuft erhöht bis auf Temperaturen und Inkubationsdauern, die die Zellen nahezu sichtbar schädigten. Eine Unwirksamkeit des Vorgehens hinsichtlich Bildung von HSP erscheint daher sehr unwahrscheinlich.

Als Ergebnis dieser Untersuchungen bleibt zu formulieren, daß kein Hinweis für eine Beteiligung der untersuchten Phosphorylierungsreaktionen und Signalwege an der Modulierung volumenaktivierter Chloridströme in CPAE ergab.

5.5. Zusammenhang zwischen Zellschwellung und Membranstromaktivierung

5.5.1. Modellvorstellungen

Unter der Applikation von HTS kommt es zu einer Veränderung des Zellvolumens. Da die Zellmembran nicht permeabel für einen Großteil der osmotisch aktiven Substanzen im Zellinneren ist, kann sich der Konzentrationsgradient an diesen Stoffen unter externem hypoosmolarem Milieu nicht ausgleichen. Wasser strömt in die Zelle, deren Volumen erhöht sich. Wie verändert sich dabei die Membran und auf welchem Wege sind Strom und zelluläre Volumenveränderung miteinander verknüpft? Dazu existieren 3 Modellvorstellungen:

1) Das 'Entfaltungsmodell' geht davon aus, daß die Membran keine straff gespannte Umhüllung der Zelle darstellt, sondern 'gefaltet' ist und nicht unter mechanischer Spannung steht. Nach diesem Modell wäre eine Erhöhung des zellulären Volumens bis zu einem bestimmtem Grade durch Entfaltung der Zellmembran möglich.

Als auslösendes Signal für die Aktivierung von Strömen kommt in diesem Modell eine mechanische Dehnung der Membran nicht in Frage. Als Trigger dafür wäre jedoch die Verdünnung von Enzymen, Substraten und Signalstoffen in der Zelle oder die direkte Vermittlung durch Osmosensoren möglich.

2) Im 'Stretchmodell' wird die Membran mechanisch gedehnt und erlaubt nur unter massiver Druckerhöhung eine Volumenzunahme der Zelle. In Zusammenhang mit dieser Modellvorstellung können die in der Membran auftretenden Kräfte als


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Signal zur Stromaktivierung diskutiert werden. Da schon bei geringen Osmolaritätsänderungen Stromaktivierungen auftreten, müßte bei den zum Teil sehr großen Volumenänderungen ein sehr hoher Druck wirken. Jedoch zeigten eine große Zahl von Experimenten keinerlei Beeinträchtigung der Membranintegrität (stabil niedriges [Ca2+]i , stabiler 'seal').

3) Das 'Vesikelmodell' geht von der Vorstellung aus, daß unter dem hypotonen Stimulus Chloridkanal - Proteine (eventuell in Vesikeln eingehüllt) via Exozytose in die Membran eingebaut und so die Proteine in die Membran inkorporiert werden.

Ein Indiz für diese Vorstellung sind die Ergebnisse mit Überexpressions - Experimenten von ICl,N (Paulmichl et al., 1992). Dieses Molekül liegt zu 70% zytosolisch vor und steht in ursächlichem Zusammenhang mit der Aktivierung von Strömen sehr ähnlicher Charakteristik wie die volumenaktivierter Chloridströme (Paulmichl et al., 1993; Krapivinsky et al., 1993). Diese Thematik wurde in der Einleitung ausführlicher dargestellt.

Messungen von Einzelkanal - Strömen und Rauschanalysen von Membranströmen an C6 - Gliom - Zellen ließen ein Modell für die Natur des Kanalproteins ähnlich dem einer Ionophore vorschlagen. Grund dazu war die Beobachtung, daß bei Aktivierung des volumenaktivierten Stromes nicht die Öffnungswahrscheinlichkeit der in der Membran vorhandenen Kanäle steigt. Statt dessen wird davon ausgegangen, daß die Kanäle nur in den Zuständen 'ständig offen' und 'ständig geschlossen' vorliegen. Eine Stromaktivierung käme dann durch Zunahme von Kanälen im Zustand 'ständig offen' in der Membran zu Stande. Die Inkorporation eines überwiegend zytosolisch lokalisierten Kanalproteins in die Membran bei Aktivierung des Stromes wäre eine attraktive Hypothese dazu (Hoffmann und Dunham, 1995).

5.5.2. Veränderungen der Membrankapazität unter hypotoner Lösung

Es wurden im Kapitel 4.4 dieser Arbeit Änderungen der Membrankapazität (CM) als Ausdruck der zellulären Volumenerhöhung unter HTS registriert. Die Stromaktivierung und -deaktivierung wurde durch laufende Messung bei einem HP = +20 mV verfolgt und parallel zur Membrankapazität registriert.

Unter 10 % HTS zeigte keine Zelle Veränderungen von CM über das dem Meßsystem eigene Rauschen hinaus. Allerdings wurde auch kein bis ein nur sehr geringer Strom aktiviert.

Unter 28 und 50% HTS konnten die Zellen hinsichtlich der beobachteten Veränderungen von CM in zwei Gruppen eingeteilt werden. In einigen Fällen wurde eine Zunahme von CM registriert, in anderen erfolgte trotz deutlicher Stromaktivierung keine Änderung von CM. War jedoch eine Erhöhung der Membrankapazität sichtbar, so erfolgte erst die Strom- und folgend die Kapazitätsänderung.


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Die Meßwerte zu Veränderungen der Zellhöhe als Maß für die Veränderung des Zellvolumens zeigen dagegen in allen Zellen schon bei 10 % HTS Vergrößerungen, bei 28% HTS um fast ein Drittel der Ausgangshöhe.

Es besteht somit eine enge Korrelation zwischen Veränderungen des Zellvolumens und des Stromes. Aber weder die Veränderungen des Zellvolumens noch der volumenaktivierte Chloridstrom korrelieren mit der Veränderung der Membrankapazität. Die Inkorporation von Vesikeln oder von Kanalproteinen während der Volumenänderung unter HTS ist daher unwahrscheinlich. Diese Resultate an Endothelzellen entsprechen jenen an Jurkat - T - Lymphozyten (Ross et al., 1994) und an Hepatozyten der Ratte (Graf et al., 1995).

Die Kanaldichte liegt bei einer Einzelkanalleitfähigkeit von 1-2 pS bei 10-60 Kanälen µm- 2. Bei einer Zelloberfläche von etwa 5000 µm2 entspräche das 50.000 bis 300.000 inkorporierten Kanälen pro Zelle (Nilius et al., 1996). Legt man z.B. die Größe präsynaptisch gebildeter sekretorischer Vesikel für Azetylcholin von d=50 nm zu Grunde (27, Kap. 13, S.631), müßte sich die Zelloberfläche um bis 393 - 2358 µm2 vergrößern. Das entspricht einer Oberflächen- und damit Kapazitätszunahme von 0,8 - 4,7%. Die bei einigen Zellen beobachtete Zunahme der Membrankapazität liegt damit im theoretisch möglichen Bereich. Das verwendete Meßsystem ist empfindlich genug, um die rechnerisch mögliche Kapazitätszunahme zu detektieren.

Die Zunahme von CM bei einigen Experimenten zeigt, daß die Veränderung von CM nicht der primäre Trigger für die Aktivierung von ICl,VOL ist. Denn zuerst wurde der Strom aktiviert und folgend kam es zu einer Zunahme von CM. Es kann jedoch allein durch diese Resultate nicht ausgeschlossen werden, daß nach einer Aktivierung von bereits in der Membran vorhandenen Kanälen eine zusätzliche Inkorporation von Kanalproteinen erfolgt.

5.5.3. Einfluß der Proteinsynthese auf volumenaktivierte Chloridströme

Zur Untersuchung dessen wurden die Zellen mit Brefeldin A (BFA) inkubiert und der volumenaktivierte Strom mit dem einer Kontrollgruppe verglichen. Die Mittelwerte des durch HTS induzierten Stromes von der BFA - Gruppe und der Kontrollgruppe waren nicht signifikant unterschiedlich.

Weitere Experimente unter Beeinflussung der Proteinsynthese wurde mit Cycloheximid durchgeführt. Dieser Stoff blockiert reversibel die Proteinsynthese durch Hemmung der Transkription in zytosolisch lokalisierten Ribosomen von Eukaryoten durch Block der Peptidbindung nach Ankopplung einer neuen Aminosäure an der tRNA (Alberts et al., 1994 , Kap 6, S 240).

Nach Inkubation mit 10 mg/ml Cycloheximid war der HTS-induzierte Chloridstrom signifikant verringert im Vergleich zu den Kontrollmessungen. Dies trifft jedoch nur auf die normalisierten Meßwerte, das heißt nach Division der Meßwerte durch die


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Membrankapazität zu. Die nicht normalisierten Ströme sind nahezu gleich (Durchschnitt ± SEM : 1601 ± 297,0 pA bzw. 1657 ± 306,9). Die Signifikanzschwelle wird erst bei Normalisierung erreicht. Die durchschnittliche Membrankapazität der Zellen, die mit Cycloheximid inkubiert wurden, war nahezu doppelt so groß als die der Kontrollmessungen. Der Effekt kommt also nur durch unterschiedliche Membrankapazitäten zustande.

Zwar wurde von einigen Autoren unter Cycloheximid eine Zunahme der Zellgröße bechrieben, jedoch trat dieser Effekt erst nach Tagen auf. Als Ursache dafür werden ein Einfluß auf die Apoptosis durch verminderte Synthese von Regulatorproteinen genannt (Fabio et al,, 1994). Bei der vergleichsweisen kurzen Inkubationszeit mit Cycloheximid in meinen Experimenten ist die unterschiedliche Zellgröße damit jedoch nicht erklärbar.

Die durchschnittliche Zeit, zu der die Zellen nach dem Aussäen gemessen wurden, ist mit 4.1 (Cycloheximid) bzw. 3.3 Tagen (Kontrolle) nur geringfügig und nicht signifikant unterschiedlich. Als Erklärung bleibt lediglich eine subjektive unterschiedliche Auswahl der Zellen im Experiment.

Zusammengefasst reduziert rein statistisch betrachtet Cycloheximid den volumenaktivierten Chloridstrom in CPAE. Brefeldin A hat keinen signifikanten Effekt auf ICl,Vol .

Solche einschneidenden Eingriffe in den Proteinstoffwechsel und die Fusion von Membranvesikeln würden bei Annahme des Inkorporierungsmodells nicht nur schwach signifikante, sondern dramatische Veränderungen von ICl,VOL erwarten lassen. Diese blieben jedoch aus. Eindeutigere Ergebnisse würden Experimente erwarten lassen, in denen an einer Zelle Kontrollmessungen und Messungen unter Applikation von BFA erfolgen. Ein solches Vorgehen dauert jedoch wesentlich länger, als eine Zelle ohne Beeinträchtigung der Membranintegrität toleriert. Lediglich eine Tonizitätsänderung vor dem Start der Experimente in Verbindung mit einem sehr langsamen Abbau der Kanalmoleküle ließe die vorgestellten Ergebnisse dann noch erwarten. Doch waren die Zellen keinerlei hypoosmolarer Lösung vor den Experimenten ausgesetzt. Die Aktivierung wie die in den meisten Fällen fast exakt auf das Ausgangsniveau mündende Deaktivierung des Membranstromes erfolgten darüber hinaus im Zeitraum weniger Minuten, entsprechend schnell müßten Inkorporation und Inaktivierung vor sich gehen.

Bei wiederholter Applikation von HTS war bis auf eine geringe Verminderung von Applikation zu Applikation keine Veränderung der Stromantwort sichtbar. Diese unterschied sich nicht im Vergleich zu Messungen unter Kontrollbedingungen. Wenn ein Teil der Kanalproteine bereits vor Applikation hypotoner Lösung inkorporiert wäre, so müßte unter BFA oder Cycloheximid zumindest bei repetitiver HTS - Applikation eine deutliche Abnahme von ICl,VOL zu beobachten sein. Das war keineswegs der Fall.


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Eine unspezifische Schädigung der Zellen unter Cycloheximid ist daher wesentlich wahrscheinlicher die Ursache des beobachteten Effektes. Die Konzentrations-abnahme eines hypothetischen Regulatorproteins kann als Ursache der Verminderung von ICl,Vol unter Cycloheximid allerdings nicht ausgeschlossen werden.

5.5.4. Zuordnung der Ergebnisse zu den Modellvorstellungen

Zur Diskussion der 3 Modelle zum Zusammenhang zwischen Zellschwellung und Stromaktivierung - Stretch, Auffaltung und Vesikelinkorporation - ist daher folgendes zu bemerken:

Die Zellen schwellen unter HTS in hohem Maße an. Die Aktivierung der Chloridleitfähigkeit und eine Änderung von CM sind nicht aneinander geknüpft. Eine Reihe von Zellen können Anschwellen und gleichzeitig eine Chloridleitfähigkeit aktivieren, ohne Veränderungen von CM zu zeigen. Eine Inkubation mit Cycloheximid oder Brefeldin A führt nicht zu erwarteten Veränderungen des volumenaktivierten Chloridstromes. Daher ist das Modell 3 unwahrscheinlich. Diese Ergebnisse entsprechen denen einer soeben erschienen Arbeit, in der an Hepatozyten eine Aktivierung HTS - induzierter Kalium- und Chloridleitfähigkeiten ohne Änderungen der Membrankapazität gezeigt werden konnte (Graf at al., 1995). Auch diese Autoren lehnen das Inkorporationsmodell ab. Da im Zeitverlauf der Aktivierung und Deaktivierung nach Inkubation mit BFA und Cycloheximid keine Veränderungen im Vergleich zu den Kontrollexperimenten bestand, ist auch eine zusätzliche Inkorporation von Kanalproteinen nach der Aktivierung von bereits in der Membran vorhandenen Kanälen unwahrscheinlich.

Da in einer Reihe von Zellen unter deutlicher Stromaktivierung keine Zunahme der Membrankapazität beobachtet werden konnte, erscheint das 'Auffaltungsmodell' am Mechanismus für die Zellschwellung unter HTS beteiligt zu sein.

In Experimenten zur Rolle des Zytoskeletts bei der Aktivierung von ICl,Vol konnten in Endothelzellen keine Effekte nach Alterierung von intrazellulären Filamenten auf ICl,Vol beobachtet werden (Oike et al., 1994). Auch die Phosphorylierung der fokalen Adhaesionskinase p125FAK durch LPA und die Inhibierung der in der Signalkette folgenden PI-3-Kinase durch Wortmannin im Rahmen zeigten, wie in dieser Arbeit dargestellt, keinen Einfluß auf ICl,VOL. In einer Reihe von anderen Zellen konnte jedoch ICl,VOL nach Manipulationen am Zytoskelett moduliert werden (Schwiebert et al., 1994; Hug et al., 1995). Diese Thematik wurde bereits in der Einleitung ausführlich dargestellt. Insgesamt scheint dem Zytoskelett keine zentrale Rolle bei der Aktivierung von ICl,VOL zuzukommen. Das 'Strechmodell' ist damit sicher nicht der zentrale Triggermechanismus.

Die Tatsache, daß volumenaktivierte Ströme auch durch positiven Druck auf die Pipette ausgelöst werden können und die doch ebenfalls vorhandenen


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Beobachtungen von Kapazitätserhöhungen unter HTS in einigen Zellen lassen den Schluß zu, daß es sich insgesamt um eine Kombination aus Auffaltung und, wenn auch mit geringerem Gewicht, Stretch handelt.
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