Heinke, Stephan : "Zur Modulation volumenaktivierter Chloridströme in Endothelzellen"

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Kapitel 6. Zusammenfassung

In dieser Arbeit wurde die Modulation volumenaktivierte Chloridströme ICl,VOL und der Signalweg zu ihrer Aktivierung untersucht. Dazu wurden in Endothelzellen aus der Pulmonalarterie des Rindes (CPAE) die Membranströme unter Anwendung der 'patch clamp' - Technik und simultan dazu die Konzentration des freien intrazellulären Kalziums [Ca2+i gemessen.

1. Bisher wurde davon ausgegangen, daß die Aktivierung von ICl,VOL kalziumunabhängig erfolgt. In dieser Arbeit wurde ICl,VOL unter Pufferung des [Ca2+i mit BAPTA und EGTA gemessen. Es konnte gezeigt werden, daß freies intrazelluläres Kalzium in Konzentrationen niedriger als 50 nM zur Stromaktivierung notwendig ist. Bei einer höheren Konzentration verliert der Strom jedoch seine Kalziumabhängigkeit.

Für die Aktivierung von ICl,VOL ist also eine permissive Konzentration intrazellulären Kalziums notwendig, der Strom wird jedoch nicht durch [Ca2+i moduliert. Eine Rolle von Calmodulin bei der Aktivierung des Stroms ist sehr unwahrscheinlich, da ein [Ca2+i von kleiner als 50 nM dafür zu gering ist.

2. Es wurde der Effekt von Chromoglycinsäure (CL) auf ICl,VOL untersucht. CL blockiert ICl,VOL in Endothelzellen. Dieser Effekt ist jedoch im Vergleich zu dem klassischen Chloridkanalblocker NPPB geringer (Ki=15mM) und sehr langsam (im Mittel 100 s). Damit sind die blockierenden Eigenschaften auch geringer ausgeprägt als z.B. auf ICl,Vol und Hemmung der Serotoninsekretion in Mastzellen.

3. Weiterhin war die Rolle von durch Proteinphosphorylierung modulierten intrazellulären Signalwegen bei der Aktivierung von ICl,VOL Gegenstand von Experimenten. Dazu wurde der Einfluß verschiedener in solche Reaktionen eingreifenden Substanzen untersucht.

Weder die Aktivierung der Proteinkinase C (PKC) durch direkte Applikation des Phorbolesters PMA noch deren Ab - Regulation durch 24-stündige Inkubation mit PMA hatten Einfluß auf die Aktivierung von ICl,VOL . Auch Wortmannin, ein Inhibitor sowohl der MAP - Kinasen (und damit des Tyrosinkinase - assoziierten Rezeptor - Signalweges) als auch der PI3 - Kinase, zeigte keinen Effekt auf ICl,VOL. Der Aktivator der MAP - Kinasen und der fokalen Adhaesionskinase p125FAK , die Substanz Lysophosphatsäure (LPA), zeigte weder einen Effekt auf ICl,Vol, noch konnte damit ein Chloridstrom induziert werden.

Es wurde auch der Einfluß von Hitzeschockproteinen (HSP) auf ICl,VOL untersucht. Die Induktion von HSP wird über eine neu entdeckte Subklasse von MAP - Kinasen signalvermittelt, deren bestuntersuchtester Vertreter HOG1 in saccharomyces cerevisiae für die Adaptierung an osmotischen Streß notwendig ist. Die Applizierung von thermischem und chemischem Streß durch Inkubation bei bis zu 45 °C über 60 min und Einwirkung von 0,3 mM Natriumarsenit zeigte


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keinerlei Einfluß auf ICl,Vol. Es konnte auch keine Aktivierung eines Chloridstromes beobachtet werden.

Insgesamt ergab sich für keinen der untersuchten durch Proteinphosphorylierung gesteuerten Signalwege ein modulatorischer Einfluß auf ICl,VOL .

4. Zur Untersuchung des Aktivierungsmechanismus von ICl,VOL dienten Experimente unter gleichzeitiger Messung von volumenaktiviertem Strom und Änderung der Membrankapazität (CM). Zusätzlich (jedoch zeitlich unabhängig voneinander) erfolgten Messungen der Zellhöhe. Die Ergebnisse wurden an Hand dreier Modellvorstellungen zur Aktivierung von ICl,VOL diskutiert.

Es konnte gezeigt werden, daß eine enge Korrelation zwischen Veränderungen der Zellhöhe und des aktivierten Stromes besteht. Beide korrelieren jedoch nicht mit den Änderungen von CM. Dabei zeigten sich zwei Reaktionstypen. Bei einem Teil der Zellen änderte sich CM praktisch nicht, d.h. geringer als 2% des Ausgangswertes vor Applikation hypotoner Lösung (n=17), bei den verbliebenen Teil zeigten sich deutliche Veränderungen von durchschnittlich 10,6 ± 0,9 % ( ± SEM, n=5). In letzterem Fall änderte sich jedoch immer zuerst ICl,Vol, und dann CM. Nach Inhibierung des intrazellulären Vesikeltransports durch Brefeldin A war ICl,Vol weiterhin und ohne signifikante Änderungen auslösbar. Unter Cycloheximid, einem Blocker der Proteinsynthese auf Transkribtionssebene, wurden keine spezifischen Veränderungen von ICl,VOL beobachtet.

Bei Applikation von hypotoner Lösung erhöht sich also das Zellvolumen, nicht immer aber auch die Membrankapazität. Auf jeden Fall ist CM nicht der primäre Trigger für ICl,VOL . Die Aktivierung von volumeninduzierten Chloridströmen erfolgt nicht maßgeblich durch die Inkorporierung von Ionenkanal - Proteinen enthaltenden Membranvesikeln.


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