Heinke, Stephan : "Zur Modulation volumenaktivierter Chloridströme in Endothelzellen"

Aus dem Institut für Physiologie

Abteilung Neurophysiologie

der Medizinischen Fakultät Charité der Humboldt-Universität zu Berlin

Direktor: Prof. Dr. U.Heinemann


Dissertation
"Zur Modulation volumenaktivierter Chloridströme in Endothelzellen"

Zur Erlangung des akademischen Grades doctor medicinae (Dr.med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité der Humboldt-Universität zu Berlin

von Stephan Heinke ,
geb. am 20.8.1966 in Friedrichroda

Dekan: Prof. Dr. med. M.Dietel

Gutachter:
Prof. Dr. U.Heinemann
Prof. Dr. B.Nilius
PD Dr.med. H.Kühnert

eingereicht: Februar 1998

Datum der Promotion: 18.8.1998

Schlagwörter:
Chlorid-Kanäle, Endothel, patch clamp, intrazelluläres Kalzium

Keywords:
chlorid currents, endothelium, patch clamp, intracellular calcium

Zusammenfassung

Volumeninduzierte Chloridströme wurden bereits in einer Reihe von Zelltypen charakterisiert. In dieser Arbeit wurde die Modulation volumenaktivierte Chloridströme ICl,Vol und der Signalweg zu ihrer Aktivierung untersucht. In Endothelzellen aus der Pulmonalarterie des Rindes (CPAE) wurden der Membranstrom unter Anwendung der 'patch clamp' - Technik und simultan dazu die Konzentration des freien intrazellulären Kalziums [Ca2+]i gemessen.

  1. Bisher wurde davon ausgegangen, daß die Aktivierung von ICl,Vol kalziumunabhängig erfolgt. In dieser Arbeit wurde ICl,Vol unter Pufferung des [Ca2+]i mit BAPTA und EGTA gemessen. Es konnte gezeigt werden, daß freies intrazelluläres Kalzium in Konzentrationen niedriger als 50 nM zur Stromaktivierung notwendig ist. Bei einer höheren Konzentration verliert der Strom jedoch seine Kalziumabhängigkeit.
  2. Chromoglycinsäure (CL) blockiert ICl,Vol in Endothelzellen. Dieser Effekt ist jedoch im Vergleich zu dem klassischen Chloridkanalblocker NPPB geringer (Ki=15mM) und sehr langsam (im Mittel 100 s). Damit sind die blockierenden Eigenschaften auch geringer ausgeprägt als z.B. auf ICl,Vol und Hemmung der Serotoninsekretion in Mastzellen.
  3. Weiterhin war die Rolle von durch Proteinphosphorylierung modulierten intrazellulären Signalwegen bei der Aktivierung von ICl,Vol Gegenstand von Experimenten. Weder die Aktivierung der Proteinkinase C (PKC) durch direkte Applikation des Phorbolesters PMA noch deren Ab - Regulation durch 24-stündige Inkubation mit PMA hatten Einfluß auf die Aktivierung von ICl,Vol. Auch Wortmannin, ein Inhibitor sowohl der MAP - Kinasen (und damit des Tyrosinkinase - assoziierten Rezeptor - Signalweges) als auch der PI3 - Kinase, zeigte keinen Effekt auf ICl,Vol. Der Aktivator der MAP - Kinasen und der fokalen Adhaesionskinase p125FAK , die Substanz Lysophosphatsäure (LPA), zeigte weder einen Effekt auf ICl,Vol , noch konnte damit ein Chloridstrom induziert werden. Die Induktion von HSP durch Applizierung von thermischem und chemischem Streß unter Inkubation bei bis zu 45 °C über 60 min und Einwirkung von 0,3 mM Natriumarsenit zeigte keinerlei Einfluß auf ICl,Vol . Es konnte auch keine Aktivierung eines Chloridstromes beobachtet werden.
  4. Zur Untersuchung des Aktivierungsmechanismus von ICl,Vol dienten Experimente unter gleichzeitiger Messung von ICl,Vol, Membrankapazität (CM) und (jedoch zeitlich unabhängig voneinander) der Zellhöhe. Die Ergebnisse wurden an Hand dreier Modellvorstellungen zur Aktivierung von ICl,Vol diskutiert.

Es bestand eine enge Korrelation zwischen Veränderungen der Zellhöhe und des aktivierten Stromes. Beide korrelieren jedoch nicht mit den Änderungen von CM. Dabei änderte sich CM bei einem Teil der Zellen praktisch nicht, d.h. geringer als 2% des Ausgangswertes vor Applikation hypotoner Lösung (n=17), bei den verbliebenen Teil zeigten sich deutliche Veränderungen von durchschnittlich 10,6 ± 0,9 % ( ± SEM, n=5). In letzterem Fall änderte sich jedoch immer zuerst ICl,Vol und dann CM. Nach Inhibierung des intrazellulären Vesikeltransports durch Brefeldin A war ICl,Vol ohne signifikante Änderungen auslösbar. Unter Cycloheximid, einem Blocker der Proteinsynthese auf Transkribtionssebene, wurden keine spezifischen Veränderungen von ICl,Vol beobachtet.

Auf jeden Fall ist CM nicht der primäre Trigger für ICl,Vol . Die Aktivierung von volumeninduzierten Chloridströmen erfolgt nicht maßgeblich durch die Inkorporierung von Ionenkanal - Proteinen enthaltenden Membranvesikeln.

Abstract

Volume-induced chlorid currents are characterised for many types of cells. I have investigated the modulation and activation of these currents. In cultered pulmonary artery endothelial cells (CPAE) patch clamp maesurements of membrane currents and simultaneous maesurements of free intracellular calcium ([Ca2+]i) were performed.

  1. Until now, activation of ICl,Vol was characterised as Calcium-independently. I maesured the current buffering [Ca2+]i with the Calcium chelators BAPTA and EGTA. It could be observed, that [Ca2+]i at concentrations less than 50 nM is required to activate ICl,Vol. At higher concentrations, there is no modulation by [Ca2+]i.
  2. Sodiumchromoglycate (CL) blocks ICl,Vol in endothelium cells. This effect is small (Ki=15mM) and slow (100 s) as compared of those of the classical chlorid channel blocker NPPB. Inhibitory effects of CL to ICl,Vol in endothelial cells are weaker than to ICl,Vol and to secretion of serotonin in mast cells.
  3. The role of intracellular phosphorylation signal pathways on activation of ICl,Vol was investigated. Neither activation of protein kinase C (PKC) throught direct application of the phorbol ester PMA nor down-regulation through preincubation with PMA had any effect on activation of ICl,Vol. Also Wortmannin, an inhibitor of MAP-kinases, failed to have significant effects on ICl,Vol. Lysophosphatic acid, wich activates MAP kinases as well as focal adhaesion kinase p125FAK, did not have any effect on ICl,Vol or activated some chlorid current. Induction of heat shock proteins (HSP) through application of thermical or chemical stress (incubation under 45 °C over 60 min or with 0,3 mM Sodiumarsenit) had no effect on ICl,Vol nor some activation of chlorid currents could be observed.
  4. We have combined maesurements of currents with maesurements of membrane capacitance (CM) and (but not simultaniously) of changes in cell height to study the activation mechanism of ICl,Vol.

The swelling-induced current is correlated with the changes in cell height. However, neither the changes in cell height nor ICl,Vol were correlated with CM. In some cells (n=17), there was no substantial change (less than 2%) in CM. In the remaining 5 cells, changes in CM are arround 10,6% ± 0,9% (average ± SEM). Thereby changes of CM started allways after those of ICl,Vol.

Inhibition of vesicular transport by Brefeldin A did not affect ICl,Vol significantly. The block of protein synthesis by Cyclophosphamid did not have specific effects on ICl,Vol.

It is concluded, that CM is not the primary trigger for ICl,Vol. Its activation is not due to incorporation of ion channels by vesicle fusion.


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Inhaltsverzeichnis

Titelseite"Zur Modulation volumenaktivierter Chloridströme in Endothelzellen"
1 Einführung
1.1.Volumenaktivierte Chlorid - Kanäle
1.2. Aktivierung von ICl,VOL
1.3. Funktionelle Rolle volumenaktivierter Chloridströme
1.3.1. Volumen - Regulation
1.3.2. Einfluß auf Membranpotential und Konzentration intrazellulären Kalziums
1.3.3. Proliferation
1.3.4. Kontrolle des pH
1.4. Elektrophysiologische Charakterisierung
1.4.1. Messung des Stromes in ' whole cell ' - Konfiguration
1.4.2. Einzelkanal - Messungen
1.5. Pharmakologie volumenaktivierter Chloridkanäle
1.5.1. Übersicht
1.5.2. Cromoglycinsäure als Blocker volumenaktivierter Chloridkanäle
1.6.Modulation volumenaktivierter Chloridströme
1.6.1. Modulation durch Phosphorylierung
1.6.2. Rolle des Zytoskeletts
1.6.3. Modulation durch intrazelluläres Kalzium
1.6.4.Modulation durch Thrombin
1.7.Molekulare Charakterisierung
1.7.1.Das Molekül ICl,N
1.7.2. Der Chloridkanal CIC-2
1.7.3. Das P-Glycoprotein
1.8.Charakteristik von volumenaktivierten Chloridströmen in Endothelzellen
2 Aufgabenstellung
2.1.1.Abhängigkeit volumenaktivierter Chloridströme von [ Ca2+i
2.1.2.Modulation von ICl,Vol durch Cromoglycinsäure
2.1.3.Modulation von ICl,Vol durch Tyrosinkinasen, Proteinkinase C und Calmodulin
2.1.4.Veränderung der Membrankapazität bei der Aktivierung von ICl,VOL
3 Materialien und Methoden
3.1. Zellen
3.2. Lösungen
3.3. 'patch clamp' - Technik zur Messung von transmembranären Strömen
3.4. Messung der intrazellulären Kalziumkonzentration
3.5.Kapazitätsmessungen
3.5.1.1.A) System auf Basis der Applikation eines rechteckförmigen Gleichspannungsimpulses
3.5.1.2.System auf Basis der Applikation einer sinusförmigen Wechselspannung
3.6. Messung der Zellhöhe
3.7. Statistik
4 Ergebnisse
4.1. Der Einfluß intrazellulären Kalziums auf volumenaktivierte Chloridströme
4.1.1.Inkubation mit BAPTA-AM
4.1.2.Messung unter Pufferung des intrazellulären Kalziums mit BAPTA und EGTA via Pipette
4.2. Einfluß von Cromoglycinsäure auf volumenaktivierte Chloridströme in Endothelzellen
4.3.Modulation volumenaktivierter Chloridströme durch Phosphorylierungsreaktionen
4.3.1. Modulation von Tyrosinkinasen
4.3.2.Modulation durch streßinduzierte Phosphorylierungsreaktionen
4.3.3.Modulation durch die Proteinkinase C
4.4. Werden volumeninduzierte Chloridströme durch Inkorporierung eines Kanalproteins aktiviert ?
4.4.1. Änderungen der Membrankapazität bei der Aktivierung volumeninduzierter Chloridströme
4.4.2.Der volumenaktivierte Strom korreliert mit den Veränderungen des Zellvolumens
4.4.3. Proteinstoffwechsel und volumenaktivierte Chloridströme
5 Diskussion
5.1. Physiologische Bedeutung von Osmolaritätsänderungen für Endothelzellen
5.2. Die Rolle des intrazellulären Kalziums bei der Modulation volumenaktivierter Chloridströme
5.3. Einfluß von Chromoglycinsäure auf volumenaktivierte Chloridströme in Endothelzellen
5.4. Modulation volumenaktivierter Chloridströme durch Phosphorylierung
5.5. Zusammenhang zwischen Zellschwellung und Membranstromaktivierung
5.5.1. Modellvorstellungen
5.5.2. Veränderungen der Membrankapazität unter hypotoner Lösung
5.5.3. Einfluß der Proteinsynthese auf volumenaktivierte Chloridströme
5.5.4. Zuordnung der Ergebnisse zu den Modellvorstellungen
6 Zusammenfassung
Bibliographie 8. Literaturverzeichnis
Bibliographie Teil 1
9. Veröffentlichungen
Bibliographie Teil 2
Weitere Veröffentlichungen:
Danksagung
Selbständigkeitserklärung
Lebenslauf

Tabellenverzeichnis

Tabelle 3.2-1:Verwendete Lösungen

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 3.3-1:Aufbau der verwendeten Protokolls für das Kommandopotential (HP) in der Art einer Rampe. Die Zeitdauer für das Protokoll beträgt 6,8 Sekunden. Alle 15 Sekunden wurde das Protokoll wiederholt. Zwischen zwei Protokollen blieb das HP auf einem Wert von 0 mV.
Abbildung 4.1-1:CPAE, mit 28% HTS induzierter Strom bei einem HP von -80 mV, Vergleich zwischen Inkubation mit 50 mM BAPTA-AM über 1h, Ladung via Pipettenlösung (enthält 5 mM BAPTA), und Kontrollösung (enthält 0.1 mM EGTA).
Abbildung 4.1-2:Experiment mit Applikation von 28% HTS beginnend unter Kontrollbedingungen bei Nystatin-perforiertem 'patch' (A). Nach Auswaschen Rupturierung, dadurch BAPTA-Beladung der Zelle via Pipettenlösung (enthält 5 mM BAPTA), dann erneute Applikation von 28% HTS (B).
Abbildung 4.2-1:Effekt von NPPB (100 mM) und Cromoglycinsäure (CL , 100 mM) auf volumenaktivierte Chloridströme in CPAE.
Abbildung 4.2-2:Effekt von extrazellulär appliziertem CL auf den HTS - induzierten Strom am Beispiel von 3 CPAE. Der helle Balken markiert die CL - Applikation.
Abbildung 4.2-3:Effekte von intra- und extrazellulär applizierter CL, der Strom wurde in einem HP-Fenster von 90-100 mV gemessen.
Abbildung 4.2-4:Volumenaktivierter Strom bei intrazellulärer Applikation von Cromoglycinsäure (CL), gemessen in einem HP-Fenster zwischen +90 und +100 mV:
Abbildung 4.3-1:HTS-induzierte Ströme [pA] unter Kontrollbedingungen sowie nach 6 und 12 min Inkubation mit 10 mM Wortmannin.
Abbildung 4.3-2:HTS-induzierte Ströme nach Hitze - und chemischem Streß, gemessen bei - 80 mV Haltepotential.
Abbildung 4.3-3:Statistischer Vergleich der durch 28% HTS induzierten Ströme bei -80 mV HP unter Kontrollbedingungen , nach PMA - Applikation (ab maximalem HTS - induziertem Strom 0,2 - 0,5 mM über 2-8 min) und nach Inkubation mit 0,1 und 0,2 mM über 24h
Abbildung 4.3-4:Zwei Messungen von durch 28% HTS induzierten Strömen bei -80 mV Haltepotential.
Abbildung 4.1-1:Vergleich der unterscheidlichen Reaktionen auf 28% HTS mit und ohne Veränderung der Membrankapazität am Beispiel zweier Zellen. Jeder Datenpunkt repräsentiert den Mittelwert von 10 folgenden Punkten.
Abbildung 4.4-2:Änderungen in Zellvolumen, Membrankapazität und volumen-aktiviertem Strom an CPAE unter Applikation von 10%, 28% und 50 % HTS.
Abbildung 4.4-3:Durch 28% HTS aktivierter Strom unter BFA und Cycloheximid. Die Messung des Stromes erfolgte bei einem Haltepotential von -80mV, danach erfolgte als Normalisierung eine Division durch die Membrankapazität.

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