Hiemann, Nicola E.: Histomorphometrische Untersuchungen myokardialer Blutgefäßveränderungen nach Herztransplantation. (Ein Beitrag zur Pathogenese der Transplantatvaskulopathie.)

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Kapitel 5. Methoden

5.1. Immunhistochemische Aufbereitung der Proben

Die Markierung von Oberflächenantigenen auf Zellen mit Hilfe spezifischer Antikörper ist eine Methode, die zur Zeit hauptsächlich in der Diagnostik von Neoplasien in Form von sog. Tumormarkern Verwendung findet. Man macht sich hierbei die unterschiedliche Expression von oberflächlichen Zellstrukturen zunutze, um verschiedene Zelltypen zu unterscheiden und Aussagen bezüglich ihres Aktivitätszustandes treffen zu können. Diese Methode wird ebenfalls seit 1996 am Deutschen Herzzentrum Berlin als Zusatzuntersuchung an rechtsventrikulären Kontrollbiopsien praktiziert. Es werden für jede Biopsie Präparate mit immunhistochemischen Markern für T-Zellen, B-Zellen, Makrophagen, Muskel-Aktin, Endothelzellen, HLA-DR sowie Kollagen III und V hergestellt. Somit steht neben einer HE-Färbung und einer Domagk-Färbung noch zusätzlich Material zur Verfügung, das eine genauere Beschreibung der zellulären Komponenten ermöglicht.

In der Immunhistochemie finden sowohl monoklonale als auch polyklonale Antikörper (Ak) für die Markierung von Antigenen (Ag) Verwendung. Monoklonale Ak werden von einem Plasmazellklon als Reaktion auf ein fremdes Ag ausgeschüttet, während polyklonale Ak das Produkt von mehreren verschiedenen Plasmazellen darstellen. Monoklonale Ak heben sich durch ihre weitreichende Homogenität, das Fehlen unspezifischer Ak, die leichte Charakterisierbarkeit sowie das Fehlen chargenabhängiger Qualitätsschwankungen hervor. Es ist jedoch zu beachten, daß der Verlust des Antigens oder die Beeinflussung seiner Reaktivität durch die Fixierung sowie die Existenz von mehr als einem möglichen Zielantigen (Kreuzreaktivität) die Aussagekraft und Qualität der histologischen Schnitte beeinflußt ( 82 ).

Um die Reaktion eines Ag mit einem spezifischen Ak sichtbar zu machen, wird der Ak an ein Enzym gekoppelt, welches anschließend bei entsprechendem Subtstratzusatz eine Farbreaktion auslöst. Man unterscheidet hierbei prinzipiell direkte und indirekte Färbemethoden. Bei der direkten Methode wird ein Ak verwendet, der spezifisch gegen ein bestimmtes Ag gerichtet ist. Sie ist schnell durchführbar und es treten kaum unspezifische Reaktionen auf, jedoch erfolgt auch keine Signalverstärkung ( 82 ). Im Gegensatz dazu werden bei der indirekten Methode zunächst unkonjugierte Ak an ein Ag gebunden, die im zweiten Schritt mit einem enzymgekoppelten Sekundärantikörper reagieren.

Zu den indirekten Färbeverfahren gehören auch die Avidin (Streptavidin)-Biotin-Methoden, die in dieser Arbeit Verwendung fanden. Diese nutzen die hohe Affinität von Avidin bzw. Streptavidin zu dem Vitamin Biotin, die eine höhere Sensitivität dieser Technik gegenüber anderen direkten und indirekten Färbemethoden bewirkt. Es werden derzeit zwei Methoden angewendet: die ABC-Technik, bei der ein vorgefertigter A vidin- B iotin-Enzym- K omplex eingesetzt wird, sowie die LAB-Technik, die enzymmarkiertes Avidin ( l abeled- a vidin- b iotin technique) nutzt. Das Prozedere besteht in der Applikation eines Primärantikörpers, eines biotinylierten Sekundärantikörpers (ABC) bzw. von enzymmarkiertem Avidin (LAB) und der Zugabe eines Substrates. Als Enzyme werden häufig Peroxidasen oder alkalische Phosphatase verwendet ( 82 ).

Die Qualität der auf diese Weise gewonnenen Präparate ist weiterhin abhängig von chemischen und physikalischen Einflußgrößen, wie z.B. Verdünnungen, Inkubationszeiten und der Raumtemperatur. Es ist daher erforderlich, zunächst eine möglichst optimale Konstellation der verschiedenen Reagenzien in Anlehnung an die vom Hersteller empfohlenen Richtlinien auszutesten.

Die innerhalb der Herzkatheteruntersuchungen entnommenen Biopsien wurden zum Transport in 4% gepuffertem Formol nach Lillie fixiert. Anschließend erfolgte eine Entwässerung und Einbettung des gewonnen Gewebes in Paraffin. Für die Anfertigung eines Präparates wurde dieses unter Kühlung in 3 mm starke Schnitte getrennt und getrocknet.

Die HE-Färbung umfaßte eine Entparaffinierung in Xylol und eine Rehydrierung in einer absteigenden Alkoholreihe (90% - 70% - destilliertes Wasser). Danach wurde der Schnitt zuerst mit Hämalaun angefärbt, anschließend mit HCl-Alkohol differenziert und zuletzt mit Eosin (2%) versetzt.

Für die immunhistochemischen Präparate wurden APES (3- Aktinopropyltriethoxysilene) - beschichtete Objektträger verwendet, um die Haftung des Gewebes zu verbessern. Die histologischen Schnitte wurden nach 10-15 minütiger Trocknung nach dem oben genannten Schema entparaffiniert und rehydriert. Die Inkubation mit dem Primärantikörper (30 min) erfolgte nach Spülung mit TRIS-


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(Trihydroxymethylaminomethanol) Puffer in sog. Cover-Plates (Firma Shandon), deren Funktion auf dem Kapillarspaltmechanismus basiert. Dabei wurde für a-Aktin der Klon 1 A4 und für CD 31 der Klon JC 70A verwendet. Anschließend wurde der Brückenantikörper (Avidin-Streptavidin-System der Firma Biogenex) appliziert (20 min). Vor und nach diesem Schritt wurde ebenfalls mit TRIS-Puffer gespült. Für die Farbreaktion wurden die Präparate für ca. 20 min unter Sichtkontrolle mit Neufuchsin-Kit (Firma Biogenex) versetzt. Die Gegenfärbung wurde mit Hämalaun (30 sec) durchgeführt. Zur Unterdrückung der Hintergrundreaktivität wurden die CD 31-Präparate 3 mal 6 min in Antigenretravictra (Firma Biogenex) gekocht.

5.2. Histomorphometrie

5.2.1. Untersuchungsbedingungen

Von den in Paraffin eingebetteten rechtsventrikulären Rejektionskontrollen jedes Patienten wurde jeweils die letze Biopsie im 1., 2., 3., 5., 8., 11. und 14. Monat nach HTx ausgewählt. Es wurden histologische Präparate mit immunhistochemischen Markern für Endothelzellen (CD 31) und glatte Muskelzellen (a-Aktin) angefertigt und zusammen mit der dazugehörigen HE-Färbung histomorphometrisch ausgewertet. Die Bewertung der histologisch festgestellten Abstoßungsepisoden erfolgte nach den Kriterien der ISHLT ( 9 ) und ihrer Ergänzung. Die Untersuchungen wurden mit dem Durchlichtmikroskop HD-2 der Fa. Olympus durchgeführt. Die morphometrischen Messungen erfolgten mittels eines in den Strahlengang eines Okulars plazierten quadratischen Netzrasters bei 500 facher Vergrößerung. Von 100 möglichen Testpunkten mußten mindestens 75 Testpunkte Gewebe bedecken. Gewertet wurden nur solche Gefäße, deren Wand zu über 50% positiv mit dem jeweiligen Antikörper reagierten. Es wurden je Präparat mindestens 8 nichtüberlappende Gesichtsfelder (GF) ausgezählt, so daß insgesamt 816 Präparate und 12.863 GF bewertet wurden.

5.2.2. Berechnung einzelner Parameter

In den immunhistologischen Schnitten wurden folgende Größen bestimmt:

Anhand der Präparate in HE konnten folgende Parameter erfaßt werden:

Die anschließenden Rechnungsgrößen konnten auf diese Weise ermittelt werden:


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5.3. Statistik

Die statistische Aufarbeitung erfolgte computergestützt mit Hilfe eines Auswertungsprogrammes (SPSS für Microsoft Windows, Version 6.0 und 6.1.2).

Es wurde eine deskriptive Auswertung mit Berechnung der Mittelwerte, der Standardabweichung sowie der Varianz durchgeführt. Da die morphometrischen Ergebnisse keiner Normalverteilung unterlagen, erfolgte die Signifikanzprüfung mit einem nichtparametrischen Test für zwei unabhängige Stichproben (Mann-Whitney-U-Test). Für den Vergleich der Werte innerhalb der Zeitverläufe wurde der Friedmann-Test und der Wilcoxon-Test benutzt. Die Auswertung der demographischen Daten erfolgte mit Hilfe des c 2 -Tests. Ein p < 0,05 wurde als statistisch signifikant betrachtet.


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