Hirth, Christina: NICHTINVASIVES OPTISCHES MAPPING UND SPEKTROSKOPIE ZUR FUNKTIONELLEN UNTERSUCHUNG DES GEHIRNS Räumliche, zeitliche und physiologische Aspekte lokaler Veränderungen der Blutoxygenierung bei funktioneller Aktivierung

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Kapitel 2. Material und Methoden

2.1. Die Nahinfrarot Spektroskopie (NIRS)

Die Nahinfrarot Spektroskopie (NIRS) ist eine optische Methode, die es ermöglicht anhand der Absorptionsänderungen von Licht im nahinfraroten Wellenlängenbereich transkraniell Konzentrationsänderungen von oxygeniertem (Delta [oxy-Hb]) und deoxygeniertem Hämoglobin (Delta [deoxy-Hb]) sowie Änderungen des Redoxstatus der Cytochromoxidase (DeltaCyt-O2) im lebenden Gewebe nichtinvasiv und kontinuierlich zu messen. Die Messungen der Absorption im Gewebe erfolgen grundsätzlich analog dem Prinzip der Absorptionsspektrophotometrie, wie sie als in vitro Technik in weiten Bereichen der klinischen und analytischen Chemie Anwendung findet.

Die Anwendung in-vivo basiert auf der Transparenz von lebendem Gewebe für nahinfrarotes Licht und den spezifischen Absorptionseigenschaften der Chromophore Hämoglobin und Cytochromoxidase, die die wichtigsten Absorber im menschlichen Gewebe darstellen. Besonderheiten ergeben sich bei der in vivo Anwendung dieses Prinzips der Absorptionsmessung aufgrund der Wechselwirkung von Licht mit stark streuendem Gewebe. Im folgenden wird zunächst das biophysikalische Prinzip der Absorptionspektroskopie beschrieben. Nachfolgend werden Grundvoraussetzungen sowie Besonderheiten der Anwendung der NIRS in vivo, sowie deren Bedeutung für die in vivo Messungen der Blutoxygenierung veranschaulicht.

2.1.1. Biophysikalische Grundlagen

Licht verschiedener Wellenlängen mit der Ausgangsintensität I0 wird beim Durchtritt durch eine Lösung, in der lichtabsorbierende Moleküle gelöst sind, in seiner Intensität geschwächt (I). Das Verhältnis zwischen I zu I0 wird als Transmission T definiert. Die Transmission stellt eine exponentielle Funktion der Konzentration des absorbierenden Stoffes dar. Die Abschwächung (A) der Lichtintensität ist demnach der Logarithmus aus I zu I0. Sie wird in Einheiten optischer Dichte (OD) gemessen. Das Lambert-Beer'schen Gesetz beschreibt die Beziehung zwischen Absorption und der Konzentration eines Chromophors im Medium nach der folgenden Gleichung.


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Demnach gilt, daß die Absorption (A) proportional zur Konzentration des gelösten Stoffes (c), dem spezifischen, wellenlängenabhängigen Extinktionskoeffizienten (alpha) sowie der optischen Pfadlänge ist.

Der Extinktionskoeffizient stellt eine Konstante dar, und beschreibt die spezifischen Absorptionseigenschaften eines Stoffes in Abhängigkeit von der Wellenlänge. Jedes Chromophor läßt sich anhand seiner spezifischen wellenlängenabhängigen Absorptionseigenschaften charakterisieren und trägt bei gegebener Wellenlänge und gleicher Konzentration in unterschiedlichem Maß zur Absorption bei. Das Produkt von alphac wird als Absorptionskoeffizient des absorbierenden Mediums bezeichnet (µalpha) und beschreibt den Zusammenhang zwischen der Konzentration des gelösten Stoffes und dem Grad der Absorption im Medium. Zur spezifischen Messung der Absorption nutzt man Licht einer Wellenlänge bei der der zu bestimmende Stoff sein Absorptionsmaximum hat. In einer Lösung in der lediglich ein Chromophor vorhanden ist entspricht A = µalpha. Sind in einer Lösung mehrere, unterschiedliche absorbierende Substanzen enthalten, so ergibt sich der Gesamtextinktionskoeffizient aus der linearen Summe der Einzelkoeffizienten jedes Stoffes. Zur differentiellen Konzentrationsbestimmung mehrerer Chromophore ist daher die Messung mit unterschiedlichen Wellenlängen notwendig.

A = [alpha1c1 + alpha2c2 + ........alphancn]d


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Der Einfluß des Messvolumens wird über die optische Weglänge (d) der Photonen erfaßt und entspricht in nichtstreuenden Lösungen der geometrischen Distanz zwischen Sender und Detektor.

2.1.2. Das optische Fenster des Gewebes

Im nahinfraroten Wellenlängenbereich zwischen 700 und 900 nm weist Licht eine gute Transmission im Gewebe auf (JÖBSIS 1977). Unterhalb von 700 nm schränkt intensive Hämoglobinabsorption in der Haut und oberhalb von 900 nm die starke Wasserabsorption die Transmission von Licht im Gewebe ein (Elwell Et. Al. 1992). Der Bereich zwischen 700 und 900 nm wird daher auch als bio-optisches Fenster bezeichnet. Da der Anteil der Absorption stark abnimmt, die Streuung jedoch relativ gleichbleibt (JÖbsis 1977, Svaasand und Ellingsen et. al. 1983) kann das NIR-Licht eine Eindringtiefe von bis zu mehreren Zentimetern im Gewebe (Wan ET. AL 1981, Chance et. al. 1988) erreichen. Dies ermöglicht die nichtinvasive Messung der Absorption auch in tiefergelegenen Gewebestrukturen.

Die Menge des transmittierten NIR-Lichtes wird bei gegebener Wellenlänge vom Gewebevolumen und von der Gewebezusammensetzung bestimmt (Wan ET. AL. 1981). Nahinfrarotes Licht durchdringt auch sehr dichtes Gewebe wie z.B. Knochen vergleichsweise gut und weist auch, nachdem es extrazerebrale Strukturen passiert hat, noch genügend Intensität auf um Messungen im Hirngewebe zu ermöglichen (Wan et al 1981, Svaasand und Ellingsen 1983).

2.1.3. Absorptionseigenschaften von Hämoglobin und Cytochromoxidase

Im Nahinfraroten Wellenlängenbereich sind Hämoglobin und Cytochromoxidase die wichtigsten Absorber. Oxygeniertes Hämoglobin, deoxygeniertes Hämoglobin sowie die oxidierte Form der Cytochromoxidase lassen sich anhand ihrer spezifischen Absorptionsspektren (WRAY ET. AL. 1988, JÖBSIS-VANDERVLIET ET. AL. 1988) differenzieren. Abbildung 1a zeigt die Absorptionseigenschaften von Hämoglobin im optischen Fenster des NIR Bereichs. Das Absorptionsmaximum von reduziertem Hämoglobin liegt am unteren Ende des Nahinfraroten Spektrums während oxygeniertes Hämoglobin ein Absorptionsmaximum bei 850 nm aufweist.


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Abb. 1: a) Absorptionsspektren von oxygeniertem (oxy-Hb) und deoxy-geniertem Hämoglobin (deoxy-Hb) im optischen Fenster des nahin-fraroten Wellenlängenbereich (650 - 1000 nm). Der Schnittpunkt der Spektren von oxy-Hb und deoxy-Hb bei 800 nm beschreibt den sog. isosbestischen Punkt (aus: YODH UND CHANCE 1995).
b) Differenzspektrum (der oxydierten und reduzierten Form) der Cytochromoxidase
(aus WRAY ET. AL. ).

Die beiden Absorptionsspektren schneiden sich bei 800 nm im sogenannten isosbestischen Punkt. Bei dieser Wellenlänge ist der Anteil der Absorption für beide Chromophore gleich und erlaubt die Bestimmung der Gesamthämoglobinkonzentration unabhängig vom Oxygenierungszustand der beiden Chromophore. Die differenzielle Bestimmung von Absorptionsänderungen der einzelnen Chromophore erfolgt mittels Messung mit mehreren Wellenlängen im Bereich der Absorptionsmaxima (WRAY 1988, COPE UND DELPY 1988, CHANCE ET. AL. 1991).

Die oxidierte Form der Cytochromoxidase besitzt eine schwache Absorptionsbande mit einem Maximum zwischen 820 und 840 nm während das Absorptionsmaximum der reduzierten Form der Cytochromoxidase im sichtbaren Bereich des Spektrums liegt. Die Absorptionsbande im NIR Bereich kommt durch Absorption der oxydierten Kupferanteile (CuA Zentrum) des Enzyms


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zustande, während die Hämanteile im Bereich des sichtbaren Lichtes absobieren (JÖBSIS-VANDERVLIET ET. AL. 1988). Bei Reduktion des Enzyms verschwindet die Absorptionsbande im NIR Bereich (FERRARI ET. AL. 1990). Absorptionsänderungen der oxydierten Form der Cytochromoxidase spiegeln daher Veränderungen im Redoxzustand des Enzyms wieder. Die spektroskopische Messung der oxydierten Form der Cytochromoxidase ist schwierig, da das Spektrum eine starken Überlappung mit der des Hämoglobins aufweist und das Enzym im Vergleich zum Hämoglobin in wesentlich geringerer Konzentration im Gewebe vorkommt. Daneben besteht Unklarheit darüber, ob die in vitro charakterisierten Spektren den Verhältnissen in vivo entsprechen (COOPER ET. AL. 1994).

2.1.4. Die Anwendung der NIRS in-vivo. Wechselwirkung von Licht mit Gewebe

Wenn Licht Gewebe durchdringt, kommt es zur Absorption und zur Streuung. Sowohl die Absorption, wie auch die Streuung tragen zur Abschwächung der Lichtintensität und damit als optische Parameter zur Messung bei.

Absorption von NIR Licht kommt im Hirngewebe vorwiegend durch Hämoglobin zustande. Es ist in vergleichsweise hoher Konzentration im Gewebe enthalten. Im Gegensatz zu anderen absorbierenden Substanzen, ändert sich die Absorption von Hämoglobin in Abhängigkeit von der Konzentration und dem Oxygenierungszustand (variabler Absorber). Andere Chromophore, wie Melanin, Lipide, Bilirubin und Wasser tragen demgegenüber lediglich als fixe Absorber nur in geringfügigem Maß (weniger als 10%) zur Absorption im NIR Bereich bei. Der Anteil der Absorption durch diese Stoffe kann jedoch lokal aufgrund unterschiedlicher Gewebezusammensetzung variieren und kann bei pathologischen Veränderungen an Bedeutung gewinnen.

Gewebe ist ein stark streuendes Medium. Streuung kommt durch die diffuse Richtungsänderung von Photonen beim Zusammentreffen mit im Gewebe enthaltenen Teilchen zustande. Die Wahrscheinlichkeit, mit der ein Photon im Gewebe gestreut wird, hängt von der Gewebezusammensetzung, - beschaffenheit und \|-\|dichte ab. Der Streukoeffizienten µs gibt ein Maß für die Streuung. In lebenden Geweben kommt es aufgrund der inhomogenen Gewebe-zusammensetzung zu multipler Streuung. Sie wird im wesentlichen an Grenzflächen verursacht, wo es durch Änderungen der Refraktärindizees zur Lichtbrechung kommt. Solche Grenzflächen sind auf mikroskopischer Ebene z.B. Zellmembranen und Zellbestandteile (BEAUVOIT ET AL


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1995) oder Grenzflächen makroskopischer Strukturen wie Knochen, weiße und graue Substanz und Haut.

Abb. 2.: Effekt von Absorption und Streuung auf die Lichtintensität und den Lichtweg der Photonen im Gewebe.

Die diffuse Streuung im heterogenen Gewebe hat im wesentlichen zwei Effekte: sie trägt neben der Absorption zum Lichtversust bei da nicht alle eingestrahlten Photonen den Detektor erreichen und die Wegstrecke der detektierten Photonen verlängert sich (Sevick ET. AL. 1992).

2.1.5. Methoden zur differentiellen Erfassung von Absorption und Streuung im Gewebe

Die Ausbreitung der Photonen (sog. Photonenmigration) im Gewebe läßt sich nicht direkt erfassen. Eine Differenzierung des Effektes von Streuung und Absorption auf die gemessene Lichtintensität, und damit die quantitative Bestimmung von absorbierenden Stoffen im Gewebe ist daher anhand von Messungen der Lichtintensität mit konventionellen Methoden nicht möglich und stellt das größte Problem bei der Anwendung der NIRS in vivo dar.

Der Lichtransport im Gewebe läßt sich jedoch mithilfe unterschiedlicher Theorien stark vereinfacht erklären. Die bekannteste ist die Diffusionstheorie, nach der die Ausbreitung von Licht im Gewebe ähnlich der Hitzediffusion erfolgt und mathematisch beschrieben werden kann (ARRIDGE ET. AL. 1992, Lakowicz et. Al. 1990, FarrELL ET. AL. 1992, Bonner ET. AL. 1987, SEVICK Et. AL. 1992). Diese Theorien gehen von homogenen optischen Eigenschaften des Gewebes aus und berücksichtigen im allgemeinen nicht den Einfluß unterschiedlicher Grenzflächen im Gewebe. Der Einfluß, solcher zusätzlicher Faktoren auf die Ausbreitung des Lichtes im Gewebe, läßt sich anhand von Modellen und mittels Monte Carlo Simulation theoretisch untersuchen und mit real erhobene Ergebnissen vergleichen (CHANCE ET.


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AL. 1988, FISHKIN UND GRATTON 1993, BOAS ET. AL. 1994, PATTERSON UND WILSON 1991). Die Kenntnisse aus solchen Photonenmigrationsmodellen bilden die Grundlage zur quantitativen und differenziellen Bestimmung des Effektes der Absorption und der Streuung auf die in vivo gemessene Lichtintensität mithilfe neuerer zeit- und frequenz- aufgelöster Techniken (YODH UND CHANCE 1995).

Die Zeitdauer der Photonenmigration steht in enger Beziehung zu den Streueigenschaften des Gewebes und bildet die Grundlage zur simultanen Messung von Absorption und Streuung mittels frequenzaufgelöster und zeitaufgelöster Spektroskopie. Diese Techniken gewinnen mit zunehmender Weiterentwicklung das Potential der simultanen Messung von Absorption und Streuung. Da diese Techniken nicht nur für die quantitative Messung der Blut- und Gewebeoxygenierung sondern auch für die Entwicklung bildgebender NIRS Techniken von besonderer Bedeutung sind sollen sie hier kurz besprochen werden.

Abb. 3: Prinzip der zeitaufgelösten und der frequenzaufgelösten Technik.der NIRS.

2.1.5.1. Zeitaufgelöste Meßtechnik (Time of flight Technik)

Die zeitaufgelöste Spektroskopie (Chance ET. AL. 1988, Delpy ET. AL. 1988, PATTERSON ET. AL. 1989, Sevick 1991) erfaßt den Effekt der Streuung über die Bestimmung der Laufzeit, die die Photonen vom Sender auf ihrem Weg durch das Gewebe bis zum Detektor benötigen. Ultrakurze Laserpulse werden in das Gewebe emittiert und mit einem Detektor, der an eine ultraschnelle Kamera angeschlossen ist, wiederaufgefangen. Als Zeitreferenz wird ein Teil des Laserpulses gleichzeitig direkt zur Kamera geleitet. Die Laufzeitverteilung gibt ein Maß für die Streuung im Gewebe. In Abhängigkeit von der zurückgelegten Distanz der Photonen findet sich ein exponentieller Abfall der Flugzeit. Unter der Voraussetzung, daß die Photonen das


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Gewebe mit konstanter Geschwindigkeit durchdringen, erlaubt die Messung der Laufzeit die Berechnung der optischen Wegstrecke im Gewebe nach der Gleichung:

L = c • t (L = optische Pfadlänge; c = Geschwindigkeit; t = Zeit).

2.1.5.2. Frequenzaufgelöste Meßtechnik (Phasenmodulationstechnik)

Eine andere Möglichkeit der Bestimmung des Effektes der Streuung bieten frequenzaufgelöste Messungen (CHANCE ET. AL. 1992, SEVICK ET AL. 1991, ARRIDGE ET. AL. 1992). Die Intensität einer Lichtquelle kann mit einer Frequenz von bis zu mehreren hundert MHz moduliert werden. Dies führt zu einer ‘wellenförmigen’ Ausbreitung des Lichtes im Gewebe. Aufgrund der Streuung kommt es zu einer Phasenverschiebung des frequenzmodulierten Lichtes, die sich mittels geeigneter Messtechniken erfassen läßt. Im Vergleich zu einer Referenz bei einer Pfadlänge von 0 läßt sich die Phasenverschiebung absolut bestimmen und damit die mittlere Pfadlänge des Lichtes im Gewebe berechnen. Spektrometer mit intensitätsmodulierten Laserdioden erlauben auf diese Weise die absorptionsspektroskopische Messung und die simultane Messung der optischen Pfadlänge bei mehreren Wellenlängen. Diese Technik ermöglicht die unmittelbare Korrektur der Lichtintensitätsänderungen von Variationen der Pfadlänge in Echtzeit. Die Technik hat den Vorteil, daß die gesamte optische Pfadlänge bestimmt wird. Sie ist daher relativ unempfindlich gegenüber Bewegungsartefakten und erfordert nicht mehr die Bestimmung der geometrischen Weglänge d. Die phasenmodulierte Spektroskopie ist technisch weniger aufwendig als die zeitaufgelöste Meßmethode und läßt sich daher auch flexibel am Krankenbett nutzen.

2.1.5.3. Ganzspektrum-Nahinfrarot-Spektroskopie

Mithilfe eines CCD Spektrophotometers lassen sich Messungen über den gesamten spektralen Bereich des Nahinfraroten Wellenlängenbereiches vornehmen (COPE ET. AL. 1989). Dies erlaubt die Bestimmung der Wasserabsorption als Referenzchromophor. Wasser ist in relativ konstanter und bekannter Konzentration im Gewebe enthalten. Das Wasserspektrum zeigt ein Absorptionsmaximum bei 975 nm und weniger deutliche Absorptionspeaks bei 820 und 760 nm.. Nach Matcher und Cooper (Matcher et. Al. 1994, COOPER ET. AL. 1996) läßt sich, bei bekannter Wasserkonzentration im Gewebe mithilfe der second differential analysis durch die Messung der Amplitude mehrerer Wasserabsorptionsspektren (bei 730 und 830 nm) die mittlere optische Pfadlänge in einem Medium bestimmen. Eine Erweiterung dieses Ansatzes ermöglicht auch die absolute Bestimmung der deoxy-Hämoglobinkonzentration sowie der Quantifizierung von Konzentrationsänderungen anhand von Differenzspektren des Hämoglobins (COOPER ET. AL 1996).


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Im Gegensatz zur zeit- und frequenzaufgelösten Technik basiert die Ganzspektrum-NIRS Technik lediglich auf der Messung der Absorption und stellt daher strenggenommen keine Methode zur direkten Erfassung der Streuung dar. Die hohe spektrale Auflösung des Ganzspektrum Ansatzes kann jedoch zu einer genaueren Bestimmung der Chromophore insbesondere auch der Bestimmung des Cytochromoxidase-Signals genutzt werden.

2.1.6. Quantifizierung von NIRS Messungen mit konventionellen Methoden.

Die Konzentration eines Chromophores läßt sich anhand der Absorption nach dem Lambert-Beer'schen Gesetzes wie folgt berechnen:

C = A • alpha-1 • d-1

Die Anwendung des Lambert Beerschen Gesetzes gilt jedoch strenggenommen nur für nichtstreuende Medien da nur hier ein lineares Verhältnis zwischen Absorption und Konzentration des zu bestimmenden Chromophores besteht. Zur Konzentrationsbestimmung eines Chromophores in stark streuenden Medien muß der Effekt der Streuung auf die Lichtintensität sowie die optische Pfadlänge berücksichtigt werden. Da mit den gängigen konventionellen Meßsystemen eine differenzielle Bestimmung von Absorption und Streuung im Gewebe nicht möglich ist, erfolgt die Quantifizierung von Absorptionsmessungen in stark streuenden Geweben anhand eines modifizierten Lambert-Beer'sches Gesetzes (Cope ET. AL. 1987, Wyatt 1986) wie folgt:


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Dabei berücksichtigt G den Anteil des Lichtverlust durch Streuung und B die Verlängerung der optischen Wegstrecke der Photonen. Da der Lichtverlust (G) nicht bestimmt werden kann, ist eine absolute Quantifizierung der gemessenen Chromophore in streuenden Medien auch mithilfe des modifizierten Lambert-Beer'schen Gesetzes nicht möglich. Unter der Voraussetzung, daß der Effekt der Streuung und damit G und B über die Messzeit konstant bleiben, lassen sich Konzentrationsänderungen wie folgt berechnen:

DeltaC = DeltaA/alpha • d • B

Der Effekt der Streuung auf die optischen Pfadlänge wird mithilfe eines sog. differentiellen Pfadlängenfaktors (DPF) berücksichtigt. Dieser DPF stellt einen experimentell ermittelten dimensionslosen Skalierungsfaktor für die Verlängerung der mittleren Weglänge der Photonen pro Zentimeter geometrischer Distanz zwischen Sender und Empfänger dar. Dementsprechend, läßt sich durch Multiplikation des DPF mit der jeweiligen geometrischen Distanz d zwischen Sender und Detektor näherungsweise die mittleren Pfadlänge des Lichtes im Gewebe errechnen.

Der DPF ist wesentlich abhängig von der Gewebezusammensetzung, der Wellenlänge (Essenpreis ET. AL. 1993) und der Optodengeometrie (Van der Zee et al. 1990). Die aus der Literatur bekannten DPF Werte stammen aus Messungen mithilfe der Time-of-flight-Technik (Van der Zee et. Al. 1992) und der Phasenmodulationstechnik (Duncan et. Al. 1995, Benaron et al. 1995). Sie wurden unter bestimmten Voraussetzungen an einer unterschiedlichen Anzahl von Probanden eines Kollektivs (Neugeborene und Erwachsene) und für unterschiedliche Gewebearten (Muskel, Gehirn) ermittelt und stellen einen Durchschnittswert für das entsprechende Gewebe dar. Interindividuellen anatomischen oder meßgeometrischen Unterschieden kann mit dieser Berechnungsmethode daher nicht Rechnung getragen werden. Sie resultieren daher in Ungenauigkeit bei der Berechnung mittels eines konstanten DPF Wertes. In Abhängigkeit von der zur Pfadlängenbestimmung benutzten Technik, wird eine Variationsbreite des DPF von bis zu 15% im jeweiligen Untersuchungskollektiv angegeben (DUNCAN ET. AL. 1995). Entsprechend groß ist die Fehlerbreite bei der Berechnung der Konzentrationsänderungen unter Anwendung dieses Verfahrens einzuschätzen. Die Anwendung des DPF ermöglicht jedoch näherungsweise die Quantifizierung der Messungen mit konventionellen NIRS Systemen, die zur Messung der Absorptionsänderungen eine kontinuierliche Lichtquelle nutzen und daher keine Informationen zur Bestimmung der optischen Wegstrecke beinhalten.


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2.1.7. Messvolumen und signalgebende Strukturen

Das Messvolumen wird wesentlich von der geometrischen Anordnung von Lichtquelle und Detektor bestimmt (VAN DER ZEE et. al. 1990). Beim Erwachsenen erfolgen die Messungen aufgrund der Dichte des Gewebes im sog. Reflektionsmodus. Aufgrund der starken Streuung kommt es zur Ablenkung des Lichtes im Gewebe und ein Teil des vom Sender eingestrahlten Lichtes kann von einem Detektor in einigen Zentimetern Abstand wieder aufgenommen werden (siehe Abbildung 4). Modellrechnungen zeigen, daß die Photonen bei Messungen im Reflektionsmodus schematisch ein halbkreisförmiges Gewebevolumen zwischen Sender und Empfänger durchdringen (CHANCE ET. AL.1988, BONNER ET. AL.1987, Patterson et. Al. 1989, GRATTON ET. AL. 1994).

Abb. 4: Schematische Darstel-lung des angenommenen Lichtweges und des Messvolumens bei Messungen im Reflektionsmodus bei unterschiedlicher geometrischer Distanz von Lich-tquelle und Detektor (modifiziert nach GRATTON ET. AL. 1994).

Die Eindringtiefe ist wesentlichen abhängig vom Interoptodenabstand. Mit zunehmendem Interodenabstand wird der Lichtweg länger und die Eindringtiefe im Gewebe nimmt zu (VAN DER ZEE ET. AL. 1990, Gratton et. Al. 1994). Entsprechend wird der Beitrag extrazerebraler Strukturen geringer und der intrazerebrale Signalanteil nimmt zu (McCORMICK ET. AL. 1992, HARRIS ET. AL. 1993). Die durchschnittliche Eindringtiefe beträgt nach theoretischen Berechnungen ungefähr die Hälfte des Interoptodenabstandes (Gratton et. Al. 1994, Chance et. al. 1988). Um kortikales Gewebe zu erreichen wurde in der vorliegenden Untersuchung daher ein Interoptodenabstand von 3,5 cm gewählt. Die räumliche Auflösung läßt sich nicht exakt bestimmen, wird jedoch auf wenige cm3 geschätzt. Eine verbesserte räumliche Auflösung kann vermutlich durch die selektive Messung von Photonen mit einer bestimmten Pfadlänge (time-gating), unter Anwendung von zeitaufgelösten Techniken erreicht werden (SHINOHARA ET. AL. 1993, BENARON ET. AL. 1993), während Messungen mit


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unterschiedlichem Interoptodenabstand möglicherweise eine selektive Tiefenauflösung ermöglichen (GRATTON ET. AL. 1994).

Der Beitrag unterschiedlicher Gewebestrukturen zum Absorptionssignal ist abhängig vom Ausmaß der jeweiligen Blutversorgung. Der extrazerebrale Signalanteil kommt vorwiegend durch die Hautdurchblutung und die Blutversorgung innerhalb der Spongiosa des Schädelknochens zustande. Aufgrund des quantitativen Anteils an der Gefäßversorgung werden intrazerebral vorwiegend arterioläre und venöse Mikrozirkulation erfaßt. Dementsprechend tragen größere Gefäße vermutlich nur unwesentlich zur Absorption bei (LIU ET. AL. 1995).

2.1.8. Die Messparameter und ihre physiologische Bedeutung

2.1.8.1. Hämoglobin

Das Hämoglobin ist als Trägersubstanz von Sauerstoff und Wasserstoffionen die Schlüsselsubstanz im Blutgastransport und Säure-Base-Haushalt. Aufgrund seiner spezifischen Struktur besitzt Hämoglobin die Möglichkeit Sauerstoff reversibel zu binden. Durch die Bindung eines O2 Moleküls je Hämanteil entsteht das Oxyhämoglobin, durch Abgabe das Deoxyhämoglobin. Die Sauerstoffsättigung erfolgt in Abhängigkeit vom Sauerstoffpartialdruck im Blut entsprechend dem in der Sauerstoffbindungskurve beschriebenen Zusammenhang. Bei der Bindung von O2 an das Eisen des Häm handelt es sich um eine Komplexbindung, bei das Eisen zweiwertig bleibt. Im Gegensatz zur irreversiblen chemischen Bindung der Oxidation, wird dieser Vorgang Oxygenierung bzw. Deoxygenierung genannt. Die mit diesem Vorgang verbundene Änderung der Quartärstruktur des Hämoglobinmoleküls geht mit einer Änderung des Absorptionsspektrums einher (siehe Absorptionscharakteristik) und erklärt die oxygenierungsabhängigen Absorptionseigenschaften des Hämoglobins (LÖFFLER ET. AL. 1985).

Die Blutoxygenierung hängt unter physiologischen Bedingungen von der Durchblutung und vom O2 Verbrauch des Gewebes ab. Konzentrationsänderungen des oxygenierten (Delta[oxy-Hb]) und des deoxygenierten (Delta[deoxy-Hb]) Hämoglobins reflektieren damit Veränderungen der vaskulären Oxygenierung in Abhängigkeit von Änderungen der regionalen Durchblutung und des Sauerstoffmetabolismus im durchstrahlten Gewebevolumen.


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Die Berechnung der Gesamthämoglobinkonzentration (Delta[total-Hb]) erfolgt aus der Summe von Delta[oxy-Hb] und Delta[deoxy-Hb] und gibt näherungsweise einen Hinweis auf Veränderungen des korpuskulären Blutvolumens (WYATT ET. AL. 1990).

Das Delta[diff-Hb] wird berechnet aus der Differenz aus Delta[oxy-Hb] und Delta[deoxy-Hb]. Es stellt einen Index für Gesamtveränderungen der Blutoxygenierung dar, und gibt unter bestimmten Voraussetzungen einen Hinweis auf Veränderungen der Sauerstoffsättigung des Blutes.

2.1.8.2. Cytochromoxidase (Cytochrom aa3)

Die Cytochromoxidase (Cytochrom a,a3) ist die terminale Oxidase der Atmungskette. Das Enzym durchzieht die innere Mitochondrienmembran und katalysiert im Rahmen der oxidativen Phosphorilierung mehr als 90% des im Gewebe metabolisierten Sauerstoffs. Der oxidative Sauerstoffmetabolismus ist für den größten Teil der ATP Produktion und damit für die Energieversorgung der Zellen verantwortlich. Die Cytochromoxidase stellt daher einen wesentlichen Indikator für den Energiezustand der Zelle dar (NEWSHOLME UND LEECH 1994).

Die Cytochromoxidase besteht aus vier metallischen Redoxzentren, zwei Hämgruppen (Fea und Fea3) und zwei proteingebundenen Kupferzentren (CuA und CuB) (JÖbsis 1977), die bei der Elektronenübertragung des Enzyms ihren Redoxzustand ändern. Die beiden Hämgruppen verhalten sich in der Lichtabsorption und in ihrem Redoxpotential verschieden und werden als Cytochrom a und Cytochrom a3 bezeichnet. Insgesamt werden jeweils 4 Sauerstoffelektronen in einer stufenweisen Reduktion auf den Sauerstoff übertragen (CHANCE ET. AL. 1962) CuB und FeA3 (Häm a3) bilden den O2-Bindungsort des Enzyms. Nur sie reagieren direkt mit Sauerstoff, übernehmen Elektronen von FeA und CuA und katalysieren die Reduktion von Sauerstoff (NEWSHOLME UND LEECH 1994). Bei der für die Wasserbildung erforderlichen Protonenwanderung entsteht ein elektrochemisches Potential, das für die ATP-Bildung verantwortlich ist (chemiosmotische Hypothese) (MITCHELL 1961).

Wenn kein Sauerstoff als Elektronenakzeptor vorhanden ist (Sauerstoffmangel) kommt es zur Elektronenansammlung d.h. zur Reduktion in allen vier Zentren des Enzyms (Chance ET.AL. 1966). Die Zunahme der oxydierten Form der Cytochromoxidase läßt sich über das im nahinfraroten Wellenlängenbereich absorbierende Kupferzentrum CuA detektieren (JÖbsis 1977). Die


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Messungen reflektieren Veränderungen im Verhältnis zwischen oxydierter und reduzierter Form des Enzyms und bieten daher potentiell eine Möglichkeit direkt Informationen über Sauerstoffangebot und Energiehaushalt in der Zelle zu erhalten (TSUJI ET. AL. 1995. Bei einer zeitlichen Auflösung im Sekundenbereich, ließen sich damit frühzeitig anoxische und ischämische Zellschädigungen detektieren. Die Interpretation der Messungen der Cytochromoxidase ist jedoch umstritten und wird neben den methodischen Schwierigkeiten auch durch noch offene Fragen der genauen physiologischen Bedeutung und Funktionsweise der Cytochromoxidase erschwert. Die Ergebnisse der Messungen der Cytochromoxidase sind daher in der vorliegenden Arbeit nicht enthalten.

2.1.8.3. Streuung

Der Streuung wurde bisher im wesentlichen nur eine Bedeutung im Hinblick auf methodische Gesichtspunkte bei der Quantifizierung des NIRS Signals beigemessen. Mit der Entwicklung von Techniken, die es erlauben die Streueigenschaften des Gewebes direkt zu erfassen (s.o.), können diese grundsätzlich selbst auch als physiologisches Signal genutzt werden. Der enge Zusammenhang zwischen Streuung und Refraktärindex des Gewebes erlaubt potentiell die Differenzierung lokaler Unterschiede in der Gewebezusammensetzung und bietet damit potentiell die Möglichkeit die optischen Eigenschaften auch zur strukturellen Bildgebung zu nutzen. Erste Ansätze zur bildgebenden Anwendung wurden bereits vorgestellt (BENARON ET. AL. 1993 CHANCE et. Al. 1993a, SHINOHARA ET. Al. 1993).

Daneben gibt es experimentelle Hinweise, daß neuronale Aktivität mit transienten Veränderungen der Streueigenschaften im durchstrahlten Gewebe einhergehen (COHEN 1973). Solche Veränderungen in den optischen Eigenschaften von Nervengewebe bei neuronaler Aktivität wurden erstmals durch Hill und Keynes beschrieben (Hill und Keynes 1949). In vitro Experimente in Zellpräparationen (STEPNOSKI ET. AL. 1991), an Brain slices (Mac Vicar und Hochman 1991, MAC VICAR ET. AL. 1993) sowie tierexperimentell im ‘blutleeren’ Gehirn (FEDERICO ET. AL. 1994) geben ebenfalls direkte Hinweise für Veränderungen der Streueigenschaften des Gewebes in Verbindung mit neuronaler Aktivität. Daneben zeigen optische Messungen am offenen Kortex im Tier (GRINVALD ET. AL. 1991 GRINVALD ET. AL. 1986 TS’O ET. AL. 1990 und im Menschen (HAGLUND ET. AL. 1992), daß es neben Veränderungen der wellenlängenabhängigen Absorption auch zu wellen-längenunabhängiger Veränderung der Streueigenschaften kommt. Unterschiedliche physiologische Mechanismen werden hierfür disku-


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tiert, wie z.B. die transiente Zellschwellung von neuronalen und glialen Zellen durch Ionenenströme bei der Depolarisation (MAC VICAR UND HOCHMAN 1991), die direkte Wirkung von Neurosekretion (SALZBERG ET. AL. 1986) oder die Dipoländerungen an der Zellmembran bei Depolarisation (STEPNOSKI ET. AL. 1991. Transiente schnelle Veränderungen, die mit einer zeitlichen Latenz von 50 bis 100 ms auftreten wurden mithilfe frequenzaufgelöster transkranieller NIRS Technik auch bei visueller Stimulation im Menschen beschrieben (GRATTON et. Al. 1995). Aufgrund der Ähnlichkeit der zeitlichen Dynamik mit elektrophysiologischen Messungen legen sie einen Zusammenhang mit neuronaler Aktivierung nahe, stellen jedoch bisher eine Einzelbeobachtung dar. Die simultane Messung von Änderungen der Streueigenschaften und der Absorption mithilfe moderner optischer Techniken beinhaltet damit potentiell die Möglichkeit der direkten Erfassung neuronaler Aktivität und sekundärer hämodynamischer Antwort mit derselben Methode.

2.1.9. Methodische Ansätze zur optischen Bildgebung mithilfe der NIRS

Die Möglichkeit lokale Veränderungen der optischen Eigenschaften bei funktioneller Aktivierung mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung bildgebend zu erfassen, wurde durch die Messung optischer intrinsischer Signale am offenen Kortex am Tier und im Menschen erstmals eindrucksvoll demonstriert (GRINVALD ET. AL. 1986, HAGLUND ET. AL 1992). Die Invasivität dieses Ansatzes limitiert jedoch die Anwendung im Menschen. Im Gegensatz dazu eignet sich die bisherige spektroskopische Messung der Absorption mittels unilokulärer NIRS-Messtechnik lediglich zur Beurteilung von zeitlichen Veränderungen der optischen Eigenschaften des Gewebes, während eine bildgebende Detektion lokaler Veränderungen der optischen Eigenschaften des Gewebes eine multilokuläre Ableittechnik erfordert. Die Realisierung einer nichtinvasiven optischen Bildgebung bei transkranieller Anwendung der NIRS wird jedoch durch die diffuse Ausbreitung des Lichtes im stark streuenden Gewebe erheblich erschwert. Erste Ansätze zur nichtinvasiven optischen Bildgebung im Tierversuch wurden von Benaron und von Shinohara vorgestellt (BENARON ET. AL. 1993, SHINOHARA ET. AL. 1993). Beide Ansätze basieren auf der selektiven Detektion von Photonen einer bestimmten Pfadlänge (time-gating) mithilfe der 'time-of-flight’ Technik. Dies erlaubt eine relativ genaue bildgebende Rekonstruktion unter Anwendung eines Rückprojektionsalgorithmus (backprojektion Algorithmus). Solche Ansätze gehen jedoch auf Kosten des Signal-Rausch-Verhältnisses und erfordern technisch aufwendige Methoden. Experimentelle Befunde aus Modelluntersuchungen legen jedoch nahe,


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daß sich lokale Absorptionsunterschiede auch mithilfe konventioneller Meßmethode anhand der Veränderungen der Lichtintensität als ‘Schatten’ an der Oberfläche detektieren lassen (GRATTON ET. AL. 1994, HEBDEN UND KRÜGER 1990, SEVICK ET. AL. 1994)..

Diese Untersuchungen bilden die theoretische Grundlage für den hier vorgestellten Ansatz zur multilokulären Erfassung von Veränderungen der Absorption bei funktioneller Aktivierung des Gehirns mittels konventioneller spektroskopischer NIRS. Unter der Annahme einer uniformen Ausbreitung des Lichtes im Gewebe, wurden zur Erfassung lokaler Veränderungen der Absorption unter Anwendung eines konstanten Interoptodenabstandes multiple spektroskopische Messungen in einem definierten Messareal vorgenommen.

Abb. 5: schematische Darstellung des Effektes eines absorbierenden Objektes im optischen Feld auf die an der Oberfläche detektierte Lichtintensität (modifiziert nach GRATTON ET. AL. 1994).

2.1.10. Das Meßgerätes Hamamatsu NIRO 500

Das NIRO 500 (Hamamatsu, Japan) erlaubt Messungen in den vier Wellenlängen 775 nm, 825 nm, 850 nm und 904 nm (COPE UND DELPY 1988). Die Laserdioden arbeiten abwechselnd mit gepulstem monochromatischem Licht mit einer Pulsfrequenz von 1,9 kHz und haben eine durchschnittliche Leistung von 1mW. Die Puls-frequenz ist hoch und die Pulsdauer kurz im Vergleich zur Datenakkumulationsperiode, so daß die Kontinuität der Messung dennoch erhalten bleibt. Das Licht wird über ein flexibles Glasfaserkabel von der Lichtquelle zum Kopf des Probanden geleitet. Über eine zweite Optode wird transmittiertes Licht wieder aufgefangen und zum Detektor ge-


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leitet. Als Detektor dient ein Photomultiplier (PMT). Die auf den Detektor auftreffenden Photonen erzeugen einen elektrischen Impuls und werden verstärkt. Nach Aufsummieren der detektierten Impulse in einem Mehrkanalphotonenzähler innerhalb einer variablen Datenakkumulationsperiode, die mind. 0,5 sec beträgt, werden die Meßwerte getrennt nach Wellenlänge an einen Microcomputer weitergeleitet. Aus den elektrischen Signalen werden unter Einbeziehung von Korrekturfaktoren für jede Wellenlänge Werte der optische Dichte (OD) berechnet (WRAY ET. AL. 1988). Die zeitliche Auflösung der Messungen wird durch die Wahl der Dauer der Datenakkumulation (Sample rate) bestimmt. Die Messungen in dieser Untersuchung wurden mit einer Sample rate von 1 sec vorgenommen.

Mithilfe eines Algorithmus der die Messung aller vier Wellenlängen berücksichtigt, lassen sich aus den Änderungen der optischen Dichtewerte entsprechend dem modifizierten Lambert-Beer'schen Gesetz die Konzentrationsänderungen der einzelnen Chromophore bestimmen (WRAY et. al. 1988).

Das NIRO 500 gestattet lediglich die Messung von Veränderungen der Lichtintensität. Sie erlaubt nicht die simultane Bestimmung der optischen Wegstrecke der detektierten Photonen. Zur Berechnung der Konzentrationsänderungen wurde daher in der vorliegenden Arbeit ein DPF von 5,93 (± 0.42) herangezogen (Van der Zee et. Al. 1992. Dieser DPF wurde mittels ‘time-of flight’ Messungen als Mittelwert für die Verlängerung der mittleren Pfadlänge am Gehirn des Erwachsenen errechnet. Die relativ geringe Variationsbreite dieses DPF Wertes ab einem Interoptodenabstand von mehr als 2,5 cm rechtfertigt die Anwendung zur Berechnung der Konzentrationsänderungen bei unterschiedlichen Messungen. Da in allen Messungen ein Interoptodenabstand von 3,5 cm angewandt wurde, errechnet sich mithilfe dieses DPF eine effektive optische Pfadlänge von 20.76 cm. Unter der Voraussetzung, daß die errechnete Pfadlänge mit der tatsächlichen mittleren Pfadlänge in der jeweiligen Messung übereinstimmt entsprechen die aufgeführten Werte Konzentrationsänderungen in µmol/l Gewebe.

2.2. Dreidimensional hochauflösendes MRT

Um eine Darstellung der Optodenpositionen mit topographischem Bezug zu den darunterliegenden Hirnstrukturen zu ermöglichen, wurde bei allen Probanden der Mapping Studie eine


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hochauflösende dreidimensionale MRT (3D MRT) Untersuchung des Kopfes durchgeführt. Die hochauflösende 3D MRT Untersuchung erlaubt aufgrund der Aufnahmetechnik mit enger Schichtführung die Interpolation und dreidimensionale Rekonstruktion unterschiedlicher anatomischer Strukturen (z.B. Kortexoberfläche).

Die kernspintomographischen Untersuchungen erfolgten in Zusammenarbeit mit der Radiologischen Abteilung des Universitätsklinikums Benjamin Franklin mittels eines Siemens Vision 1,5 Tesla MRT Gerätes und unter Anwendung einer zirkulären Standard-Kopfspule. Es wurde eine T1 gewichteten 3D Flash Sequenz mit den folgenden Parametern durchgeführt: TR 13,5 ms, TE 7,0 ms, FOV 173 x 230 mm. Die Schichtführung erfolgte coronar mit einer Schichtdicke von 1 mm. Die Bildverarbeitung wurde mithilfe des Standardsoftwarepaketes Curry (Philips) an einer UNIX SUN Workstation vorgenommen. Die Auswertung der MRT Untersuchungen beinhaltete die Segmentierung und dreidimensionale Oberflächenre-konstruktion der Kopfoberfläche, sowie der Kortexoberfläche mithilfe eines Threshholdingverfahrens anhand der unterschiedlichen Dichtewerte der anatomischen Strukturen. Bei starker Überlappung der Dichtewerte erfolgte die Segmentierung nach manueller Selektion der zu segmentierenden Hirnoberfläche. Anschließend erfolgte die Projektion der einzelnen Optodenposition auf die dreidimensional rekonstruierte Kortexoberfläche. Die Markierung der Optoden wurde anhand der Koordinaten für die Optodenposition aus den Einzelschichten vorgenommen. Diese Koordinaten wurden auf die 3D Bildrekonstruktion übertragen und erlaubten damit die direkte Darstellung der Optodenpositionen in Bezug zur 3D rekonstruierten Kortexoberfläche. Die Darstellung der Meßpositionen mit maximalen Veränderungen in den Einzelschichten erfolgte manuell nach dem folgenden Schema: in allen drei Schichten (coronar, transversal sowie gegebenenfalls sagittal) wurde die Optodenmarkierung aufgesucht und anhand einer Hilfslinie parallel zur Kopfoberfläche und einer 90° Achse der kürzeste Weg zur Kortexoberfläche in den relevanten Schichten bestimmt und die Markierung auf dem Kortex vorgenommen.

2.3. Transkranielle Ultraschall-Dopplersonographie

Simultane Messungen der Blutflußgeschwindigkeit (cerebral blood flow velocity oder CBFV) in der Arteria cerebri media (MCA) mithilfe der Transkraniellen Dopplersonographie (TCD) in der TCD-NIRS Vergleichsstudie, erfolgten mit einem computergestützten Dopplersonographiegerät


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(Multidop DWL X Sipplingen, Germany). Das Gerät erlaubt die kontinuierliche Messung und Aufzeichnung der Blutflußgeschwindigkeit in den basalen Hirngefäßen nach einer von Aaslid entwickelten Methode (AASLID ET. AL. 1982).

Das Ultraschallsignal wird, mit einer definierten Frequenz, an einer Stelle der Kalotte, die wenig Knochendichte aufweist (Knochenfenster), auf eines der großen intrakraniellen Gefäße gerichtet und das reflektierte Signal, innerhalb eines definierten Zeitfensters von einem Empfänger in derselben Sonde wieder aufgefangen. Durch das Zeitfenster kann das Signal auf eine bestimmte Tiefe fokussiert werden. Durch die Reflektion des Ultraschalls an den bewegten Erythrozyten kommt es zu eine Frequenzänderung zwischen abgesandtem und reflektiertem Schall (sog. Dopplerschift). Diese Frequenzänderungen lassen sich fortlaufend registrieren. Über die fortlaufende Frequenzanalyse läßt sich kontinuierlich die Blutflußgeschwindigkeit errechnen und registrieren. Die Methode erlaubt Aussagen über Strömungsrichtung und Strömungsgeschwindigkeit des Blutes in den großen intrakraniellen hirnversorgenden Arterien.

Mittels einer 2 MHz Sonde wurde auf diese Weise die linke MCA in einer Tiefe von 50 mm transtemporal nach Standardkriterien geschallt (HARDERS 1984). Nachdem die Einstellungen ein optimales Signal ergaben, wurde die Sonde mithilfe eines Kopfbandes fixiert um den Einschallwinkel über die Untersuchungszeit konstant zu halten. Die Blutflußgeschwindigkeit wurde automatisch, wie oben beschrieben errechnet und im Computer gespeichert. Nach Beendigung der Messung wurde das Signal mithilfe eines low pass Filters mit einer Grenzfrequenz von 0,7 Hz gefiltert. Durch die Filterung wurden systolisch-diastolische Schwankungen der Blutflußgeschwindigkeit innerhalb des Herzzyklus eliminiert. Danach wurden die Daten in ASCII Format transformiert und off-line weiterverarbeitet. Auf diese Weise war es möglich die Veränderungen der Blutflußgeschwindigkeit bei funktioneller Aktivierung im Zeitverlauf mit einer hohen zeitlichen Auflösung zu ermitteln.


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2.4. Methodischer Aufbau

2.4.1. Das Untersuchungskollektiv

Insgesamt wurden 18 Probanden im Alter von 22 bis 45 Jahren (28,5 ± 5,2 Jahre) untersucht. Es wurden ausschließlich gesunde Versuchspersonen, die klinisch-neurologisch ohne pathologischen Befund waren und keinerlei Anzeichen für eine neurologische Erkrankung in der Vorgeschichte aufwiesen, eingeschlossen. Alle Personen waren nach eigenen Angaben Rechtshänder. Um die Anordnung und Markierung der Optoden zu erleichtern, und um lokale Störeinflüße durch Behaarung gering zu halten, wurden für die NIRS-Mapping-Untersuchungen lediglich Probanden mit hellem Haar, spärlicher oder fehlender Behaarung der Kopfhaut untersucht.

Tabelle 1: Zusammenstellung des Untersuchungskollektivs

Experiment

Anzahl (n)

weiblich

männlich

Alter

NIRS Mapping

5

1

4

27 - 45 Jahre

Simultane TCD-NIRS

13

9

4

22 - 45 Jahre

Alle Versuchspersonen waren über notwendige Details und Risiken der Methode informiert und stimmten der Untersuchung freiwillig zu. Die Untersuchung wurde von der Ethik-Kommission der Charité geprüft. Für die Teilnahme bekamen die Versuchspersonen eine Aufwandsentschädigung.

2.4.2. Überlegungen zur Wahl des Stimulationsparadigmas

Der motorische Kortex eignet sich aufgrund seiner Lage an der Oberfläche des parietalen Kortex und aufgrund seiner somatotopischen Gliederung gut zur selektiven Untersuchung funktioneller Aktivierung des Gehirns mithilfe der NIRS. Motorische Aktivierungsparadigma sind gut untersucht, die Durchführung ist einfach und läßt sich gut kontrollieren.

Die topographische und funktionelle Anatomie sensomotorischer Rindenfelder ist in Abb.6 a und b wiedergeben. Der sensomotorische Kortex erstreckt sich entlang des Sulcus centralis vom Sulcus lateralis bis medial in die Mantelkante hinein. Man unterscheidet den primär


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somatomotorischen Kortex (Brodmann Area 4), der sich unmittelbar rostral des Sulcus centralis im Gyrus präcentralis befindet und das somatosensible Kortexareal, das sich hinter dem Sulcus centralis im Gyrus postcentralis befindet. Primär motorische Areale, die einen Großteil der Pyramidenbahnzellen des ersten Motoneurons enthalten, bilden den Ursprungsort für Willkürbewegungen. Kortiko-kortikale Verbindungen bestehen zwischen dieser Region und prämotorischen Arealen im Frontallappen (Supplementär motorisches Areal und prämotorisches Areal, Brodmann Area 6), sowie zu somatosensiblen Rindenfeldern (Brodmann Area 1, 2, 3) im postzentralen Kortex.

Abb. 6: a) Schematische Darstellung der Lokalisation und funktionellen Organisation sensomotorischer Rinden-felder entlang des Sulcus centralis. b) Somatotopische Gliederung und Repräsentation von Bewegungsmustern im motorischen Kortex (Homunculus) (modifiziert nach KANDEL ET. AL. Hsg. 1991).


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Die somatotopische Organisation sensomotorischer Rindenfelder entlang des Sulcus centralis ist aus frühen elektrophysiologischen Untersuchungen bekannt (FRITSCH UND HITZIG 1870, LEYTON UND SHERRINGTON 1917, PENFIELD UND BOLDREY 1938). Die Lokalisation dieser Repräsentationsfelder von medial nach lateral ist im sog. Homunculus wiedergegeben. Das Handareal nimmt einen vergleichsweise großen Repräsetationsbereich relativ weit lateral der Mittellinie ein, Ellbogenbewegung findet sich weiter medial und Fußbewegung am weitesten medial im Bereich der Mantelkante. Als Standardaktivierungsparadigma wurde in der vorliegenden Untersuchung eine sequentielle Fingerbewegung gewählt. In der “Mapping“-studie sollte darüber hinaus mittels Finger-, Ellbogen- und Fußbewegung entsprechend der somatotopischen Gliederung eine selektive Aktivierung unterschiedlicher Kortexareale erreicht werden.

2.4.3. Lokalisation der Optoden

Die Lokalisation der Optodenpositionen erfolgte anhand äußerer topographischer Landmarken standardisiert über der C3 Position in Anlehnung an das internationale 10/20 EEG System (JASPERS 1958). Circa 2 cm rostral der C3 Position läßt sich ein maximales sensibles evoziertes Potential und ca. 1 cm frontal von C3 das motorisch evozierte Potential der Handregion ableiten. CT und MRT Studien zur kraniozerebralen Topographie zeigen eine relativ geringe interindividuelle Varianz des Verlaufs des Sulcus centralis mit Bezug zur Lokalisation der C3 Position auf der Vertex-präaurikularlinie (STEINMETZ ET. AL. 1989; HOMAN ET. AL. 1987).

2.4.4. Experimenteller Aufbau bei multilokulärer Erfassung funktioneller Aktivierung des Gehirns

2.4.4.1. Lokalisation und geometrische Anordnung der Optoden

Zur Erfassung der räumlichen Charakteristik von Veränderungen der Blutoxygenierung bei funktioneller Aktivierung wurden sequentiell Messungen an mehreren Meßpositionen über der linken Hemisphäre nach einem zuvor festgelegten Schema vorgenommen. Abbildung 7 veranschaulicht schematisch die Anordnung der Optodenpositionen. Die C3 Position diente aufgrund der notwendigen topographischen Orientierung als Fixpunkt für die gesamte Messanordnung. Alle Optoden wurden um möglichst vergleichbare Bedingungen bezüglich Eindringtiefe und Messvolumen zu erreichen in einem Abstand von 3,5 cm zwischen Sender und Empfängeroptode mithilfe von Kleberingen angebracht. Um den motorischen Kortex möglichst in seiner gesamten


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Ausdehnung von medial nach lateral zu erfassen, erfolgte die Positionierung der Optoden in vertikaler Richtung von lateral nach medial auf der Vertex-präaurikularlinie, mit einer Abweichung von ca. 15° in posteriorer Richtung, entsprechend dem Verlauf des Sulcus centralis. Aufgrund der technischen Gegebenheiten erfolgten die Messungen sequentiell in jeweils unterschiedlicher Reihenfolge. Um ein möglichst großes Messareal in einer vertretbaren Untersuchungszeit zu erfassen, wurde die Anzahl der Messpositionen auf 8 - 10 festgelegt.

Abb. 7: a) und b) schematische Darstellung der Anordnung der Optoden im Meßfeld. Die Numerierung der Messpositionen entspricht den Angaben im Ergebnisteil. Messposition 5 entspricht jeweils der topographischen Lage der C3 Position nach internationalem EEG 10/20 System. c) zeigt die Lokalisation des Messarrays über dem linken parietalen Kortex in einer Oberflächenrekonstruktion des 3D MRT.

2.4.4.2. Versuchablauf und Messprotokoll

Das Messprotokoll eines Stimulationszyklus bei multilokulärer Messung ist in Abbildung 8 dargestellt. Die Durchführung von Hand-, Ellbogen und Fußbewegung erfolgte in der kontralateralen Extremität, in der angegebenen Reihenfolge, mit einer Stimlationsdauer von jeweils 18 sec gefolgt von einer Pause von jeweils 36 sec. Die Messung an jeder Messposition beinhaltete jeweils 5 solcher Durchgänge.

Abb. 8: Schematische Darstellung des Stimulationsprotokolls bei multilokulärer NIRS Messung


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Nach Beendigung der Messung wurden die Optodenpositionen mit Vitamin E Kapseln markiert und im Anschluß die 3D hochauflösende MRT Untersuchung durchgeführt.

2.4.5. Experimenteller Aufbau bei simultanen TCD-NIRS Messung

Zur Untersuchung der zeitlichen Dynamik und des Zusammenhangs zwischen regionalen Änderungen der Blutoxygenierung und intrakraniellen hämodynamischen Änderungen wurden bei motorischer Stimulation simultane Messungen der Blutoxygenierung mithilfe der NIRS, sowie der Blutflußgeschwindigkeit mithilfe der TCD vorgenommen.

Die Messung der Oxygenierung-sparameter erfolgte wie zuvor beschrieben von der C3 Position des linken motorischen Kortex. Die kontinuierliche Ableitung der Blutflußgeschwindigkeit erfolgte von der dieses Gebiet versorgenden linken Arteria cerebri media (MCA). Abbildung 9 veranschaulicht den experimentellen Aufbau.

Abb. 9: Experimenteller Aufbau bei simultaner NIRS-TCD Messung. Die Ableitung der Veränderungen der Blutoxygenierung erfolgte über dem linken motorischen Kortex (C3 Position). Die simultane Messung von Veränderungen der Blutflußgeschwindigkeit (CBFV) erfolgte transtemporal von der dieses Gebiet versorgenden linken MCA.

2.4.5.1. Versuchsablauf und Messprotokoll

Da bei dieser Untersuchung die zeitlichen Dynamik, sowie der zeitliche Zusammenhang zwischen Blutflußgeschwindigkeitsänderungen und Veränderungen der Blutoxygenierung von besonderem Interesse war, wurde die sequentielle Fingerbewegung mit einer verlängerten Stimulationsdauer von 60 sec alternierend mit einer Ruhephase von 90 sec durchgeführt.


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Nach Anbringen der Optoden und der Dopplersonde führte der Proband nach Erreichen einer stabilen ‘Baseline’ die Fingerbewegung in der angegebenen zeitlichen Abfolge abwechselnd mit der kontralateralen (rechten) und der ipsilateralen Hand (linken Hand) durch. Der Versuchdurchgang beinhaltete jeweils 10 Zyklen für ipsi- und kontralaterale Fingerbewegungen.

Alle Untersuchungen wurde in einem abgedunkelten Raum durchgeführt Die Probanden lagen in entspannter, bequemer Position in Rückenlage auf einer Untersuchungsliege. Die Arme waren neben dem Körper gelagert. Die Probanden waren angewiesen, nicht zu sprechen und jede zusätzliche Bewegung zu vermeiden.

2.5. Datenauswertung und statistische Analyse

2.5.1. Analyse der multilokulären NIRS Messungen

Die Auswertung der Daten erfolgte bei der multilokulären Messung jeweils individuell getrennt für jeden Probanden. Zur Verbesserung des Signal-zu-Rausch-Verhältnisses wurde zunächst eine Signalmittelung zeitlich getriggert nach Beginn der Stimulation für jedes Stimulationsparadigma und jeweils getrennt nach Lokalisation durchgeführt. Mithilfe eines Mittelwertes der 10s - Periode unmittelbar vor Beginn der Stimulationsphase wurde eine Nullinienkorrektur durchgeführt. Für die graphische Darstellung wurden die Daten mithilfe eines gleitenden Mittelwertes über 2 Datenpunkte geglättet. Anhand dieser Auswertung erfolgte die graphische Darstellung des Zeitverlaufes entsprechend der Optodenlokalisation und getrennt für [oxy-Hb] und [deoxy-Hb].

Zur quantitativen Beschreibung der Veränderungen wurden Mittelwerte über die gesamte Stimulationsdauer für jeden Parameter errechnet. Mittels t-test für gepaarte Stichproben wurden diese Veränderungen, für jede Messposition getrennt auf statistische Signifikanz im Vergleich zur Ruhephase geprüft. Die Veränderungen galten als signifikant, bei einem Signifikanzniveau von <0,05 nach Bonferroni-Korrektur. Statistisch signifikante Veränderungen wurden als funktionelle Antwort gewertet und wurden auf ihre Lokalisation im Messareal, sowie die topographische Lokalisation auf der Kortexoberfläche hin untersucht.


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2.5.1.1. Topographisches Mapping und bildgebende Darstellung der Ergebnisse

Neben der Darstellung der Ergebnisse als Zeitverlaufskurven in den einzelnen Messpositionen, wurde zur besseren Beschreibung der räumlich-zeitlichen Charakteristik eine bildgebende Darstellung der Ergebnisse vorgenommen. Hierfür wurde eine lineare Interpolation über alle Optodenpositionen analog der Nachbarinterpolation im EEG vorgenommen (Duffy 1979, Buchsbaum et. al. 1982). Die graphische Darstellung der Oxygenierungsänderungen erfolgte dann anhand der errechneten Werte als Farbabstufungen in Form eines ‘Colormaps’. Dies erlaubte die Darstellung der räumlichen Charakteristik der Oxygenierungsantwort als Mittelwert über die gesamte Stimulationsdauer, sowie die Darstellung der räumlich-zeitlichen Dynamik zu einzelnen Zeitpunkten, als Sequenz über den Zeitverlauf der Stimulation. Die Darstellung der Veränderungen in Form eines ‘Colormaps’ erleichtert die Darstellung der Ergebnisse im topographischen Zusammenhang und erlaubt prinzipiell, mittels geeigneter Bildverarbeitungssoftware die Darstellung der Daten als Überlagerung mit topographischem Bezug im 3D MRT.

2.5.2. Analyse der simultanen TCD-NIRS Messungen

Aufgrund der unterschiedlichen zeitlichen Auflösung von TCD (sample rate circa 100 ms) und NIRS (sample rate 1 sec) erfolgte zunächst das Angleichen der TCD Daten auf eine sample rate von einem Meßwert pro Sekunde mittels linearer Interpolation. Anschließend wurde wie oben beschrieben die Mittelung der Daten sowie eine Nullinienkorrektur durchgeführt (s.o.). Die graphische Darstellung der Daten im Zeitverlauf erfolgte als Gesamtmittelung über alle Versuchspersonen getrennt für kontralaterale und ipsilaterale Fingerbewegung.

Entsprechend der zeitlichen Charakteristik der Veränderungen wurde die weitere statistische und quantitative Beschreibung der Daten in unterschiedlichen Zeitfenstern durchgeführt. Das Zeitfenster von 7-12 sec nach Stimulationsbeginn wurde als ‘initiale Phase’ definiert und dient der Beschreibung der Veränderungen unmittelbar nach Stimulationsbeginn. Das Zeitfenster 55-65 sec nach Beginn der Stimulation wurde als ‘späte Phase’ definiert und beschreibt Veränderungen im späteren Verlauf der Stimulation. Aufgrund der unterschiedlichen zeitlichen Dynamik von [oxy-Hb] und [deoxy-Hb] Veränderungen wurden diese Zeitfenster für die Berechnung der mittleren Veränderungen des [deoxy-Hb] jeweils eine Sekunde später gewählt (8-13 sec sowie 57-67 sec). Berechnet wurden jeweils Mittelwerte ± Standardabweichung. Die Veränderungen der Blut-


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flußgeschwindigkeit wurden zusätzlich als prozentuale Änderung angegeben. Hierzu wurde der Ruhemittelwert aus den Messungen aller Probanden ermittelt und gleich 100% gesetzt.

Der Vergleich zwischen ipsilateraler und kontralateraler Antwort wurde mithilfe eines t-Testes für gepaarte Stichproben durchgeführt. Unterschiede von p<0;05 wurden als signifikant und von p<0;01 als hochsignifikant gewertet.

2.5.2.1. Korrelationsanalyse über den Zeitverlauf

Zur Klärung der Frage; ob ein zeitlicher Zusammenhang zwischen Änderungen der Blutflußgeschwindigkeit und Veränderungen der regionalen Oxygenierungsparameter besteht; wurde eine Korrelationsanalyse für Zeitreihen über die gesamte Antwortdauer durchgeführt. Zur Charakterisierung des Zusammenhanges in Abhängigkeit von der Stimulationsdauer erfolgte die Zeitreihenkorrelation zusätzlich in verschiedenen Zeitfenstern. Diese Zeitfenster sind in Abb. 15 durch gebrochene Linien gekennzeichnet. Die unterschiedlichen Oxygenierungsparameter wurden jeweils mit den Änderungen des CBFV korreliert, und der Pearson Produktmoment-Korrelationskoeffizient r, sowie die Steigung der Regressionsgeraden bestimmt. Das Signifikanzniveau der Korrelation wurde mithilfe von Tabellen (DOCUMENTA GEIGY 1968) und unter Berücksichtigung des entsprechenden Freiheitsgrades, der sich aus der jeweiligen Länge der Zeitreihe ergab, bestimmt. Zur mathematischen Beschreibung des Zusammenhanges zwischen Blutflußgeschwindigkeitsänderung und Veränderungen der einzelnen Oxygenierungsparameter wurde eine Korrelationsanalyse mit Kurvenanpassung über die gesamte Antwortdauer durchgeführt.


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