Hummel, Heike: „Untersuchungen zum Postantibiotischen Effekt bei Pseudomonas aeruginosa-Isolaten einer Intensivstation“

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Kapitel 2. Material und Methoden

2.1 Bakterienstämme

Zur Testung des Postantibiotischen Effektes wurden 6 Pseudomonas aeruginosa-Stämme mit verschiedenen Resistenzmuster verwendet. Es handelte sich dabei um 5 Stämme, die aus den oberen Atemwegen von Patienten der Intensivstation des Carl-Thiem-Klinikums Cottbus stammten (Isolat-Nummern: 3, 17, 32, 623, 8536) und dem ATCC 27853-Stamm. Die MHK der Patientenstämme zeigt Unterschiede in der Sensibilität gegenüber den beiden getesteten Antibiotika. Der Stamm 623 zeigte sich kulturell als Rauhform.

Die Bakterienstämme wurden bei minus 21°C eingefroren und vor jedem Testansatz auf Mac Conkey Agar rekultiviert.

2.2 Nährmedien

Verwendet wurden Mac Conkey Agar (OXOID Artikel-Nummer: CM 115) und Müller Hinton Bouillon (MERCK Artikel-Nummer: 1.05396.0500).

Die Herstellung erfolgte entsprechend den Angaben der Hersteller.

2.3 Antibiotika

Es erfolgte die Testung mit Amikacin, Ceftazidim und Amikacin plus Ceftazidim in einmaliger Exposition und mehrmaliger Exposition.

Amikacin wurde von der Firma BRISTOL-MYERS SQUIBB und Ceftazidim von der Firma CASCAN verwendet.

Die Amikacin-Reinsubstanz wurde in sterilem Aqua dest. gelöst und auf eine Endkonzentration von 20 µg/ml nach Firmenvorschrift eingestellt.

Ceftazidim wurde unter Zugabe von Natrium-Carbonat in destilliertem Wasser gelöst und dabei auf eine Endkonzentration von 40 µg/ml laut Firmenvorschrift eingestellt.

Beide Konzentrationen entsprechen den Serumspiegelkonzentrationen (Baltch et al. 1996, Hostacka 1996, Sturm 1989).

Die Lagerung erfolgte bei minus 20°C, da Gupta et al. (1988) zeigen konnten, daß die Substanzen über 90 Tage bei Lagerungstemperaturen von minus 20°C stabil blieben .


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2.4 MHK-Bestimmung

Die minimale Hemmkonzentration (MHK) ist die niedrigste Konzentration eines Wirkstoffes (angegeben in µg/ml bzw. mg/l), bei der unter definierten invitro-Bedingungen die Vermehrung von Bakterien innerhalb einer festgelegten Zeitspanne verhindert wird.

Als Vorversuch erfolgte die MHK-Bestimmung mit der Bouillondilutionsmethode bei allen eingesetzten Teststämmen nach DIN 58940. Hierfür wurden Mikrotiterplatten verwendet, die im Institut für Mikrobiologie und Hygiene des Universitätsklinikum der Charité hergestellt wurden.

Von einer 18 h alten Agarkultur (Mac Conkey) der Pseudomonas-Stämme wurde eine Verdünnung in physiologischer Kochsalzlösung hergestellt (McFarland 0,5 mittels Densitometer bestimmt), die einer Koloniezahl von 1x105 bis 1x106 vermehrungsfähigen Keimen je ml entsprach. In jede Kavität, die mit einem definiertem Wirkstoffgehalt der Antibiotikastammlösung (siehe Tabelle 1) bestückt war, wurden 10 µl pro Kavität der Bakterienkultur pipettiert. Danach wurden die Platten 18 h bei 37 °C bebrütet. Zur Auswertung wurde ein makroskopisch sichtbares Wachstum des Inokulums registriert. Zur Beurteilung sind die MHK-Werte den nach DIN 58940 Teil 4 festgelegten Bewertungsstufen „sensibel“, „intermediär“ und „resistent“ zugeordnet worden.

Tabelle 1: Pipettierschema zur MHK-Bestimmung auf einer Mikrotiterplatte mit folgenden Antibiotikakonzentrationen (in mg/l)


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2.5 MBK-Bestimmung von Amikacin

Die minimale bakterizide Konzentration (MBK) ist die niedrigste Konzentration eines Wirkstoffes (angegeben in µg/ml bzw. mg/l), die unter in vitro-Bedingungen ein definiertes Inokulum von Bakterien innerhalb einer festgelegten Zeitspanne um > 99,9 % abtötet.

Von einer 18 h alten Bouillonkultur der stationären Wachstumsphase wurde eine Verdünnung in Müller-Hinton-Bouillon hergestellt, die einer Koloniezahl von 1x106 bis 1x107 vermehrungsfähigen Keimen je ml entspach. Parallel wurde eine Verdünnungsreihe mit einer Amikacin-Stammlösung hergestellt mit je 1 ml Volumen pro Röhrchen. Folgende Endkonzentrationen an Amikacin wurden pro Röhrchen eingegeben: 8, 10, 16, 20, 32, 40, und 80 µg/ml. Jedem Röhrchen wurden 1 ml des Inokulum (Bakterienkultur) zugefügt. Danach wurden die Teströhrchen 18 h bei 37 °C bebrütet und anschließend die Röhrchen ohne Trübung auf Nährböden (Mac Conkey) in einer logarithmischen Verdünnungsreihe überimpft, um eventuell Wachstum, das keine Trübung mehr hervorruft, zu erkennen. Eine Wachstumskontrolle lief parallel ohne Amikacinzusatz.

2.6 Bakterizidiekurven

Die bakterizide Wirkung kann auch in Form von Zeit-Abtötungskurven dargestellt werden. Dabei wird das Inokulum mit dem antibakteriellen Wirkstoff inkubiert und nach festgelegten Zeitintervallen hiervon Teilmengen auf die Anzahl lebender Zellen untersucht.

Von den oben erwähnten 6 Stämmen wurde ein Inokulum von 106 bis 107 in physiologischer Kochsalzlösung mittels Densitometer hergestellt (McFarland 0,5). Die genaue Bestimmung erfolgte retrospektiv über eine Verdünnungsreihe (geometrische Schritte 1:10 verdünnt), von der jeweils 100 µl auf antibiotikafreien Agarplatten (Mac Conkey) ausgestrichen wurden.

Die Röhrchen mit einem Gesamtvolumen von 5 ml (0,5 ml Antibiotikastammlösung und 4,5 ml Keimsuspension) wurden bei 37°C für 10 Stunden bebrütet. Als Antibiotikakonzentration wurden die MHK der Teststämme und die Serumspiegelkonzentration beider Antibiotika als Endkonzentration eingesetzt. Die Ansätze liefen jeweils als alleinige Zugabe von Amikacin und Ceftazidim und als Kombination beider. Alle 1 bis 2 Stunden wurden je 100 µl entnommen, in 1:10 Schritten verdünnt und auf antibiotikafreien Agarplatten ausgestrichen. Es wurde eine Wachstumskontrolle ohne Antibiotikalösung unter gleichen Bedingungen mitgetestet. Nach 18stündiger Inkubation wurden die Kolonien gezählt und in halblogarithmischen Diagrammen die KBE/ml (Koloniebildende Einheiten) gegen die Zeit aufgetragen.

2.7 Fotographische Darstellung

Die Bakterien wurden bei einer 100fachen Vergrößerung mittels eines „Nikon“-Mikroskop fotografiert (Film APX100). Zusätzlich sind Bilder im Elektronenmikroskop (TESLA, BP 5000) entwickelt worden. Dazu wurden aus einer Keimbouillon (Müller-Hinton), die mit dem entsprechenden Antibiotikum und dem ATCC-27835 Stamm über 2 Stunden inkubiert war,


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2 µl auf ein Kohlefilm beschichtetes Kupfernetz aufgebracht. Danach erfolgte eine 3malige Waschprozedur mit Aqua dest. und anschließend die Kontrastierung mit 2%igen Uranylacetat. Nachfolgend konnten die Netze im Elektronenmikroskop betrachtet werden. Fotografiert wurde mittels einfachen Fotoplatten, welche ein Fotolabor entwickelte .

Außerdem erfolgte eine Darstellung einer inkubierten Bakteriensuspension mit Amikacin durch die Firma LEICA mittels Rasterelektronenmikroskopie.

2.8 Bestimmung des Postantibiotischen Effektes

Von einer Agarplatte wurden 3-5 Kolonien in 60 ml Müller-Hinton-Bouillon überimpft und für 20 Stunden bei 37°C bebrütet (stationäre Phase). Daraus wurden 6 ml Flüssigkultur in vorgewärmte Müller-Hinton-Bouillon überführt und für 3 Stunden bei 37°C auf einem Magnetrührer in die logarithmische Wachstumsphase gebracht.

Für die PAE-Bestimmung wurde ein Inokulum von 106-107 KBE/ml benötigt. Diese Keimkonzentration wurde aus der zuletzt beimpften Bouillon gewonnen mittels McFarland-Bestimmung über ein Densitometer und Kontrolle dessen über eine Lebend-Keimzahlbestimmung mittels Verdünnungsreihe.

Es liefen pro Ansatz 2 Testreihen und eine Wachstumskontrolle.

In den Teströhrchen befanden sich bei der Ceftazidimtestung 4,5 ml Pseudomonas aeruginosa-Flüssigkultur mit dem definierten Inokulum (Mac Farland 0,5) plus 0,5 ml Ceftazidim 40 µg/ml, bei der Amikacintestung 4,5 ml Flüssigkultur plus 0,5 ml Amikacin 20 µg/ml und bei der Kombinationstestung 4,0 ml Pseudomonas aeruginosa-Flüssigkultur plus 0,5 ml Amikacin 20 µg/ml plus 0,5ml Ceftazidim 40 µg/ml.

In der Wachstumskontrolle waren bei jeder Testung stets 5,0 ml Flüssigkultur von Pseudomonas aeruginosa (Mac Farland 0,5) ohne Antibiotikazusätze.

Die Expositionszeit betrug immer 2 Stunden bei 37°C auf einem Rüttler.

Vor Testbeginn wurde aus allen Ansatzröhrchen das Inokulum retrospektiv durch Ermittlung der Lebend-Keimzahl bestimmt. Die Keimzählung erfolgte durch Herstellung einer dekadischen Verdünnungsreihe und nachfolgendem Spatelverfahren (100 µl pro Agarplatte), die Auswertung aus den 3 mittleren Verdünnungsstufen, wobei das arithmetische Mittel gebildet wurde.

Nach den 2 Stunden Exposition wurde die Keimzahl bestimmt (siehe oben). Danach wurden die Röhrchen 10 min bei 3000 g und 37°C zentrifugiert, und der Überstand bis auf 1 ml entfernt. Diese 1 ml wurden in 9 ml frischer Müller-Hinton-Bouillon resuspendiert mit nachfolgender Zentrifugation und Resuspendierung von 0,5 ml Aliquot in 4,5 ml frischer Müller-Hinton-Bouillon. Diese Waschprozedur fand zweimal statt. Der frische Ansatz wurde für 8-10 Stunden bei 37°C bebrütet und alle 1-2 Stunden eine Verdünnungsreihe zur Keimzahlbestimmung angelegt. Aus dieser Verdünnungsreihe wurden jeweils 100 µl auf Agarplatten ausgespatelt, für 18 Stunden bei 37°C bebrütet und nachfolgend ausgezählt.

Gleichzeitig erfolgte die Überprüfung auf antibakterielle Hemmstoffe, das heißt eine Testung dahingehend ob sich noch Reste von Antibiotika in der Testlösung befinden. Methodisch vorgegangen wurde nach DIN 58958 Teil 1.

Zur Auswertung wurde die Keimzahl KBE/ml logarithmisch gegen die Zeit in einem Diagramm aufgetragen. Aus diesem ließ sich dann der Postantibiotische Effekt bestimmen. Der PAE wurde durch Vergleich der Wachstumskurven von der Testung mit Antibiotikum


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und der Negativkontrolle ohne Antibiotika-Exposition ermittelt. Der PAE wird in Stunden und Minuten angegeben.

Die Bestimmung des Postantibiotischen Effektes wurde in 3 bis 10 Parallelansätzen bestimmt.

Die Untersuchungen zum Postantibiotischen Effekt wurden in einer einmaligen Exposition (siehe Abbildung 1) und in einer dreimaligen Exposition (siehe Abbildung 2) durchgeführt. Dabei wurde die Antibiotikaexposition nach 8-10 Stunden und nach weiteren 8-10 Stunden wiederholt. Jede einzelne Expositionsphase zeigte den gleichen methodischen Ablauf wie oben beschrieben.


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Abb. 1: Grafische Darstellung zur Ermittlung des PAE bei einmaliger Exposition (Prinzip)

Abb. 2: Ablauf der PAE-Bestimmung bei Mehrfach-Exposition (Prinzip)


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2.8.1 Statistische Berechnung

    Berechnet wurde die Standardabweichung ausgehend von einer Stichprobe . Die Standardabwei-chung ist ein Maß dafür, wie weit die jeweiligen Werte um den Mittelwert streuen.

Die Stichprobenstandardabweichung (STABW) verwendet folgende Formel:

x = Einzelmeßwert

n = Anzahl der Meßwerte

2.8.2 Quantifizierung des Postantibiotischen Effektes

Unter dem Postantibiotischen Effekt versteht man die Hemmung einer erneuten Keimvermehrung in Stunden nach kurzfristiger Antibiotikaexposition bei einem mehrfachen der MHK (siehe Abbildung 1 und 2).

Die Dauer des Postantibiotischen Effektes wurde errechnet nach der Gleichung:

PAE = 1 log10 Test - 1 log10 Wachstumskontrolle

PAE = T - C (in Stunden)

wobei 1 log10 Test die Zeit darstellt, die die vorexponierten Keime benötigen, um sich zu verzehnfachen; 1 log10 Wachstumskontrolle ist die Verzehnfachungszeit der scheinexponierten Kontrollorganismen (Gerber et al. 1982).


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Thu Sep 14 10:58:29 2000