Hummel, Heike: „Untersuchungen zum Postantibiotischen Effekt bei Pseudomonas aeruginosa-Isolaten einer Intensivstation“

15

Kapitel 3. Ergebnisse

3.1 MHK der Teststämme

Die Werte der MHK-Bestimmungen sind in Tabelle 2 aufgeführt und stellen Mittelwerte von Untersuchungsabläufen dar.

Die Patientenstämme zeigten eine unterschiedliche antimikrobielle Empfindlichkeit. Stamm 623 und 8536 sind relativ sensible Isolate. Stamm 3 und 17 zeigen eine geringe Empfindlichkeit gegenüber den getesteten Antibiotika.

Die höchste Resistenz zeigte Stamm 32 mit sieben Antibiotika. Nur Ceftazidim war sensibel (siehe Tabelle 2 und 3).

Solche Resistenzmuster sind oft bei Pseudomonas aeruginosa- Isolaten einer Intensivstation zu finden.

Tabelle 2: MHK von 8 Antibiotika gegen sechs Stämme von Pseudomonas aeruginosa (Angaben in µg/ml)

 

Pseudomonas aeruginosa-Stämme

Antibiotikum

ATCC 27853

623

8536

3

17

32

Ciprofloxacin

<0,25

<0,25

<0,25

0,5

<0,25

0,5

Gentamycin

1

1

1

4

2

>8

Tobramycin

<0,5

<0,5

<0,5

0,5

<0,5

4

Amikacin

2

<2

2

4

2

32

Piperacillin

4

2

4

16

8

64

Cefotaxim

4

4

16

16

>16

>16

Ceftazidim

1

<0,25

2

2

2

4

Mezlocillin

16

16

32

>32

>32

>32


16

Tabelle 3: MHK-Bewertung für Amikacin und Ceftazidim

Stamm

Amikacin

Ceftazidim

ATCC 27853

sensibel

sensibel

623

sensibel

sensibel

17

sensibel

sensibel

3

sensibel

sensibel

8536

sensibel

sensibel

32

resistent

sensibel (letzte Stufe)

3.2 Minimale Bakterizide Konzentration (MBK) gegen Amikacin

Die Bestimmung der MBK für Amikacin ist in Tabelle 4 dargestellt. Die Ergebnisse sind aus 3 Parallelbestimmungen hervorgegangen. Ermittlung nach der beschriebenen Methode unter Punkt 2.5 .

Die höchste Resistenz zeigte Stamm 32, die niedrigste die Stämme 17 und 8536.

Tabelle 4: MBK von Amikacin gegen die sechs Teststämme

k.M. = kein Meßwert


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Zusammengefaßt ergeben sich hieraus folgende MBK-Werte gegen Amikacin:

Stamm ATCC

40 µg/ml

Stamm 623

32 µg/ml

Stamm 17

20 µg/ml

Stamm 3

40 µg/ml

Stamm 8536

20 µg/ml

Stamm 32

80 µg/ml


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3.3 Bakterizidiekurven

Die Bakterizidiekurven (Methodenbeschreibung siehe unter Gliederungspunkt 2.6) zeigen die geringe Wirksamkeit der Antibiotika in MHK-Größen auf die Bakterien.

Aus den Kurvenverläufen (Abb. 3 bis Abb. 14), welche sich an dieses Kapitel anschließen, ist erkennbar, daß die effektivste Wirkung auf die Bakterien nur durch den Einsatz der Serumspiegelkonzentration zu verzeichnen ist.

Der Stamm 32 ist gegenüber Amikacin resistent, aber mit der Konzentration von 20 µg/ml ist eine bakterizide Wirkung sichtbar (Abb.13).

Bei der Kombination beider Antibiotika ist eine deutliche Verstärkung der antibakteriellen Wirksamkeit zu erkennen.

Hinweis zu den Grafiken: die Minimalem Hemmkonzentrationen der einzelnen Teststämme sind der Tabelle 2 zu entnehmen. Die Serumspiegelkonzentration von Amikacin entsprach 20 µg/ml und die von Ceftazidim 40 µg/ml.


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Abb. 3: Bakterizidiekurven vom Stamm 623 mit Serumspiegelkonzentration der Antibiotika


20

Abb. 4: Bakterizidiekurven vom Stamm 623 mit MHK der Antibiotika


21

Abb. 5: Bakterizidiekurven von Stamm 17 mit MHK der Antibiotika


22

Abb. 6: Bakterizidiekurven vom Stamm 17 mit Serumspiegelkonzentration der Antiobiotika


23

Abb. 7: Bakterizidiekurven vom Stamm 3 mit MHK der Antibiotika


24

Abb. 8: Bakterizidiekurven vom Stamm 3 mit Serumspiegelkonzentration der Antibiotika


25

Abb. 9: Bakterizidiekurven von Stamm 8536 mit MHK der Antibiotika


26

Abb. 10: Bakterizidiekurven von Stamm 8536 mit Serumspiegelkonzentration der Antibiotika


27

Abb. 11: Bakterizidiekurven vom Stamm ATCC 27853 mit MHK der Antibiotika


28

Abb. 12: Bakterizidiekurven vom Stamm ATCC mit Serumspiegelkonzentration der Antibiotika


29

Abb. 13: Bakterizidiekurven vom Stamm 32 mit Serumspiegelkonzentration der Antibiotika


30

Abb. 14: Bakterizidiekurven vom Stamm 32 mit MHK der Antibiotika


31

3.4 Postantibiotischer Effekt mit einmaliger Exposition von Amikacin,
Ceftazidim und die Kombination beider Antibiotika

3.4.1 PAE bei Amikacin

Alle 5 Patientenstämme und der ATCC-Stamm wurden bezüglich des PAE gegenüber Amikacin geprüft bei einer Konzentration von 20 µg/ml.

Die Testung erfolgte 10 mal (Stamm 32: 6 mal), um die Reproduzierbarkeit zu überprüfen und statistische Werte erheben zu können. Das Inokulum schwankte zwischen 0,5x107 bis 3,75x107 KBE/ml. Die Expositionszeit des Antibiotikums betrug 2 Stunden. Die Wirksamkeit von Amikacin über diese Zeit spiegelt sich in einer Verringerung der Keimkonzentration um 3-4 Zehnerpotenzen (lg10 KBE/ml) wieder. Das Wachstum der Bakterien nach Amikacin-Kontakt wurde über 10 Stunden registriert.

Der Stamm 8536 besitzt einen durchschnittlichen Postantibiotischen Effekt von 1,6 Stunden bei einem Inokulum von 1,9x107 KBE/ml (Mittelwert).

Der Stamm 623 besitzt einen durchschnittlichen Postantibiotischen Effekt von 2,3 Stunden bei einem mittleren Inokulum von 1,57x107 KBE/ml. Beide Stämme gelten als relativ sensibel in der MHK-Bestimmung und zeigen trotzdem Unterschiede beim Postantibiotischen Effekt von 0,7 h.

Stamm 3 und 17 mit ähnlichem Resistenzmuster in der MHK-Bestimmung zeigen eine Differenz im Postantibiotischen Effekt von 0,6 h.

Der Stamm 32 besitzt gegenüber Amikacin keinen PAE bis negativen PAE.

Die Standardabweichung bei allen Testabläufen lag zwischen 0,13 und 0,78 h.


32

Tabelle 5: Bestimmung des PAE in Gegenwart von Amikacin (20 µg/ml) bei den Teststämmen


33

3.4.2 PAE bei Ceftazidim

Bei allen 6 Stämmen wurde der Postantibiotische Effekt gegenüber Ceftazidim getestet in sieben bis zehn Parallelansätzen.

Das Inokulum schwankte zwischen 0,5x107 und 5,0x107 KBE/ml. Die Expositionszeit betrug 2 Stunden mit nachfolgender Überprüfung des Keimwachstums über 10 Stunden.

40 µg/ml Ceftazidim mit 2h Wirkzeit auf die Bakterien erbrachten nur eine Reduzierung der Keimzahl um eine Zehnerpotenz (lg10 KBE/ml) bei allen Teststämmen.

Die ermittelten Postantibiotischen Effekte zeigten Differenzen zwischen den einzelnen Stämmen (siehe Tabelle 6). Beim ATCC 27853 ergab sich ein PAE mit 2,78 h. Bei den Stämmen 8536 und 623 lagen die ermittelten Werte für den PAE bei 2,3 und 2,4 Stunden. Bei Stamm 17 wurde ein negativer PAE beobachtet (siehe Tabelle 6).


34

Tabelle 6: Bestimmung des PAE in Gegenwart von Ceftazidim (40 µg/ml) bei den Teststämmen


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3.4.3 PAE bei Ceftazidim plus Amikacin

Die Kombination eines Beta-Laktamantibiotikums mit einem Aminoglykosid zeigt synergistische Wirkung (Dalhoff 1990).

Der PAE wurde bei den Stämmen 3, 623, 32 und dem ATCC 27853 getestet. Es wurde nur mit diesen Stämmen weiter gearbeitet, um Extreme darzustellen, das heißt extrem sensibel und resistente Stämme. Die Testreihen wurden jeweils 4mal wiederholt.

Die Kombination beider Antibiotika führte bei allen getesteten Stämmen zu einer Verlängerung des Postantibiotischen Effektes gegenüber der Einzelexposition der Antibiotika. Der ATCC- und der sensible Stamm 623 zeigten dabei fast eine Verdopplung des PAE bei Amikacin (siehe Tabelle 7). Der resistente Stamm 32 besitzt bei Einzelexposition von Amikacin oder Ceftazidim nur einen kurzandauernden PAE. Die Kombination beider Substanzen zeigt in allen Fällen einen positiven Postantibiotischen Effekt der getesteten antimikrobiellen Substanzen.

Tabelle 7: PAE der getesteten Stämme für Amikacin, Ceftazidim und die Kombination der beiden Antibiotika (Angaben in Stunden)

 

Stamm

32

Stamm

623

ATCC

27853

Stamm

3

Antibiotikum

PAE in Stunden

Amikacin

-0,8

2,3

2,15

2,0

Ceftazidim

0,5

2,4

2,78

0,14

Kombination

2,75

5,37

5,12

2,43


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Tabelle 8: Postantibiotischer Effekt bei der Kombination von Amikacin und Ceftazidim


37

3.5 Postantibiotischer Effekt mit dreimaliger Exposition von
Amikacin, Ceftazidim und der Kombination beider Antibiotika

3.5.1 PAE bei Amikacin

Für die Untersuchung des Postantibiotischen Effektes bei mehrmaliger Zugabe der antimikrobiellen Substanzen wurden die Stämme 3, 32 und der ATCC 27853 genommen.

Die Experimente wurden in drei bis vier Parallelansätzen durchgeführt.

Das Inokulum vor der 1. Exposition bei allen drei Stämmen lag zwischen 0,8x107 bis 9,5x107 KBE/ml. Die Verringerung der Keimzahl während der ersten Exposition bei Stamm 3 und dem ATCC lag zwischen 2-4 Zehnerpotenzen (lg10 KBE/ml), bei Stamm 32 war keine bis eine ganz geringe Verringerung der Keimeinsaat zu verzeichnen.

Die 2. Exposition mit Amikacin erfolgte 8-10 Stunden nach der ersten. Die Bakterien waren zu diesem Zeitpunkt fast auf das Ausgangsinokulum angewachsen. Die Wirkung von Amikacin zeigte nach der 2. Exposition bei Stamm 3 eine Verringerung der Bakterienzahl um 1-2 Zehnerpotenzen (lg10 KBE/ml). Nach der 3. Exposition, die 8-12 Stunden später erfolgte, war das Inokulum nach 2 Stunden Einwirkung von Amikacin gleichgeblieben oder verringerte sich um maximal eine Zehnerpotenz. Der PAE bei Stamm 3 zeigte kaum Veränderungen über die drei Expositionszeiten, er bleibt fast konstant (0,71-0,97 Stunden).

Beim ATCC 27853 war die Verringerung des Inokulums bei der 1. und 2. Exposition gleich, um 3-4 Zehnerpotenzen (lg10 KBE/ml). Nach der 3. Exposition zeigte sich eine verringerte bis keine Wirkung auf den Stamm. Der Postantibiotische Effekt zeigte nach der 2. Exposition eine Verlängerung, nach der 3. Exposition eine Verkürzung gegenüber der 2. Exposition.

Der gegenüber Amikacin resistente Stamm 32 ließ über die drei Inkubationszeiten keine Verringerung der Keimzahl erkennen. Der PAE war nach der 1. und 2. Exposition kurz und gleichbleibend, aber nach der 3. Exposition zeigte sich eine deutliche Verlängerung von 0,87 auf 2,33 Stunden.


38

Tabelle 9: PAE von Pseudomonas aeruginosa mit Amikacin (20µg/ml) nach dreimaliger Exposition


39

3.5.2 PAE bei Ceftazidim

Die Testung von Ceftazidim in einmaliger Exposition (ersten Testungen) ergaben für Stamm 3 und 32 einen kurzdauernden Postantibiotischen Effekt bei einem Inokulum von 1,0-2,8x107 KBE/ml.

Bei Beginn (1.Exposition) des Testablaufes zur mehrmaligen Zugabe von Ceftazidim zeigte der Stamm 32 mit einem Inokulum von 7,0x106 KBE/ml einen PAE von 2,8 h.

Die ersten Versuche mit dem ATCC-Stamm und Ceftazidim ließen einen PAE von 2,8 Stunden erkennen, bei der dreimaligen Exposition war zu Beginn ein PAE von 1,5 Stunden zu verzeichnen bei fast gleichem Inokulum.

Das Antibiotikum wurde zur 2. Exposition 7-8 h nach der 1. Exposition auf die Bouillonkultur gegeben, und zur 3. Exposition 8-9 h nach der 2. Exposition.

Ceftazidim brachte während jeder Inkubation bei allen 3 Isolaten eine Senkung des Inokulums um 2 Zehnerpotenzen (lg10 KBE/ml). Die Empfindlichkeit der Stämme gegenüber Ceftazidim veränderte sich über die 3 Expositionszeiten in Folge kaum.

Der Postantibiotische Effekt von Stamm 3 verlängerte sich von 0,38 h auf 1,2 h.

Beim Stamm 32 zeigt sich eine geringer Abfall des PAE von 2,8 h auf 2,0 h.

Der ATCC 27853-Stamm ließ eine Verlängerung des PAE von 1,5 h über 2,2 h bis zu 2,5 h in der 3. Exposition erkennen.


40

Tabelle 10: PAE von Ceftazidim 40 µg/ml in dreimaliger Exposition bei den Teststämmen


41

3.5.3 PAE bei Ceftazidim plus Amikacin

Bei der Untersuchung des PAE über eine dreimalige Exposition der Bakterienkultur ergaben sich differente Werte unter den 3 getesteten Stämmen.

Das Ausgangsinokulum für alle drei Stämme lag zwischen 1,4 und 6,5x107 KBE/ml. Jeder Stamm wurde dreimal getestet. Die Keimzahl nach der 1. Exposition verringerte sich um 2-5 Zehnerpotenzen (lg10 KBE/ml). Nach der 2. Exposition der Bakterienkultur mit der Antibiotikakombination war die Keimzahl ebenfalls um 2-4 Zehnerpotenzen abgesunken.

Der PAE verkürzte sich bei allen drei Stämmen.

Stamm 3 zeigte nach der 3. Inkubationsphase eine deutliche Verlängerung des PAE um 2,3 h.

Der Stamm 32 ließ ebenfalls nach der 3. Exposition eine Verlängerung des PAE erkennen.


42

Tabelle 11: Testung Ceftazidim 40 µg/ml plus Amikacin 20 µg/ml in dreimaliger Exposition


43

3.5.4 Fotographische Darstellung der Bakterienzellen

Bei den Beta-Lactamantibiotika führt der Eingriff in die Peptidoglykansynthese zu Sphäroplasten- oder Filamentbildung (Munckhof et al. 1997). So führt die Bindung an das Penicillinbindende Protein 3 (PBP) zur Filamentbildung während die Bindung an PBP 2 Sphäroblastenbildung zur Folge hat.

Erkennbar sind bei den mit Amikacin und/oder Ceftazidim inkubierten Bakterienzellen von Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) eine nicht scharf abgrenzbare periphere Zellwand sowie Zerstörungen in der Zellwand. Außerdem ist die Filamentbildung unter Einwirkung von Ceftazidim sehr gut nachvollziehbar gewesen.


44

Abb. 15: oben: Negativkontrolle mit Elektronenmikroskop 24.000fach vergrößert, Bakterienzelle in Teilungsphase
Mitte: Negativkontrolle 32.000fach vergrößert, Bakterienzelle mit scharf abgrenzbarer Zellwand
unten: Negativkontrolle bei 100facher Vergrößerung


45

Abb. 16: oben: Bakterienzelle mit Amikacin inkubiert, 32.000fach vergrößert, unscharfe Konturen im Zytoplasma
unten: Bakterienzelle mit Amikacin inkubiert, 100fach vergrößert


46

Abb. 17: Bakterienzelle mit Ceftazidim inkubiert, 32.000fach vergrößert Darstellung einer polaren Bewegungsgeißel


47

Abb. 18: oben: Bakterienzellen mit Ceftazidim inkubiert, 8.000fach vergrößert, Filamentstruktur
unten: Bakterienzellen mit Ceftazidim inkubiert, 100fach vergrößert, Filamentstruktur


48

Abb. 19: oben: Bakterienzelle inkubiert mit Amikacin + Ceftazidim, 100.000fach vergrößert
unten: Bakterienzellen inkubiert mit Amikacin + Ceftazidim, 100fach vergrößert


49

Abb. 20: Bakterienzelle inkubiert mit Amikacin + Ceftazidim, 44.000fach vergrößert. Darstellung von polaren Geißeln, unscharfe Zellwand erkennbar


50

Abb. 21: Bakterienzellen mit Amikacin inkubiert, Lyse der Zellen erkennbar, Rasterelektronenmikroskopie


51

Abb. 22: Bakterienzellen mit Amikacin inkubiert, zerstörte Zellwand erkennbar, Lyse der Zellen, Rasterelektronenmikroskopie


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