Hummel, Heike: „Untersuchungen zum Postantibiotischen Effekt bei Pseudomonas aeruginosa-Isolaten einer Intensivstation“

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Kapitel 4. Diskussion

4.1 Methoden der PAE-Bestimmung

Verschiedene Methoden der PAE-Bestimmung variieren in ihren Ergebnissen (Adam 1989). So beträgt der PAE bei Pseudomonas aeruginosa mit Imipenem nach der Zell-Zähl-Methode 1,5-2,5 Stunden und nach der Bioluminescence-Methode (ATP-Messung) > 4 Stunden (Gupta et al. 1988). Die ATP- Messung bringt längere PAE hervor als die Zell-Zähl-Methode. Sie beinhaltet die Messung von Zellmasse, lebender und toter. Genauer formuliert bestimmt man die metabolische Aktivität der lebenden Zellen.

Nach Odenholt 1989 ist die direkte Messung der Zahl der überlebenden und erneut wachsenden Bakterien in der Kultur nach Antibiotikaentfernung die der Realität am nächsten kommende Methode zur Ermittlung des PAE.

Wir haben uns deshalb für diese Methode entschieden. Der experimentelle Ablauf gestaltete sich nach Protokollen von B. J. Mc. Grath (1993), W. A. Graig (1991) und C. I. Bustamante (1984).

Auch die Art des eingesetzten Medium spielt eine Rolle. Gudmundsson, Vogelmann et al. (1994) untersuchten den pH-Einfluß auf die Dauer des PAE. Sie erkannten, daß der pH einen signifikanten Einfluß auf den PAE ausübt. Optimal stellt sich ein pH-Wert von 7,4 dar, was dem pH-Wert im Serum entspricht (Ronald et al. 1997). Dieser kann aber in vivo variieren, z.B. in Abszessen. Ein saurer pH-Wert reduziert die Dauer des PAE bei Aminoglykosiden (Gerber 1993, Craig et al. 1991).

4.2 Inokulum-Effekt, Wirkung auf die Bakterizidie

Odenholt et al. (1989) demonstrierten einen PAE von Imipenem bei Pseudomonas aeruginosa von 1-2 Stunden mit der Zell-Zähl-Methode bei einem eingesetzten Inokulum von 106 KBE/ml. Bei einem Inokulum von 108 KBE/ml war kein PAE zu beobachten. Auch Gerber (1993) bestätigte den Einfluß der Größe des Inokulums auf den PAE.

Eine Ceftazidim-Konzentration von 2,5 µg/ml reduziert die Zahl der lebensfähigen Organismen bei einem Ausgangsinokulum von 105-106 KBE/ml um 1,5 Zehnerpotenzen erst nach 4,5 Stunden. Mit einer höheren Ceftazidim-Konzentration von 10 µg/ml wird die Zahl der lebensfähigen Bakterien innerhalb von 5 Stunden um mehr als 99 % reduziert (Harper 1991). Um eine hohe bakterizide Wirkung auf die Bakterien zu erzielen wurde bei den Testabläufen die Serumspiegelkonzentration (Ceftazidim 40 µg/ml, Amikacin 20 µg/ml) gewählt mit einer Expositionszeit von 2 Stunden.


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Die bakterizide Wirkung läßt sich auch morphologisch darstellen.

Bei den Beta-Laktamantibiotika führt der Eingriff in die Peptidoglykansynthese zur Sphäroblasten- oder Filamentbildung. Dies kann mit der Bindung an unterschiedliche Enzyme korreliert werden. So führt die Bindung an das PBP 3 zur Filamentbildung, während die Bindung an PBP 2 zu Sphäroblasten führt (Laverdiere et al. 1994). Hanberger et al. (1991) zeigten eine Konzentrationsabhängige Morphe von Escherichia coli, daß heißt bei Einsatz von Ceftazidim in Konzentration der MHK entsprechend ist eine Filamentbildung und in Serumspiegelgrößen eine Sphäroblastenbildung erkennbar. Gottfredsson et al. (1998) zeigten in Studien, daß 90 min nach Entfernung von Beta-Lactamantibiotika aus einer Bakterienkultur die Bakterienzellen ihre normale Form wieder erlangten.

Bei unseren eigenen Untersuchungen ist bei Einsatz von 40 µg/ml Ceftazidim auf alle Pseudomonas-Stämme eine Filamentbildung erkennbar.

Amikacin-Wirkungen lassen sich an der Lyse der Zellen erkennen.

Ein pharmakodynamischer Parameter um die antibakterielle Aktivität zu charakterisieren in vitro sind die Zeit-Abtötungskurven. Sie demonstrieren den zeitlichen Ablauf der bakteriziden Aktivität. Dabei korreliert eine excessiv rasche Abtötung mit einer hohen Antibiotikakonzentration.

Der Serumbakterizidie-Test dient zur Aktivitätsmessung von Antibiotika während der Therapie. Die Serumbakterizidie wird beeinflußt durch die Serumkonzentration der Antibiotika und die Empfindlichkeit des Erregers.

Wallrauch-Schwarz, Milatovic et al. (1993) zeigten in Studien, daß schon in der 1-g- Dosierung von Ceftazidim hohe Serumbakterizidie-Titer gegenüber Enterobakterien erreicht werden. Es ist somit eine gute therapeutische Wirksamkeit schon mit der 3x1-g-Dosierung erzielbar. Braveny et al. (1986) zeigten im Serumbakterizidie-Test, daß die abtötende Wirkung der Kombination Ceftazidim/Tobramycin stärker war als die der jeweiligen Einzelsubstanzen .

Die minimalen bakteriziden Konzentrationen liegen bei Antibiotika mit bakteriziden Wirkungstyp im allgemeinen nur um das Zweifache über der minimalen Hemmkonzentration, in seltenen Fällen kann die MBK um das 32fache und darüber höher sein als die MHK. MHK und MBK, als die beiden wichtigsten in vitro bestimmbaren Parameter einer antibakteriellen Substanz, sind sie zwar pharmakodynamisch ausgerichtet, ihre Aussagekraft ist allerdings begrenzt, da sie aufgrund der in vitro- Bedingungen nie die im Organismus tatsächlich ablaufenden Vorgänge widerspiegeln.

Die MBK-Werte erlauben keine Aussage über die Abtötungskinetik von Bakterien. Unsere ermittelten MBK-Werte für Amikacin entsprechen den Literaturangaben (Braveny et al. 1986, Craig et al. 1991). Für die empfindlichen Stämme gegenüber Amikacin liegen sie zwischen dem 10-20fachen der MHK. Der resistente Stamm 32 hatte nur einen 2,5fachen Wert der MHK von Amikacin.

Stamm 623 als sensibel eingestufter Teststamm zeigt eine höhere MBK als Stamm 17 und 8536. Die einzelnen Klinikisolate reagieren also unterschiedlich. Eventuell könnte die Rauhform des Stammes 623 eine hinweisende Erklärung sein.


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Alle Stämme wurden hinsichtlich der Bakterizidie getestet. Der Einsatz der MHK brachte bei allen Stämmen keine wesentliche Reduzierung des eingesetzten Inokulums. Nur die Antibiotikakonzentrationen, die den Serumspiegeln entsprechen zeigten eine Reduzierung der Bakterienzahl, wobei hier die Kombination von Amikacin plus Ceftazidim die deutlichsten Ergebnisse brachte.

Der Inokulum-Effekt läßt sich so erklären, daß mit zunehmender Bakterienzellzahl die bakterizide Wirkung des Antibiotikums nachläßt. Dieser Inokulum-Effekt ist ein Phänomen, das auch beschrieben wird als signifikantes Ansteigen der MHK von Beta-Laktamantibiotika, wenn die Zahl der Bakterien ansteigt und somit die Konzentration des Antibiotikums pro Bakterienzelle sinkt.

Der Inokulum-Effekt ließ sich nicht in allen Testreihen nachvollziehen.

4.3 Aminoglykoside und der PAE

Aminoglykoside sind unverändert hochwirksame und insbesondere auch kostengünstige Antibiotika für die Therapie schwerer Infektionen durch gramnegative Erreger. Studien der letzten Jahre haben gezeigt, daß die tägliche Einmalgabe der gesamten Aminoglykosiddosis gleich günstige klinische Resultate bei besserer Verträglichkeit ergibt (Sturm 1989, Raz et al. 1995). Die Einmalgabe versus der Dreimalgabe von Aminoglykosiden ist von zahlreichen Autoren in experimentellen Studien untersucht worden (Gerber et al. 1989, Spivey 1992, Ronald et al. 1997). Der PAE bei Aminoglykosiden liefert einen mikrobiologischen Hinweis für die Möglichkeit der Einmaldosierung. Auch in Tiermodellen konnte gezeigt werden, daß die Nephrotoxicität reduziert wird bei der Einmalgabe (Hostacka 1996). Die Beziehung zwischen Dosis und Toxizität verläuft nicht linear, sondern ein Sättigungsmechanismus tritt ein.

Für Amikacin ließen sich bei den empfindlichen Stämmen (8536, 3, 17, 623, ATCC 27853) PAE-Werte von 1,6-2,6 Stunden ermitteln.

Der ATCC Stamm 27853 hatte einen PAE von 2,15 Stunden, was den Literaturangaben entspricht (Gerber 1993, Armstrong et al. 1981).

Stamm 3 und 17 mit ähnlichem Resistenzmuster in der MHK-Bestimmung zeigen eine Differenz im PAE von 0,6 Stunden.

4.4 Beta-Lactamantibiotika und der PAE

Der resistente Stamm 32 zeigte im Mittel keinen bis negativen PAE.

Negativer PAE nach Gerber und Craig (1982): „Es kommt in der vorexponierten Kultur (mit Antibiotikum) im Vergleich zur Negativkontrolle zu einem paradox schnelleren Wachstum, so daß der lg10 Wert in der Testkultur früher erreicht wird als in der Negativkontrolle. Die paradox schnellere Wachstumsphase von gramnegativen Keimen kurz nach der Exposition mit bestimmten Beta-Lactamantibiotika entspricht einer raschen Teilung noch lebensfähiger, medikamenten induzierter Bakterienfilamente.“


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Stamm 8536 und Stamm 623 mit einer MHK von 2 µg/ml zeigten eine Differenz im PAE von 0,7 Stunden.

Eine Beziehung zwischen PAE und MHK bzw. MBK läßt sich bei Stamm 32 erkennen, das heißt die Resistenz gegenüber Amikacin läßt einen negativen bis keinen PAE erkennen.

Ein langer PAE spricht für eine Verlängerung des Dosierungsintervalls und der Möglichkeit der Einmaldosierung. Zu beachten ist aber, daß klinische Isolate verschieden reagieren und keine verallgemeinernden Schlüsse zulassen.

Es ist bekannt, daß Beta-Laktamantibiotika in niedrigen Konzentrationen keinen PAE auf gramnegative Stäbchen ausüben (Spivey 1992). Wir haben mit Ceftazidim in Serumspiegelkonzentration (40 µg/ml) PAE-Werte von negativ bis 2,8 Stunden erzielen können. Auch hier sind stammesspezifische Unterschiede erkennbar. Stamm17 mit einer MHK von 1 µg/ml zeigte einen PAE von -0,3 Stunden und Stamm 8536 ebenfalls mit einer MHK von 1 µg/ml hat einen PAE von 2,4 Stunden. Stamm 32 als resistentester Stamm gegenüber Ceftazidim zeigt einen PAE von 0,5 Stunden, was bedeuten könnte, das Stämme mit schlechter Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika zu kurzen Postantibiotischen Effekten neigen. Stamm 17 und 3 zeigen ebenfalls einen kurzen bis negativen PAE. Also auch hier die Schlußfolgerung, daß Klinikisolate unterschiedliche in vitro- Ergebnisse bringen.

4.5 Kombination der getesteten Antibiotika

Die Kombination von Amikacin und Beta-Laktamantibiotika scheint einen synergistischen Effekt auszuüben auf Streptokokkus faecalis und andere gramnegative Bakterien (Gerber 1993). Die synergistische Antwort bei Kombinationstherapien ist in experimentellen Studien oft gezeigt worden (Hollander et al. 1996). Gudmundsson et al. (1991) machten folgende Feststellung zum PAE bei gramnegativen Stäbchen: „Wenn Kombinationspartner einzeln getestet werden erzeugen sie einen PAE. Bei Kombination dieser summieren sich diese mathematisch “.

Issakson et al. (1991) demonstrierten eine Indifferenz des PAE bei der Kombination von Ciprofloxacin und Imipenem bei Pseudomonas aeruginosa, jedoch bei Imipenem und Tobramycin eine synergistische Wirkung bei Pseudomonas aeruginosa. Die Penetration der Aminoglykoside in ihr Ziel die Ribosomen ist gesteigert wenn die Aminoglykoside mit Beta-Laktamantibiotika kombiniert werden, welche die Zellwand zerstören .

Giamarellou (1986) führte Untersuchungen zu Interaktionen von Cephalosporinen und Aminoglykosiden durch und stellte unter anderem fest, daß die Aktivität bei Kombination Amikacin plus Ceftazidim nach 2 Stunden Inkubation immer noch 98 % beträgt.

Die Kombination von Ceftazidim mit Aminoglykosiden zeigt bei 65-70 % der Pseudomonas-Isolate einen synergistischen Effekt. Durch die unterschiedlichen Angriffspunkte an der Bakterienzelle, Störung der Proteinsynthese bzw. Hemmung des Zellwandaufbaus haben sich Aminoglykosid-Kombinationen mit Cephalosporinen bewährt, wobei sich der ausgeprägteste Synergismus zwischen Ceftazidim und Amikacin zeigt (Giamarellou 1986).


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Die Kombination beider Antibiotika bei einmaliger Exposition brachte bei Stamm 32, 623 und dem ATCC 27853 eine deutliche Verlängerung des PAE bis zur Verdopplung gegenüber der einzelnen Exposition der Antibiotika. Bei Stamm 3 ließ sich kein synergistischer Effekt beweisen.

Man könnte trotzdem die Schlußfolgerung ziehen, daß die Kombination zweier Pseudomonas aeruginosa wirksamer Antibiotika einen synergistischen Effekt liefert, was sich auch schon oft im klinischen Alltag bewiesen hat (Hilf et al. 1989). Außerdem könnte es sinnvoll erscheinen ein resistent oder intermediär getestetes Aminoglykosid mit einem sensiblen Antibiotikum zu kombinieren. Die Ergebnisse von Stamm 32 lassen diese Schlußfolgerung zu.

4.6 PAE nach mehrfacher Antibiotikaexposition

Die dreimalige hintereinander folgende Exposition der Pseudomonas-Stämme mit beiden Antibiotika brachte unterschiedliche Ergebnisse. Beim ATCC-Stamm konnte für Amikacin alleinig keine deutliche Verlängerung des PAE beobachtet werden. Die Testung von Ceftazidim hingegen zeigt eine Zunahme des PAE über die 3 Expositionszeiten.

Bei der Kombination beider Antibiotika blieb der PAE von der 2. zur 3. Exposition annähernd gleich, was für ein Nachlassen der Empfindlichkeit gegenüber den Antibiotika sprechen könnte.

Bei der 2.Testreihe fiel auf, daß sich das Inokulum von der 1. zur 3.Exposition stark verringert hat, was eine Verkürzung des PAE nach sich zieht. Für die Ermittlung des Mittelwertes zeigt das einen negativen Einfluß. Würde man diese Testreihe nicht mit einbeziehen, läßt sich doch eine Verlängerung des PAE erkennen.

In der postantibiotischen Phase kann sich folgendes physiologisches Phänomen zeigen, das der adaptiven Resistenz. Das ist ein kurzzeitiger Effekt, der eine reduzierte bakterizide Wirkung in einer zweiten Antibiotika-Exposition nach sich zieht . Sie ist abhängig von der Antibiotikakonzentration in der 1.Exposition und wahrscheinlich das Resultat des reduzierten Transportes vom Antiobiotikum in die Zelle (Mackenzie et al. 1993, Xiong et al. 1996).

Gudmundsson et al. (1994) beschreiben ebenfalls eine absteigende bakterizide Aktivität während der postantibiotischen Phase (Beta-Laktamantibiotika mehr als Aminoglykoside, bei gramnegativen Stäbchen mehr als bei Staphylokokkus aureus).

Der Stamm 3 zeigt beim Ceftazidim insgesamt eine Verlängerung des PAE von 0,37 auf 1,18 Stunden, bei der Amikacin-Testung ist keine Verlängerung des PAE zu sehen, eher eine Konstanz zu beobachten. Die Kombination von Ceftazidim und Amikacin ließ das Phänomen der adaptiven Resistenz erkennen. Von der 1. Exposition zur 2. Exposition verringerte sich der PAE von 2,3 auf 0,9 Stunden, aber zur 3. Exposition kam es zu einem deutlichen Anstieg auf 3,25 Stunden. Die Bakterienpopulation scheint über die 3 Expositionsphasen empfindlicher geworden zu sein.

Beim Stamm 32 ließ sich die adaptive Resistenz ebenfalls zur 2. Exposition hin, bei der Testung von Amikacin und Ceftazidim alleinig und der Kombination beider erkennen. Zur 3. Exposition ist bei allen drei Testarten eine Verlängerung des PAE sichtbar. Stamm 32, der eigentlich resistent ist gegenüber Amikacin zeigt über die 3 Expositionen eine Zunahme des


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PAE für Amikacin was für eine Zunahme der Empfindlichkeit sprechen würde. Dies könnte eine Kombinationstherapie beider Antibiotika experimentell zulassen.

In der nachfolgenden Tabelle sind die Mittelwerte der Ergebnisse noch einmal dargestellt.

Tabelle 12: MHK, MBK und PAE bei verschiedenen Stämmen von Pseudomonas aeruginosa

Stamm

Antibiotika

MHK

(µg/ml)

MBK

(µg/ml)

PAE

in Stunden

ATCC

Amikacin

2,0

40

2,15

27853

Ceftazidim

1,0

k.M.

2,8

 

Amikacin+ Ceftazidim

k.M.

k.M.

5,1

3

Amikacin

4,0

40

2,0

 

Ceftazidim

2,0

k.M.

0,14

 

Amikacin+ Ceftazidim

k.M.

k.M.

2,43

32

Amikacin

32

80

-0,08

 

Ceftazidim

4,0

k.M.

0,5

 

Amikacin+ Ceftazidim

k.M.

k.M.

2,8

k.M. = kein Meßwert

Aus der MHK kann auf den PAE geschlossen werden, da eine inverse lineare Beziehung besteht. Der Quotient MBK/MHK variiert zwischen verschiedenen Stämmen der gleichen Spezies. Munckhof et al. (1997) stellten bei Untersuchungen zum PAE an Escherichia coli-Stämmen ebenfalls eine Korrelation zwischen MHK und PAE fest.

Die Untersuchungen zum Postantibiotischen Effekt mit den klinischen Isolaten brachten nicht immer Ergebnisse der Literatur entsprechend. Für die Aminoglykoside ist es oft genug experimentell bewiesen worden, daß eine Einmalgabe möglich ist; für die Beta-Laktamantibiotika, speziell für Ceftazidim läßt sich das durch unsere Ergebnisse nicht untermauern. Eine Verlängerung des Dosierungsintervalls für Ceftazidim läßt sich nicht mit unseren Untersuchungen beweisend darstellen, so daß die 3xGabe klinisch relevant bleibt oder sogar eine Dauerinfusion anzustreben wäre.

Für Amikacin läßt sich feststellen, daß der PAE eine geringe Verlängerung über 3 Dosierungsintervalle bringt für sensibel getestete Stämme. Interessant ist, daß ein resistent getesteter Stamm über eine dreimalige Exposition mit Amikacin eine Verlängerung des PAE hervorbringt.


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Somit scheint eine lang andauernde Wirkung eines Antibiotikums auf eine in vitro resistent getestete Bakterienzelle doch eine Wirkung hervorzurufen.

Initial wurde eine Bakterienstammkultur mit entsprechender Keimzahl verwendet. Dieses Inokulum wurde annähernd bei jeder nachfolgenden Exposition wieder erreicht.

Das läßt die Feststellung aufkommen, daß keine Wirkung durch das Antibiotikum erzielt wurde. Jedoch die PAE-Werte in den einzelnen Expositionsphasen zeigen deutlich, daß die Bakterienzelle geschädigt sein muß. Aber es beweist auch erneut die Notwendigkeit der lang andauernden Therapie einer Pseudomonasinfektion.

In der Literatur finden sich wenig Angaben über die Testung des PAE in mehrmaliger Exposition. Betty et al. (1993) untersuchten den ATCC 27853 in 3facher Exposition mit Imipenem und fanden einen PAE von 2,6-2,8-2,6 h. Sie stellten fest, daß bisher die einmalige Exposition als Marker für die Festlegung des Dosierungsintervalls genommen wurde. Wie sich der PAE über mehrere Dosierungsintervalle entwickelt, dazu sind noch zahlreiche Studien notwendig.

Hollander et al. (1998) äußerten, daß in vitro Methoden zur PAE-Bestimmung keine wesentliche Bedeutung hätten. PAE-Bestimmungen in vivo hätten gewisse klinische Relevance.

Diese Arbeit sollte einen Beitrag dazu liefern, die Wirkung von Antibiotika experimentell zu untersuchen. Die Kenntnis über die Wirkung von Chemotherapeutika ist nach wie vor die Grundlage für die individuelle Dosierung der antimikrobiellen Therapie.

Offen bleiben die Fragen zu den genauen Mechanismen in der Bakterienzelle über mehrere Dosierungsintervalle. Hierzu sind sicher noch zahlreiche Studien notwendig.


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