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Eignung der Methode

In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, daß die Durchflußzytometrie in Verbindung mit der Verwendung monoklonaler Antikörper und standardisierter, kommerziell erhältlicher Eichpartikel eine geeignete Methode zur Quantifizierung kleiner Zellkonzentrationen in Frischplasma ist.

Mit Verdünnungsreihen wurde demonstriert, daß bis zu einer Konzentration von 0,5 - 1 Leukozyten pro l Messungen von zufriedenstellender Präzision durchführbar sind.

Mit 0,1 Leukozyten pro l haben DZIK et al.16 eine vergleichbare Sensitivitätsgrenze für durchflußzytometrische Leukozytenbestimmungen bei Ermittlung des Probengewichtes vor und nach der Messung beschrieben. VACHULA et al.52, die FITC-markierte Hühnererythrozyten als Eichpartikel verwendet hatten, gaben einen linearen Zusammenhang zwischen erwartetem und gemessenem Wert bis zu einer Schwelle von 5 Leukozyten pro l an, SHECKLER et al.49 verwendeten eine ähnliche Technik und gaben sogar 0,001 Leukozyten pro l als Sensitivitätsgrenze an. LUTZ 31 fand einen ausgezeichneten Korrelationskoeffizienten zwischen erwartetem und gemessenem Wert bis zu einer Grenze von 0,3 Leukozyten pro l. REBULLA et al.45 gaben 0,1 Leukozyten pro l als Sensitivitätsgrenze an.

Ein Vorteil der hier beschriebenen Methodik liegt darin, daß durch die Verwendung der kommerziell erhältlichen Eichpartikel in bekannter Konzentration die Herstellung einer Eichlösung nicht erforderlich ist.

Um präparations- und geräteabhängige Variationen für die durchflußzytometrische Methode zu ermitteln, wurde Plasma aus ein und derselben Spende zehnfach präpariert und mit dem Durchflußzytometer gemessen. Es konnte ein Variationskoeffizient von 22,9 % bei einem mittleren Zellgehalt von 0,8 Leukozyten pro l gefunden werden.

Neben der Durchflußzytometrie ist die mikroskopische Zählung in der Nageotte-Kammer die am häufigsten beschriebene Methode zur Quantifizierung von Leukozyten in leukozytenarmen Blutprodukten. Es konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, daß die mit dem Durchflußzytometer bestimmten Zellkonzentrationen mit einem Korrelationskoeffizienten von 0,95 in zufriedenstellender Weise mit den Werten aus der mikroskopischen Zählung in der Nageotte-Kammer übereinstimmten. Damit ist die Korrelation nur geringfügig schlechter als von
LUTZ et al.31 angegeben (r = 0,9996), die aber auch zeigten, daß die Zählung in der Nageotte-Kammer in einem Meßbereich von weniger als 2 Leukozyten pro l einen Variationskoeffizienten von immerhin 40 % aufwies. Die von MASSE et al.32 beschriebene Modifikation der Methode, die im Konzentrieren der Zellen in der Hälfte des ursprünglichen Probevolumens und der Zellzählung im resuspendierten Pellet besteht, verbessert zwar die Präzision auf einen Korrelationskoeffizienten von 0,974 in einem Bereich von 0,01 bis 0,5 Leukozyten pro l, erhöht aber gleichzeitig den Zählzeit auf 30 min für eine Probe. PRATI et al.41 beschrieben eine weitere Modifikation der Methode von MASSE 32, bei der die Leukozyten auf ein Zwanzigstel des Originalvolumens konzentriert wurden. Sie gaben eine Sensitivitätsgrenze von 0,005-0,01 Leukozyten pro l an.

Ein Vorteil der Durchflußzytometrie gegenüber der Nageotte-Kammer liegt darin, daß ein größeres Probenvolumen analysiert wird. Wie DUMONT 15 in einer Übersichtsarbeit über Fehlerquellen bei der Bestimmung sehr kleiner Leukozytenzahlen darstellte, ist die Größe des Vertrauensintervalls der Ergebnisse vor allem vom prozessierten Probenvolumen abhängig. Bei der Zählung in der Nageotte-Kammer wurde eine Kammerhälfte (entspricht 50 l) bei einer Probenverdünnung von 1:10 ausgezählt. Damit wurden 5 l der eigentlichen Probe analysiert. Selbst beim Auszählen beider Kammerhälften können maximal 10 l Probe analysiert werden. Das Durchflußzytometer prozessiert zirka 60 l der Analysenlösung in der Minute. Die durchschnittliche Meßzeit bei der Zählung von Leukozyten betrug drei bis fünf Minuten. Wenn, wie bei der hier beschriebenen Präparationsart, 90 l Plasma mit 610 l Flüssigkeit verdünnt wurden, entspricht das einem analysierten Volumen von 25 - 40 l der eigentlichen Probe. Damit wurde bei der durchflußzytometrischen Bestimmung der Leukozyten ein zwei- bis vierfach größeres Probenvolumen als in der Nageotte-Kammer analysiert.

Verschiedene Untersucher haben mit Hilfe von Verdünnungsreihen versucht, die Sensitivitätsgrenze der Zählmethode in der Nageotte-Kammer durch Auftragung des erwarteten Wertes gegen den ermittelten Wert anzugeben. LUTZ et al.31 gaben eine Schwelle von 0,3 Leukozyten pro l an, MOROFF et al.35 gaben 0,5 Leukozyten pro l an, REBULLA et al.45 bezeichneten 1 Leukozyten pro l als Schwellenwert. Die letztgenannte Autorengruppe entwickelte allerdings verschiedene Präparationsmethoden für die Zählung in der Nageotte-Kammer, die auch im Konzentrationsbereich von 0,1-1 Leukozyten pro l zufriedenstellende Ergebnisse zeigten.

Durchflußzytometrie und mikroskopische Zählung in der Nageotte-Kammer weisen somit durchaus vergleichbare Sensitivitätsgrenzen bei der Ermittlung von kleinen Leukozytenzahlen in Blutprodukten auf. Unstrittig ist, daß mikroskopische Zählmethoden einiger Erfahrung bedürfen und äußerst ermüdend sind. Bei Verwendung eines Durchflußzytometers kann ein größeres Probenvolumen analysiert werden, wodurch das Vertrauensintervall der Ergebnisse verbessert wird. Allerdings ist der materielle Aufwand für die durchflußzytometrische Bestimmung von Zellkonzentrationen bei Verwendung von monoklonalen Antikörpern und standardisierten Eichpartikeln größer als bei Verwendung der Nageotte-Kammer, so daß im Einzelfalle bei der Auswahl der Methode das Kosten-Nutzen-Verhältnis erwogen werden muß.

Die Quantifizierung fluoreszenzmarkierter Leukozyten als Gesamtpopulation mittels der hier beschriebenen Methode ist wenig problematisch. In zellreichen Proben zeigte auch die quantitative Bestimmung der Subpopulationen (Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten) plausible Ergebnisse. Je geringer allerdings der Leukozytengehalt und je größer der Gehalt an Zelltrümmern in einer Probe ist, um so größer wird die Fehlerwahrscheinlichkeit bei der Zählung der Subpopulationen. In den untersuchten Plasmaproben wurde im Fluoreszenz 1 gegen Fluoreszenz 2 - Diagramm eine konstante Debris-Population beobachtet, deren Partikel die verwendeten Antikörper CD 45 und CD 14 in gleichem Maße gebunden hatten. Sie erschwert insbesondere bei geringem Zellgehalt der Probe die Abgrenzung der Granulozytenpopulation, so daß eine sichere Unterscheidung von Granulozyten und Debris nicht möglich ist. Wenn dieser Fehler auch in zellreichen Proben nur einen unwesentlichen Prozentsatz ausmacht, steigt er doch bei zellarmen Proben, in denen zum Teil weniger als 10 Leukozytenereignisse pro Messung quantifiziert werden konnten, überproportional an. Es wurde deshalb auf die Angabe des prozentualen Anteils der Subpopulationen am Gesamtleukozytengehalt des Plasmas verzichtet.

Durch das Verhältnis Leukozytenzahl/Debris wird somit die Sensitivität dieser Methode begrenzt.

Bei der Erfassung der Erythrozyten wurde in der Auftragung von Vorwärtsstreuung gegen Seitwärtsstreuung neben der normalen Erythrozytenpopulation regelmäßig eine weitere Population mit geringerer Vorwärts- und Seitwärtsstreuung beobachtet. Diese Population machte zwischen 20 und 70 % der Gesamterythrozyten aus. Es wird davon ausgegangen, daß es sich hierbei um Erythrozyten handelt, die durch die Fixierung mit Formaldehyd verändert worden sind. Da die Klassifikation der Erythrozyten jedoch ausschließlich über einen Attractor im Fluoreszenzdiagramm erfolgte und beide Zellgruppen hinsichtlich ihrer Fluoreszenzmarkierung eine einheitliche Population bildeten, wurden sie auch als solche quantifiziert.

Anders als bei den Leukozyten werden bei der Untersuchung von Thrombozyten und Erythrozyten durch die Berechnung der Zellzahl im Fluoreszenzdiagramm (Leukozyten: FCS-SSC-Diagramm) nicht nur intakte Zellen, sondern antigenes Membranmaterial von Erythrozyten beziehungsweise Thrombozyten an sich quantifiziert, so daß die angegeben Werte unter Umständen über der tatsächlich vorhandenen Anzahl an intakten Zellen liegen.


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