Die Transfusion allogener Vollblutkonserven gilt heute als obsolet. An ihre Stelle ist der Einsatz von buffy-coat-armen Erythrozytenkonzentraten, Thrombozytenkonzentraten und Frischplasma getreten. Dies liegt einerseits darin begründet, daß die einzelnen Blutkomponenten unterschiedliche Lagerungsoptima aufweisen. Erythrozyten sind bei 4C über 6 bis 7 Wochen haltbar, während Thrombozyten bei 22 bis 24C fünf Tage und Frischplasma bei Temperaturen von unter -30C bis zu einem Jahr haltbar sind. Allerdings verliert Frischplasma selbst bei einer Lagertemperatur von 4C bereits nach kurzer Zeit seine Gerinnungsaktivität. Zum anderen tritt in Vollblutkonserven während der Lagerung eine wesentlich stärkere Bildung von Mikroaggregaten auf als bei Blutkomponenten. Diese Mikroaggregate, die aus Zellfragmenten, degenerierten Zellen, Membranbestandteilen und Proteinen bestehen, werden für eine Reihe von Transfusionskomplikationen, wie das Adult Respiratory Distress Syndrom (ARDS), die Thrombozytopenie post transfusionem und die Senkung des Fibronectinspiegels des Empfängers verantwortlich gemacht und sind daher in höchstem Maße unerwünscht 24.
Aber auch die Transfusion allogener Blutkomponenten ist mit einer ganzen Anzahl von unerwünschten Nebenwirkungen verbunden.
Der größte Teil dieser Nebenwirkungen ist an die Gegenwart von fremden Zellen gebunden und wird insbesondere den Fremdleukozyten, die kontaminierend in den verschiedenen Blutkomponenten vorhanden sind, zugeschrieben. Dazu zählen die Alloimmunisierung, immunmodulatorische Effekte beim Empfänger und die Übertragung infektiöser Agentien.
Unter Alloimmunisierung wird die Bildung von Antikörpern gegen fremde
Antigendeterminanten verstanden. Dabei handelt es sich vorwiegend um Antigene
des MHC (major histo-
compatibility complex). Unter dem Begriff MHC werden
die Genorte auf dem kurzen Schenkel des 6. Chromosomenpaares
zusammengefaßt, die für die Ausprägung der
Histokompatibilitätsantigene auf den Körperzellen kodieren. Diese
Antigene wurden zuerst auf Leukozyten
beschrieben und werden deshalb als
HLA (human leukocyte antigens) bezeichnet. Unter den HLA wird in Klasse I- und
Klasse II-Antigene unterschieden, die von verschiedenen Genorten kodiert werden
und in ihrer Struktur differieren. Während alle kernhaltigen
Körperzellen sowie Thrombozyten Klasse I-Antigene tragen, befinden sich
auf der Oberfläche antigenpräsentierender Zellen, zu denen unter
anderen die B-Lymphozyten, aktivierte T-Lymphozyten und Monozyten gehören,
sowohl Klasse I - als auch Klasse II-Antigene. Für die Auslösung
einer Alloimmunisierung ist das Vorhandensein von fremden HLA - Klasse I und
Klasse II tragenden Zellen notwendig 10,29,47,53.
CLAAS10 et al. konnten bereits 1981 im Tiermodell zeigen, daß
die Transfusion von Thrombozyten allein keine Antikörperbildung beim
Empfänger hervorruft, während bei einer Kontamination der
Thrombozytensuspension mit 103 Leukozyten pro Transfusion bei
Mäusen eine
Alloimmunisierung erfolgt. Sie zeigten auch, daß
nach der Transfusion einer leukozytenkontaminierten Thrombozytensuspension eine
stärkere Antikörperbildung zu beobachten ist als nach Gabe der
äquivalenten Leukozytenmenge allein.
Eine Alloimmunisierung kann sich klinisch in nicht-hämolytischen febrilen
Transfusions-
reaktionen und in einer Refraktärität gegen allogene
Thrombozytenkonzentrate darstellen.
Als Ursache nicht-hämolytischer febriler Transfusionsreaktionen werden die Interaktion von HLA-I-Antikörpern mit Spenderleukozyten, das Wirken von Antikörpern gegen Spendergranulozyten sowie das Vorhandensein von während der Lagerung aus Leukozyten freigesetzten Zytokinen angegeben 24, 33.
Ihre Häufigkeit nimmt ab, wenn weniger als 2,5 - 5108 Leukozyten pro Transfusionseinheit übertragen werden. Dieser Grenzwert wird auch als call-Wert (critical antigeneic load of leukocytes) bezeichnet 24, 33.
Die Refraktärität gegen allogene Thrombozyten stellt das Hauptproblem bei der Behandlung thrombozytopenischer Zustände mit Thrombozytenkonzentraten dar. Sie wird mit einer Inzidenz von 30 bis 70 % angegeben 3.
SAARINEN 47 et al. verglichen 1990 die Inzidenz der
Thrombozytenrefraktärität bei Verwendung von
Standardblutpräparaten und leukozytenarmen Präparaten. Bei der von
den Autoren untersuchten Population immunsupprimierter krebskranker Kinder
entwickelte keiner der
Patienten, die weniger als 1106
Leukozyten erhalten hatten, eine Thrombozytenrefraktärität,
während in der Kontrollgruppe, die mit herkömmlichen
Thrombozytenkonzentraten versorgt wurde, 52 % der Patienten eine
Thrombozytenrefraktärität entwickelten.
In einer Arbeit von BLAJCHMAN et al.3 lag die Refraktäritätsrate gegen Thrombozyten im Tierversuch nach 8 Wochen mit einer wöchentlichen Transfusion von herkömmlichem Thrombozytenkonzentrat bei 91,2 %. Wurde das Blut um 99,5-99,6 % leukozytendepletiert, sank sie auf 30 %.
Eine andere Folge der kontaminierenden Fremdleukozyten in allogenen Blutprodukten besteht in einer Immunsuppression des Empfängers.
Diese transfusionsinduzierte Immunsuppression zeigt sich klinisch beispielsweise in erhöhten postoperativen Infektionsraten nach der Transfusion allogener Blutprodukte 5,25,26,46,51. Es konnte eine Abhängigkeit vom Leukozytengehalt des Blutproduktes gezeigt werden 25.
JENSEN et al. zeigten in einer Studie von 1990, daß Bluttransfusionen einen wesentlichen Risikofaktor für die Ausprägung infektiöser Komplikationen in der Colorektalchirurgie darstellten 26.
BORDIN und BLAJCHMAN 5 stellten in einer Übersichtsarbeit 1995 die Ergebnisse verschiedener Studien über den Zusammenhang zwischen Fremdbluttransfusionen und postoperativen bakteriellen Infektionen bei Patienten mit resektiven Eingriffen an malignen Tumoren zusammen. Die fünf von den Autoren ausgewerteten Arbeiten ergaben, daß die Inzidenz von postoperativen bakteriellen Infektionen bei mit allogenem Blut versorgten Tumorpatienten zwischen 20 und 30 % lag, während sie bei Patienten ohne Transfusion bzw. mit autologer oder syngener Transfusion zwischen 2 und 10 % lag.
TRIULZI 51 et al. beschrieben eine fünffache Erhöhung der
Rate an postoperativen bakteriellen Hospitalinfektionen bei Patienten mit
allogenen Bluttransfusionen im Vergleich zu Patienten mit autologer oder ohne
Transfusion. Die Autoren bestätigten den von anderen Untersu-
chern
46 gefundenen dosisabhängigen Zusammenhang zwischen der Anzahl
der Transfusionseinheiten und der postoperativen Infektionsrate.
ROSEMURGY et al.46 fanden in einer Studie an 390
Notaufnahmepatienten, daß das Infek-
tionsrisiko, die Rate an
multiplen Infektionen sowie die Schwere einer Infektion mit der Anzahl der
transfundierten Erythrozytenkonzentrate anstiegen.
Diese Studien sind nicht unwidersprochen geblieben. Es scheint plausibel, daß Patienten mit einem erhöhten Bedarf an allogenen Bluttransfusionen sich a priori in einem schlechteren Allgemeinzustand befinden und daher von vornherein ein erhöhtes Risiko für Infektionen aufweisen. Allerdings ist es ethisch kaum vertretbar, zur Klärung dieser Frage randomisierte Studien durchzuführen, in deren Rahmen Patienten mit einem erhöhten Bedarf an allogenen Bluttransfusionen nicht mit solchen versorgt werden, oder Patienten mit mehr allogenen Bluttransfusionen versorgt werden, als es klinisch indiziert ist.
In einer weiteren Arbeit untersuchten JENSEN et al.25 die postoperative Infektionsrate und die Funktion der natürlichen Killerzellen in Abhängigkeit vom Leukozytengehalt des transfundierten Blutpräparates. So konnten sie eine Wundsepsis bei 23 % der Patienten, die Vollbluttransfusionenerhalten hatten, bei 2 % der Patienten mit Transfusionen von leukozytendepletiertem Blut und bei 2 % der Patienten ohne Transfusion beobachten. Die Funktion der natürlichen Killerzellen war bei den Patienten mit Vollbluttransfusionen im Gegensatz zu den beiden anderen Gruppen signifikant beeinträchtigt und blieb es bis zu einem Monat.
Der immunsuppressive Effekt von Bluttransfusionen wurde auch im Zusammenhang mit erhöhten Tumorrezidivraten nach Fremdbluttransfusionen in der Tumorchirurgie untersucht.
BORDIN und BLAJCHMAN 5 wiesen darauf hin, daß Untersuchungen über den Zusammenhang zwischen Fremdbluttransfusionen und der Wahrscheinlichkeit eines Tumorrezidivs zumeist retrospektiven Studien an Patienten mit Colorektalkarzinomen entstammen. Sie ließen die Ergebnisse von 30 Studien zu diesem Thema von zwei unabhängigen Untersuchergruppen analysieren. Beide Gruppen kamen zu dem Schluß, daß allogene Bluttransfusionen das Rezidivrisiko erhöhen und die Gesamtprognose des Patienten verschlechtern.
Sie bezogen in ihre Zusammenfassung 40 weitere Studien zu dieser Fragestellung ein, in denen andere Typen maligner Erkrankungen der Brust, Lunge, Prostata, des Magens, der Leber, des Kopf- und Halsbereiches, der Cervix, Vulva, der Knochen- und Weichgewebe und Lebermetastasen untersucht worden waren. Insgesamt bestätigten 65 % aller Studien den negativen Einfluß allogener Bluttransfusionen auf die Rezidivwahrscheinlichkeit und die Überlebenszeit des Patienten, während 35 % diesen Zusammenhang nicht finden konnten.
Die wohl am besten untersuchte klinische Konsequenz der transfusionsinduzierten
Immunsuppression ist die verbesserte Transplantatüberlebenszeit bei
Patienten, die vor der Organtransplantation allogene Bluttransfusionen erhalten
hatten, im Vergleich zu Patienten, die entweder kein Blut oder aber Eigenblut
erhalten hatten. Auch hier weisen zumindest einige der
Studien
37,38 eine Dosisabhängigkeit dieses Effektes nach.
OPELZ et al.37 untersuchten zwischen 1969 und 1971 bei 148 Patienten den Zusammenhang zwischen Bluttransfusion und der Transplantatüberlebensrate nach darauffolgender Nierentransplantation. Dabei zeigten die Patienten mit mehr als zehn Transfusionen die höchste Transplantatüberlebensrate (66 % nach einem Jahr), gegenüber 43 % in der Gruppe mit einer bis zehn Transfusionen und 29 % in der Gruppe ohne Bluttransfusion.
CORRY et al.11 fanden bei Patienten mit Nierentransplantaten, die nie zuvor Transfusionen erhalten hatten, eine durchschnittliche Transplantatüberlebensrate von 45 % nach einem Jahr, während Patienten mit perioperativer und/oder präoperativer Transfusion Transplantatüberlebensraten zwischen 59 und 71 % erreichten. Damit lagen die Transplantatüberlebensraten bei den zuvor transfundierten Patienten signifikant höher als bei solchen Patienten, die nie zuvor eine Transfusion erhalten hatten.
1977 wurde in einer weiteren Studie von OPELZ et al.39 an 1360 Nierentransplantationen der direkte Zusammenhang zwischen der Transplantatüberlebenszeit und der Anzahl der transfundierten Einheiten an Blut bestätigt. So lag die 4-Jahres-Überlebensrate bei Patienten ohne Transfusionen bei 30 %, im Gegensatz dazu bei Patienten mit mehr als 20 präoperativen Transfusionen bei 65 %.
Es konnte auch nachgewiesen werden, daß die Leukozyten für diesen transplantatprotektiven Effekt verantwortlich sind.
PERSIJN et al. 40 stellten 1979 im Rahmen einer retrospektiven Studie fest, daß bei Transplantatempfängern, die eine (1) präoperative Bluttransfusion erhalten hatten, die Transplantatüberlebensrate nach einem Jahr bei 87 % lag, während Empfänger, die vor der Transplantation nie transfundiert worden waren, eine Transplantatüberlebensrate von nur 32 % im selben Zeitraum erreichten.
In einer prospektiven Studie fanden sie heraus, daß sich die Transplantatüberlebensraten der Empfänger leukozytendepletierter ("leukozytenfreier") Präparate nicht signifikant von denen unterschieden, die nie zuvor eine Transfusion erhalten hatten. Die Patienten, die gewaschene ("leukozytenarme") Erythrozytenkonzentrate erhalten hatten, erreichten ähnliche Transplantatüberlebenszeiten wie diejenigen, die zuvor eine (1) herkömmliche Bluttransfusion erhalten hatten.
Desweiteren beobachtete man bei Empfängern von Fremdbluttransfusionen zum einen als Ursache, zum anderen als Folge eines geschwächten Immunsystems eine erhöhte Inzidenz von Virusinfektionen, insbesondere mit Hepatitis B-Virus (HBV), Hepatitis C-Virus (HCV), Human Immunodeficiency Virus (HIV), Cytomegalievirus (CMV), Epstein-Barr-Virus (EBV) und Human T-Cell-Leucaemia Virus I (HTLV I), und ein rascheres Fortschreiten solcher Infektionen 6. Dabei findet man einige Viren, die durch Blutprodukte übertragen werden, sowohl in den Leukozyten als auch im Plasma, für andere jedoch werden die Leukozyten als der einzige oder der Hauptvektor bei der parenteralen Verbreitung angesehen. Das gilt für CMV, HTLV I und EBV.
Der Zusammenhang zwischen allogenen Bluttransfusionen und der Übertragung
von Cytomegalievirus - Infektionen ist schon lange bekannt und durch zahlreiche
Studien be-
legt 13,21,43,54.
Für die CMV-Infektion nach allogener Transfusion werden zwei Mechanismen angenommen: einerseits die direkte Übertragung von Viren, andererseits die Reaktivierung latenter CMV-Infektionen 43.
Für die Virusübertragung werden die Leukozyten verantwortlich gemacht 20,43. Aber auch bei der Reaktivierung latenter CMV-Infektionen scheint die leukozytenassoziierte Immunsuppression eine entscheidende Rolle zu spielen 23.
Verschiedene Studien belegen, daß CMV-Infektionen durch die Verwendung leukozytendepletierter Blutprodukte vermeidbar sind 17,20,22.
Da die Leukozytendepletierung auch das Risiko für eine Alloimmunisierung deutlich reduzieren kann 10,47, fand in den letzten Jahren der Grenzwert der Leukozytenkontamination, unterhalb dessen eine Alloimmunisierung nicht mehr zu erwarten ist, großes Interesse. Obwohl ein definitiver Wert noch nicht gefunden werden konnte, da er möglicherweise starken interindividuellen Schwankungen unterliegt, wurde mit dem cill-Wert (critical immunological load of leukocytes) von 1 106 Leukozyten pro Transfusionseinheit eine Richtlinie geschaffen.
Verschiedene Autoren haben sich um die Angabe von Grenzwerten bemüht. So fanden VAN MARWIJK KOOY et al.53 in einer Studie, daß die Inzidenz einer Alloimmunisierung bei Patienten, die mehr als 50106 Leukozyten pro Transfusion erhalten hatten, um 51 % höher lag als bei Patienten mit weniger als 50106 Leukozyten pro Transfusion.
In einer Arbeit von FISHER et al.18 konnte gezeigt werden, daß eine Alloimmunisierung mit einer Leukozytendosis von weniger als 5106 Zellen pro Transfusionseinheit verhindert werden kann.
SNIECINSKI et al.50 fanden eine Senkung der Inzidenz von
Alloimmunisierungen von 50 auf
15 %, wenn statt konventioneller
Thrombozytenkonzentrate gefilterte Produkte mit einem Leukozytengehalt von
durchschnittlich 6106 Leukozyten verwendet wurden.
In einer Arbeit von OKSANEN et al.36 zeigte keiner der Patienten, die gefilterte Thrombozytenkonzentrate mit einem Leukozytengehalt von weniger als 1106 Zellen pro Transfusionseinheit erhalten hatten, eine Thrombozytenrefraktärität.
In der vorliegenden Arbeit soll Frischplasma auf seine zelluläre Kontamination untersucht werden.
Frischplasma ist gemäß der Produktmonographie des Bundesanzeigers Nr. 182 vom 27.09.1989 "weitgehend zellfrei". Es sollte weniger als 1000 Erythrozyten, weniger als 20 000 Thrombozyten und weniger als 500 Leukozyten pro l enthalten 9. Dies entspricht bei einem Transfusionsvolumen von 300 ml 300106 Erythrozyten, 6000106 Thrombozyten und 150106 Leukozyten pro Transfusionseinheit.
Gemäß den Empfehlungen des Council of Europe darf der Thrombozytengehalt von gefrorenem Frischplasma 25 000 Zellen pro l nicht überschreiten 12.
Wenn nun, wie oben beschrieben, ein kritischer Grenzwert der Leukozytenkontamination für die Alloimmunisierung und die Übertragung infektiöser Agentien durch Blutprodukte angenommen werden kann, stellt sich die Frage, ob das als "nahezu zellfrei" deklarierte Frischplasma tatsächlich einen unterhalb dieses Wertes gelegenen Zellgehalt, insbesondere an Leukozyten, aufweist und ob sich die verschiedenen Herstellungsverfahren hinsichtlich der zellulären Kontamination des gewonnenen Frischplasmas unterscheiden.
Für die Quantifizierung von sehr kleinen Zellzahlen, wie sie im Frischplasma erwartet werden, sind herkömmliche Methoden, wie die Verwendung von Blutbildautomaten oder Standardzählkammern, nicht geeignet. Blutbildautomaten können Leukozytenkonzentrationen unter 50-100/l und Thrombozytenkonzentrationen unter 3500-4000/l nicht mehr ausreichend genau quantifizieren 19,55. Mit der Entwicklung moderner Leukozytenfilter konnte die Leukozytenkontamination in Erythrozyten- und Thrombozytenkonzentraten um bis zu 4 Zehnerpotenzen - das entspricht einem Restleukozytengehalt in der Größenordnung von 1105 Leukozyten pro Transfusionseinheit und weniger als einem Leukozyten pro l - gesenkt werden.
Da die Quantifizierung sehr kleiner Leukozytenzahlen in Blutprodukten sowohl im Rahmen der Qualitätskontrolle als auch bei der Weiterentwicklung der Leukozytenfilter von zunehmender Bedeutung ist, sind in den letzten Jahren verschiedene Methoden zur Ermittlung kleiner Leukozytenkonzentrationen in Blutprodukten beschrieben worden. Dazu gehören die Anwendung der Fluoreszenzmikroskopie 14,27, der Durchflußzytometrie 1,4,16,45,49,52,56 sowie die Verwendung großvolumiger Zählkammern wie der Nageotte-Kammer 31,32,35,42. Von WESTER et al.57 wurde 1990 eine Radioimmunoassay-Technik unter Verwendung monoklonaler Antikörper angegeben. LEE et al.30 beschrieben 1994 auch die Anwendung der polymerase-chain-reaction (PCR) zur Vermehrung leukozytärer HLA-DNA, um eine quantitative Aussage über den Leukozytengehaltgehalt gefilterter Blutprodukte zu ermöglichen.
In der vorliegenden Arbeit wurde der Restzellgehalt in Frischplasma unter Verwendung eines Durchflußzytometers bestimmt. Um eine Konzentration der Zellen angeben zu können, muß das während des Meßvorganges prozessierte Volumen bestimmt werden, da die Flußrate des Durchflußzytometers nicht mit ausreichender Genauigkeit angegeben werden kann. Zu diesem Zweck sind verschiedene Methoden beschrieben worden. Eine Möglichkeit ist das Auswiegen der Probe vor und nach der Messung 16. AL et al.1 haben den Volumenstrom mit einer Eichlösung bestimmt, die Messung nach einer festgelegten Ereigniszahl beendet, die hierfür benötigte Zeit erfaßt und aus diesen Parametern das prozessierte Volumen errechnet. Alternativ ist die Analysierung des gesamten Probevolumens beschrieben worden 56, diese Methode birgt allerdings die Gefahr in sich, daß Luftblasen in den Meßraum aspiriert werden und die entstehenden Artefakte das Meßergebnis nachteilig beeinflussen. VACHULA 52 und SHECKLER 49 beschrieben 1993 die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Hühnererythrozyten als Eichpartikel. Sie stellten eine Eichlösung mit bekannter Konzentration an Partikeln her, die der Probe zugegeben wurde, und errechneten aus der vom Durchflußzytometer erfaßten Anzahl der Partikel das analysierte Volumen. Bei der in dieser Arbeit verwendeten durchflußzytometrischen Methode wurden zur Volumenbestimmung kommerziell verfügbare, standardisierte Latexeichpartikel (beads) in bekannter Konzentration verwendet.
Zur zellulären Kontamination von Frischplasma liegen bisher nur wenige Arbeiten vor, deren Ergebnisse sehr unterschiedlich sind.2,28,34,58 Die Ursachen hierfür mögen zum einen in den verschiedenen Herstellungsverfahren der untersuchten Plasmen, zum anderen aber auch in den verschiedenen verwendeten Untersuchungsmethoden liegen.