Mahlig, Kirsten: Der Nachweis von Plasmazytoiden Monozyten in der Bronchoalveolären Lavage - Methodik und klinische Bedeutung

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Kapitel 2. Patienten und Methoden

2.1. Patienten

Das untersuchte Kollektiv umfaßte 50 Patienten: Sarkoidose - 19 Patienten (2 akute Fälle mit CD4/CD8>3,5), SSc - 17 Patienten, SLE - 4 Patienten, Kontrollgruppe (4 extrapulmonale Tumoren zur Primärtumorsuche, 2 Patienten mit unklarem Rundherd links, 2 Patienten mit Asthma bronchiale- z.Z. der Untersuchung ohne Glukokortikoidtherapie und 2 lungengesunde Patienten-Indikation:Karzinophobie) - 10 Patienten.

Die Diagnosestellung des SLE erfolgte unter Berücksichtigung der Kriterien der American Rheumatism Association (ARA, 85. ). Die SSc wurde nach den Kriterien der Arbeitsgemeinschaft Dermatologische Forschung diagnostiziert ( 51 ). Die Kriterien zur Diagnose der Sarkoidose wurden von der World Association of Sarcoidosis and other Granulomatous Disorders formuliert: "Die Diagnose kann gestellt werden, wenn klinische und/oder radiologische Zeichen vorliegen, die mit einer Sarkoidose vereinbar sind, die Diagnose durch den Nachweis der charakteristischen, nicht verkäsenden, epitheloidzelligen Granulome gestützt wird und andere Erkrankungen mit Sarkoidose-ähnlichen Gewebsreaktionen ausgeschlossen sind" ( 52 ). Dementsprechend wurde die Diagnose in der Synopsis der klinischen, paraklinischen und BAL-Befunde gestellt.

Charakterisierung des Krankengutes:

  1. Durchschnittsalter (Angaben Mittelwert ! SD):
    Gesamtkollektiv: 45,4 ! 16,3; Sarkoidose: 39,6 ! 17,2; SSc: 50,0 ! 12,6; SLE: 44,0 ! 15,1 Kontrollgruppe: 43,0 ! 12,4.
  2. Geschlechtsverteilung:
    Gesamtkollektiv: 18 m/32 w, Sarkoidose: 12 m/7 w, SSc: 2 m/15 w, SLE: 4 w, Kontrollgruppe: 4 m/6 w.
  3. Tabakkonsum:
    Gesamtkollektiv: 16 R/34 NR, Sarkoidose: 5 R/14 NR , SSc: 6 R/11 NR, SLE: 1 R/3 NR, Kontrollgruppe: 4 R/6 NR

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  4. Prednisolontherapie (max. 15mg/d):
    Gesamtkollektiv: 15 Patienten, Sarkoidose: 2 Patienten, SSc: 9 Patienten, SLE. 4 Patienten

2.2. Bronchoalveoläre Lavage

Die bronchoalveoläre Lavage wurde mit dem Fiberbronchoskop (FB18x bzw. 19x, Fa. Pentax, Japan) in Lokalanästhesie durchgeführt. Die Patienten erhielten als Prämedikation 0,5-1mg Atropin, zur Hustenstillung zusätzlich Hydrocodon.

Die BAL erfolgte bei allen Patienten im Mittellappen der Lunge. Das Bronchoskop wurde soweit in die Peripherie eingeführt, bis das Bronchiallumen durch die Instrumentenspitze abgedichtet war, um das Aspirieren zu ermöglichen (sogenannte "Wedge-Position“) . Durch den Instrumentierkanal des Bronchoskops wurden 150 ml sterile physiologische Kochsalzlösung (37°C), in Portionen zu je 20 ml instilliert, und mit derselben Spritze bei geringem Unterdruck zurückgewonnen. Die Flüssigkeit wurde in Plaströhrchen oder silikonisierte Gläser gefüllt, um ein Anheften der Zellen an die Gefäßwand zu verhindern, und so einen größeren Zellverlust zu vermeiden. Die weitere Verarbeitung erfolgte in der Kälte und so rasch wie möglich, meist unmittelbar nach Entnahme.

2.3. Aufbereitung der BAL und Herstellung von Zytozentrifugenpräparaten

Die bronchoalveoläre Flüssigkeit wurde zunächst durch zwei Lagen Spezialmull gefiltert, um sie von Schleimflocken zu befreien. Anschließend wurde die gewonnene Menge bei 400g 10min zentrifugiert (Beckman-Zentrifuge, GS-15R, Deutschland) und die so erhaltenen Zellen in 1000µl PBS gebracht. Die sich anschließende Zellzählung erfolgte nach Färben mit Türkscher Lösung in der Zählkammer nach Neubauer.

Die Zellsuspension wurde auf 1x106 Zellen/ml eingestellt und dann in der Zytozentrifuge (Cytospin 2, Fa. SHANDON, Deutschland) bei 400g 4min lang zentrifugiert. Die so gewonnenen Präparate wurden 2-12h luftgetrocknet und danach entweder bei


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-20°C zur Aufbewahrung in Alufolie eingefroren oder sofort mit Aceton fixiert und dann gefärbt.

Durch Tabakrauch stark braun verfärbte Lavagen wurden bereits an dieser Stelle aus der Studie herausgenommen, weil eine exakte Beurteilung der später entstehenden roten Reaktionsprodukte unmöglich war.

2.4. Darstellung der immunhistochemischen Methode

2.4.1. Charakterisierung der verwendeten Antikörper: CD4, CD8, 27E10, G16/1, RM3/1, CD36 und CD68,KP1

Antikörper CD4

Der Antikörper DAKO-CD4, MT310 (DAKOPATTS, Dänemark) ist ein monoklonaler IgG1 Maus-Antikörper, der mit einem Protein reagiert, das sich auf menschlichen Lymphozyten der T-Helferzellen-Subpopulation befindet und das auch als Rezeptor für HIV fungiert ( 56 ). Das mit CD4 determinierte Antigen wurde ebenso auf Zellen mit Monozyten-/ Makrophagenursprung gefunden ( 98 ). Die Funktion des CD4- Moleküls besteht in der Mitwirkung bei der Antigenpräsentation, es fungiert als Korezeptor für MHC- Klasse- II- Moleküle ( 47 ). Der Antikörper wurde in der Verdünnung 1:100 verwendet.

Antikörper CD8

Der monoklonale IgG1 Maus-Antikörper DAKO-CD8, DK25 (DAKOPATTS, Dänemark) detektiert ein Molekül, das sich auf zytotoxischen T-Zellen und T-Suppressorzellen befindet ( 54 ). Er reagiert auch mit Sinuszellen der menschlichen Milz. Der Antikörper kam in einer Verdünnung von 1:50 zum Einsatz.

Antikörper 27E10

Dieser von ZWADLO und Kollegen 1986 vorgestellte IgG1 Antikörper der Spezies Maus (BMA, Schweiz) ist ein Marker zur Charakterisierung von Makrophagen in der Frühphase der Entzündung. Das detektierte Antigen wurde auf etwa 20% der peripheren Blutmonozyten gefunden. Der Antikörper reagiert nicht mit Thrombozyten


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und Lymphozyten, mit etwa 15% frisch isolierter Granulozyten wird eine Kreuzreaktion beschrieben ( 100 ). In Gefrierschnitten von Haut, Lunge und Kolon wurde keine Reaktion des Antikörpers beobachtet, wohl aber mit Monozyten-ähnlichen Zellen in Leber und Milz. Bei vorliegender Entzündung, wie z.B. Kontaktekzem, Urtikaria, Psoriasis vulgaris und Parodontitis reagiert 27E10 mit Monozyten/Makrophagen und mit einigen endothelialen und epidermalen Zellen. Deshalb wird der Antikörper 27E10 für wissenschaftliche Studien des Entzündungsprozesses bei Urtikaria und Gingivitis und zur Charakterisierung des Entzündungsstadiums pulmonaler Infektionen mittels Phenotypisierung von Alveolarmakrophagen aus der BAL verwendet (Produktinformation). Der Antikörper BMA 27E10 wurde in einer Verdünnung von 1:100 eingesetzt.

Antikörper G16/1

Dieser IgG2 Antikörper (BMA, Schweiz) stammt nicht von der Maus sondern von der Ratte, was bei der hier verwendeten APAAP-Methode die Verwendung eines zusätzlichen Maus-Anti-Ratte-Brückenantikörpers erforderte. Er kann gemeinsam mit 27E10 und RM3/1 zur Phenotypisierung von Makrophagen eingesetzt werden. Das detektierte Antigen befindet sich auf der Oberfläche und im Zytoplasma von Makrophagen im chronischen Entzündungsstadium und wurde z.B. bei BCG-Granulomen, Melanomen und Sarkoidose gefunden (Produktinformation). G16/1 wurde 1:20 verdünnt angewendet.

Antikörper RM3/1

Dieser IgG1 Maus- Antikörper (BMA, Schweiz) charakterisiert vor allem die Heilungsphase der Entzündung. Die Expression des zugehörigen Antigens wird außerdem durch Glukokortikoide induziert ( 100 ). Das erfaßte Antigen befindet sich auf Monozyten und Makrophagen, nicht auf Lymphozyten, Granulozyten und Thrombozyten. Die Einsatzmöglichkeiten entsprechen denen von 27E10 und G16/1. Der Antikörper kam 1:50 verdünnt zur Anwendung.


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Antikörper CD68,KP1

Es wurde der monoklonale IgG1 Maus -Antikörper DAKO-CD68,KP1 (DAKOPATTS, Dänemark) verwendet. KP1 kennzeichnet die meisten Makrophagen in verschiedenen Geweben, ähnlich wie eine Gruppe anderer Antikörper, zu der Ki-M6, Ki-M7, EBM 11 und Y1/82A gehören ( 60 ). Im Gegensatz zu diesen ist CD68,KP1 für die Routinediagnostik anwendbar, da er ein Epitop erkennt, das gegen normale Fixierungen, z.B. mit Formalin, resistent ist ( 68 ). Das CD68-Molekül findet sich in zytoplasmatischen Granula von Monozyten, Makrophagen, neutrophilen und basophilen Granulozyten ( 69 ). Der hier verwendete Antikörper CD68,KP1 reagiert nicht mit Lymphozyten und Thrombozyten ( 68 ). Die bisher wenig bekannten plasmazytoiden Monozyten, früher auch plasmazytoide T-zellen genannt, werden mit Hilfe dieses Antikörpers identifiziert und von anderen Zellen wie monozytoiden B-Zellen und Plasmazellen differenziert ( 50 , 26 , 30 ).Der Antikörper wurde 1:200 verdünnt.

Antikörper CD36

Der Maus-Antikörper (DIANOVA, Deutschland) detektiert ein Antigen, das mit dem Thrombospondin Rezeptor (sehr früher Marker der erythrozytären Differenzierung) korrespondiert. Thrombospondin ist ein Glykoprotein, das als Adhäsionsmolekül entweder in der Rezeptor-Molekül-Rezeptor-Interaktion oder in der Verbindung zu anderen adhäsiven Proteinen fungiert ( 2 ).

Der Antikörper agglutiniert fetale Erythrozyten und reagiert mit adulten und fetalen Monozyten, Thrombozyten und Retikulozyten, nicht mit Lymphozyten und Granulozyten ( 23 ). Darüberhinaus wird eine Reaktion mit plasmazytoiden T-Zellen beschrieben ( 7 , 29 ).

Nachdem plasmazytoide Monozyten in vorliegender Studie mittels CD68,KP1 in der BAL identifiziert werden konnten, wurde CD36 zur Bestätigung verwendet. Dieser Antikörper schien geeignet, da eine Reaktion mit anderen lymphoiden Zellen ausgeschlossen ist und die Reaktion mit plasmazytoiden Monozyten durch Studien mehrerer Autoren gesichert wurde ( 7 , 8 , 50 , 29 ). Da nicht von allen Patienten Reservepräparate zur Verfügung standen, konnten Lavagen von nur 15 Patienten (Sarkoidose n=7, SSc


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n=8) mit diesem Antikörper untersucht werden, ein Vergleich zur Kontrollpopulation im Sinne einer Signifikanzprüfung war somit nicht möglich.

Tabelle 2: Zusammenfassende Übersicht der verwendeten Antikörper

Antikörper

Herkunft

Spezifität

Verdünnung

CD4

dako*

T-Helferzellen, Makrophagen

1:100

CD8

dako

zytotoxische und Suppressor -T-Zellen, Thymozyten

1:50

27E10

BMA°

Makrophagen, Monozyten und Granulozyten in der frühen Entzündungsphase

1:100

G16/1

BMA

Makrophagen in der chronischen Entzündungsphase

1:20

RM3/1

BMA

Makrophagen und Monozyten in der Heilungsphase

1:50

CD68,KP1

dako

Makrophagen, Monozyten, Granulozyten, plasmazytoide T-Zellen

1:200

CD36

dia^

Monozyten, Megakaryozyten, Thrombozyten, Retikulozyten, plasmazytoide Monozyten

1:100

*dako: Firma DAKOPATTS, Glostrup, Dänemark

°BMA: Firma BMA, Schweiz

^dia : Firma dianova-immunotech Vertriebsgesellschaft mbH, Hamburg, Deutschland


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2.4.2. Alkalische Phosphatase Anti-Alkalische Phosphatase-Methode (APAAP)

Zunächst wurden mit den monoklonalen Antikörpern Verdünnungsreihen getestet, um die für die lichtmikroskopische Auswertung der Lavagezellen optimale Darstellung zu ermitteln.

Die Alkalische Phosphatase Anti -Alkalische -Phosphatase -Methode (APAAP), erstmals 1984 ausführlich von CORDELL und Mitarbeitern beschrieben, beruht auf folgendem Prinzip: Ein Anti-Maus-Immunglobulin-Brückenantikörper verbindet den primären monoklonalen Antikörper mit einem Immunkomplex, der aus intestinaler alkalischer Phosphatase (vom Kalb) und einem monoklonalen Antikörper gegen dieses Enzym besteht. Die Sichtbarmachung der gebundenen alkalischen Phosphatase kann mit Neufuchsin oder mittels Naphtol Salz als koppelndes und Fast Red als ”färbendes“ Agens erfolgen, wobei sich deutlich rot gefärbte Reaktionsprodukte bilden, die unter dem Mikroskop leicht erkennbar sind ( 16 ), s. Abbildung 1.

Abbildung 1: Prinzip der APAAP-Methode


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Zur Herstellung der Präparate wurde in vorliegender Studie wie folgt vorgegangen:

  1. Präparate 10 min in Aceton fixieren, 5 min lufttrocknen
  2. Verdünnung des monoklonalen Primärantikörpers (s. Tabelle.2) mit Puffer A
    Puffer A =
    - 10% foetales Kälberserum (FKS)
    - 10% Rinderserumalbumin (RSA)
    - PBS, (z.B. 5ml PBS, 0,5ml FKS, 0,5g RSA)
  3. Überschichten der Zellen mit je 100ml des verdünnten Antikörpers, Inkubation in feuchter Kammer für 60min
  4. Coverplates und Objektträger in Sequenza (Firma SHANDON, Deutschland) einsetzen
  5. Waschen 5min mit 2ml Waschpuffer
    Waschpuffer=
    - Tris 7,6 pH 0,5 molar Stammlösung: Tris(hydroxymethyl)aminomethan
    - Merck 8382
    - 60,6g/1l NaCl, einstellen auf pH 7,6
    - Gebrauchswaschlösung: 50ml Stammpuffer + 450ml phys. NaCl
  6. je 100ml Brückenantikörper in die Cover-plate-Öffnung pipettieren, 30min Reaktionszeit
    1ml Brückenantikörper =
    - 200µl AB-Serum inaktiviert (30min 56°C)
    - 760µl Waschpuffer
    - 40µl Anti-Maus-Immunglobulin (Rabbit immunoglobulin to mouse
    - immunoglobulin DAKO Code Z 259)
  7. 5min waschen
  8. je 100µl verdünnten APAAP-Komplex pipettieren, 30min Reaktionszeit
    APAAP-Komplex=
    - Alkalische Phosphatase and monoklonale Maus-Anti-Alkalische- Phosphatase DAKO Code D 651 (1:50 mit Waschpuffer verdünnt)
  9. 5min waschen

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  10. Wiederholung der Schritte 6-8 bei einer Reaktionszeit von 10min, mit dem Ziel, die Färbung zu verstärken
  11. Phosphatase-Reaktion, je 100ml Substrat 2, Reaktionszeit 20min
    Substrat 2 =
    - 49ml Tris-Puffer pH 8,2 0,1m
    - 1ml Gemisch Dimethylformamid Merck 2937 +10mg NaphtholAS-MX Phosphat Sigma No N 4875
    - 50µl Levamisol Sigma L 9756 (zur Hemmung der endogenen Phosphatase)
    - 50mg Fast Red TR Salt Sigma No F 1500
  12. 5min waschen
  13. Gegenfärbung mit Hämalaun-Lösung Merck 9249, 10min
  14. 5min waschen
  15. Objektträger aus den Coverplates entfernen und 10 min unter fließendem Leitungswasser abspülen
  16. Lufttrocknen
  17. Eindecken mit angewärmten Glycergel Dako Code Nr. C 563.

2.5. Auswertung der Präparate

Die so angefertigten Präparate wurden mit dem Lichtmikroskop (Firma Carl-Zeiss-Jena, Deutschland) unter Zuhilfenahme der Ölimmersion ausgewertet. Pro Präparat wurden 1000 Zellen ausgezählt. Die Zellen wurden zur Ermittlung des BAL-Differentialzellbildes in Alveolarmakrophagen, Lymphozyten und Granulozyten unterteilt. Das Kriterium zur Unterscheidung der letzteren beiden Zellarten war die Kernmorphologie, insbesondere die Segmentierung der Kerne. Es wurde keine Pappenheim-Färbung vorgenommen, deshalb erfolgte keine Unterteilung der Granulozyten in Subpopulationen. Konnten die Zellen aufgrund starker Färbung der APAAP-Präparate nicht eindeutig klassifiziert werden, wurden sie nicht in die Auswertung einbezogen. Die Differenzierung der Zellen erfolgte für jeden Patienten an allen angefertigten Präparaten (meist 6, bei Verwendung von CD36 7 Präparate). Die so erhaltenen Ergebnisse wurden gemittelt.


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Alveolarmakrophagen und Lymphozyten wurden je nach erfolgter oder fehlender Reaktion mit den verwendeten Antikörpern in positive und negative Zellen eingeteilt. Die Zählungen erfolgten stets durch den gleichen Untersucher.

2.6. Biostatistische Analyse

Zur Darstellung der Ergebnisse wurden die Mittelwerte und die dazugehörigen Standardabweichungen berechnet.

Die Berechnungen von Signifikanzen und Korrelationen erfolgten mit dem Statistikprogramm SPSS/PC. Die Ergebnisse der Zellzählungen unterlagen nicht der Normalverteilung, deshalb wurden parameterfreie Tests verwendet. Die Differenzen der Mittelwerte in allen Gruppen wurden zunächst mit dem Kruskal-Wallis-Test auf Signifikanz geprüft. Bei mit diesem Test nachgewiesener Signifikanz wurden die Mittelwerte der betrachteten Kollektive in bezug auf die Kontrollpopulation mit dem Mann-Whitney-U-Test verglichen. Abhängigkeiten wurden mittels Korrelationskoeffizient nach Pearson geprüft.

Es wurde eine Irrtumswahrscheinlichkeit von 0,05 für die Einordnung als signifikant zugrunde gelegt.

Die Textverarbeitung erfolgte mit Hilfe des Programms MICROSOFT WORD 6.0, grafische Darstellungen wurden mit EXCEL 5.0 bzw. COREL DRAW 4.0 angefertigt.


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