Mahlig, Kirsten: Der Nachweis von Plasmazytoiden Monozyten in der Bronchoalveolären Lavage - Methodik und klinische Bedeutung

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Kapitel 3. Ergebnisse

Das an 50 Patienten erhobene Zahlenmaterial wurde unter verschiedenen Aspekten ausgewertet. Nach Darstellung der BAL-Ergebnisse hinsichtlich der Zellzahl und des Differentialzellbildes erfolgte die solitäre Betrachtung der Zellpopulationen plasmazytoide Monozyten, Alveolarmakrophagen und Lymphozyten. Entsprechend der Aufgabenstellung sollte die Antigenexpression dieser Zellen in Abhängigkeit von der Art der Erkrankung und des Tabakkonsums untersucht werden. Das Patientengut wurde deshalb wie folgt gruppiert:

Gruppe 1: nach Art der Erkrankung

  1. Sarkoidose n=19
  2. systemische Sklerose n=17
  3. systemischer Lupus erythematosus n=4
  4. Kontrollpopulation (s. 2.1.) n=10

Der Vergleich mit der Kontrollpopulation erfolgte, um den Einfluß des interstitiellen Krankheitsprozesses auf die Antigenexpression zu ermitteln. Signifikanzprüfungen unterschiedlicher Ergebnisse bei interstitiellen Erkrankungen wurden mit dem Ziel vorgenommen, krankheitsspezifische Faktoren zu verifizieren.

Gruppe 2: nach dem Tabakkonsum

Die Einteilung erfolgte in Raucher und Nichtraucher, das Kollektiv interstitieller Erkrankungen wurde weiterhin getrennt von der Kontrollpopulation betrachtet:

  1. Raucher
    -ILD n=12
    -Kontrollpopulation n=4
  2. Nichtraucher-ILD n=28
    -Kontrollpoulation n=6


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3.1. Deskription morphologischer Beobachtungen

Die lichtmikroskopischen Bilder der Zytozentrifugenpräparate zeigten überwiegend Alveolarmakrophagen und lymphoide Zellen, wenig Granulozyten, vereinzelte Epithelzellen (aus der Bronchialschleimhaut) kamen vor.

Die Alveolarmakrophagen erwiesen sich als sehr vielgestaltig hinsichtlich ihrer Größe und Form und waren z.T. mit Rauchbestandteilen, insbesondere Ruß beladen. Sie enthielten einen oder mehrere Zellkerne. Die Anfärbung der Makrophagen mittels monoklonaler Antikörper erfolgte in unterschiedlicher Intensität, es entstanden schwach rötlich bis kräftig rot gefärbte Reaktionsprodukte als Ausdruck der erfolgten Antigen-Antikörper-Reaktion. Es wurden nur deutlich gefärbte Zellen zur Auswertung herangezogen, wobei keine graduelle Unterteilung erfolgte, sondern in positive und negative Zellen kategorisiert wurde.

Die Epitope für die Antikörper auf den Lymphozyten befanden sich häufig auf der Membran, was diesen Zellen in einigen Fällen ein sternförmiges Aussehen verlieh. Viele Lymphozyten zeigten nur kleine oder mittelgroße fleckförmig gefärbte Bereiche. Die Unterscheidung von positiven und negativen Lymphozyten war eindeutiger möglich als bei den Makrophagen, da die Intensität der Färbung weniger stark variierte.

Mittels CD68,KP1 und CD36 wurden plamazytoide Monozyten sowohl in der BAL von Patienten mit interstitiellen Lungenerkrankungen als auch bei den Kontrollpatienten determiniert. Diese Zellen unterschieden sich morphologisch nicht von Lymphozyten. Darüberhinaus gelang der Nachweis Makrophagen-assoziierter Antigene auf lymphoiden Zellen, mit den Antikörpern 27E10, G16/1 und RM3/1. Es sei an dieser Stelle bereits gesagt, daß es sich bei diesen Zellen mit hoher Wahrscheinlichkeit ebenfalls um plasmazytoide Monozyten handelte (Abbildung 2 u. 3).


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Abbildung 2: Lichtmikroskopisches Bild des Zytozentrifugenpräparates von BAL-Zellen unter Verwendung des Antikörpers CD68, KP1. Starke Reaktion der plasmazytoiden Monozyten (Pfeile), keine morphologischen Unterschiede zu Lymphozyten. Ebenfalls starke Reaktion der meisten Makrophagen. 160-fache Vergrößerung.

Abbildung 3: Monoklonaler Antikörper G16/1: Antigen-Antikörperreaktion mit einigen Makrophagen. Keine Reaktion mit Lymphozyten, mit Ausnahme zweier größerer lymphozytenähnlicher Zellen (Pfeile): plasmazytoide Monozyten. 160-fache Vergrößerung.


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3.2. BAL-Gesamtzellzahl und -Differentialzellbilder

Gesamtzellzahl

Die in der rückgewonnenen BAL-Flüssigkeit registrierte Gesamtzellzahl verhält sich im Patientengut wie folgt (Tabellen 3 und 4):

Gruppe 1:

Tabelle 3: Gesamtzellzahl in der BAL

Erkrankung

n

Gesamtzellzahl (in 106 Zellen/ml)

Sarkoidose

19

7,4 ! 7,3

SSc

17

6,6 ± 5,7

SLE

4

3,3 ± 4,5

Kontrolle

10

4,9 ± 7,2

Die Gesamtzellzahlen unterscheiden sich nicht signifikant (p=0,46, Kruskal-Wallis-Test). Sie befinden sich innerhalb der von Costabel (1985) angegebenen Norm von 7!3 Mill. Zellen/ml.

Gruppe 2:

Die Gesamtzellzahlen in der Gruppe der Raucher und Nichtraucher sind der Tabelle 4 zu entnehmen.

Tabelle 4: Gesamtzellzahl in der BAL bei Rauchern und Nichtrauchern (Zellen x 106/ml)

ILD

Kontrolle

Raucher

8,3 ± 7,2 * (n=12)

8,2 ± 10,6 (n=4)

Nichtraucher

4,6 ± 4,0 (n=28)

2,3 ± 1,0 (n=6)

*p<0,05 (Raucher gegen Nichtraucher ILD, Mann-Whitney)

Es ist sowohl in der Gruppe der interstitiellen Lungenerkrankungen als auch in der Kontrollgruppe eine Erhöhung der Zellzahl bei Rauchern gegenüber Nichtrauchern


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erkennbar, ein signifikanter Unterschied liegt in der ILD-Gruppe vor (p=0,03, Mann-Whitney).

BAL-Differentialzellbilder

Es erfolgte eine Differenzierung in Alveolarmakrophagen, Lymphozyten und Granulozyten.

Gruppe 1:

Die BAL- Differentialzellbilder werden in Tabelle 5 dargestellt.

Tabelle 5: BAL-Differentialzellbilder bei Sarkoidose, SSc und SLE (in % der Gesamtzellzahl)

Makrophagen

Lymphozyten

Granulozyten

Sarkoidose (n=19)

76,1 ± 15,5

22,3 ± 16,1*

1,6 ± 1,4

SSc (n=17)

86,2 ± 13,4

9,5 ± 7,2

4,3 ± 4,2*

SLE (n=4)

81,0 ± 9,0

15,1 ± 9,6

3,9 ± 1,3*

Kontrolle (n=10)

90,3 ± 17,0

8,8 ± 5,2

0,9 ± 1,0

*p<0,05 (Signifikanz zur Kontrollgruppe, Mann-Whitney)

Der prozentuale Anteil der Lymphozyten an der Gesamtzellzahl ist bei Sarkoidosepatienten signifikant erhöht. Nach den Normwerten der Deutschen Gesellschaft für Pneumologie ist die Lymphozytenzahl beim SLE leicht erhöht. Die Granulozyten sind bei Sklerodermie- und Lupuspatienten signifikant vermehrt.

Gruppe 2:

Bei Rauchern und Nichtrauchern waren die Lymphozyten wie folgt an der Gesamtzellzahl beteiligt (Tabelle 6.):


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Tabelle 6: Anteil der Lymphozyten an der Gesamtzellzahl bei Rauchern und Nichtrauchern (in % der Gesamtzellzahl)

ILD

Kontrolle

Raucher

6,3 ± 4,3 **(n=12)

6,0 ± 3,5 (n=4)

Nichtraucher

21,6 ± 11,5 (n=28)

10,1 ± 4,3 (n=6)

**p=0,002 (Raucher gegen Nichtraucher ILD, Mann-Whitney)

Es besteht eine signifikante Verringerung der Lymphozytenzahl bei rauchenden Patienten in der ILD-Gruppe gegenüber Nichtrauchern der gleichen Gruppe. Die Ergebnisse der Kontrollgruppe stellen sich ähnlich dar, Signifkanz konnte nicht nachgewiesen werden. Die Anzahl der Alveolarmakrophagen ist bei Rauchern stark erhöht, da der Anteil an Granulozyten sich mit dem Rauchen nicht änderte.

3.3. Reaktionen plasmazytoider Monozyten

3.3.1. Antigenexpression für CD68,KP1 und CD36 bei interstitiellen Lungenerkrankungen

Wie bereits erwähnt (s.3.1.), wurden in der vorliegenden Untersuchung positive Reaktionen von lymphoiden Zellen mit Makrophagen-assoziierten Antikörpern beobachtet. Nach ausführlichen Literaturstudien und unter Beachtung der Spezifität der Antikörper CD68,KP1 und CD36 konnte konstatiert werden, daß diese Zellen plasmazytoide Monozyten (früher: plasmazytoide T-Zellen ) sind.

Das morphologische Erscheinungsbild der plasmazytoiden Monozyten in den untersuchten Zytozentrifugenpräparaten entsprach dem der Lymphozyten. Aus diesem Grund wurde die Lymphozytenpopulation als Bezugsgröße gewählt. Die berechneten Mittelwerte verstehen sich somit als prozentualer Anteil antigenexprimierender Zellen an der Gesamtzahl lymphoider Zellen.


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CD68,KP1

Der Antikörper CD68,KP1 identifiziert neben Monozyten und Makrophagen auch plasmazytoide Monozyten ( 30 ). Mit Hilfe des Antikörpers gelang in der vorliegenden Studie der Nachweis dieser Zellen in der bronchoalveolären Lavage.

Der prozentuale Anteil plasmazytoider Zellen an der Gesamtzahl lymphoider Zellen differierte sehr stark innerhalb aller Lavagen, jedoch nicht krankheitsspezifisch. Immerhin fehlten die PM in keinem Präparat vollständig.

Folgende Mittelwerte wurden errechnet (in % aller lymphoider Zellen):

Sarkoidose

36,2 ± 18,9

SSc

34,0 ± 22,0

SLE

37,5 ± 8,2

Kontrollen

45,8 ± 23,7

Es bestehen keine signifikanten Unterschiede zwischen den Krankheitsgruppen.

CD68,KP1 reagierte von den verwendeten Markern am häufigsten mit plasmazytoiden Monozyten und als Makrophagenmarker mit den Alveolarmakrophagen. Vor dem Hintergrund eines in der Literatur vermuteten Zusammenhanges zwischen beiden Zellarten (Ursprung, Funktion, s. 1.3.), wurde versucht, eine Abhängigkeit zu ermitteln, es konnte jedoch keine signifikante Korrelation zwischen Alveolarmakrophagen und plasmazytoiden Monozyten, die das CD68-Molekül tragen, hergestellt werden. Auch zwischen T-Helferzellen bzw. zytotoxischen -Zellen oder der CD4/CD8-Ratio und CD68-positiven PM bestanden keine Korrelationen.

CD36

Der Antikörper CD36 wurde ebenso wie CD68,KP1 verwendet, um plasmazytoide Monozyten in der BAL nachzuweisen. Dieser Antikörper war deshalb geeignet, weil er einerseits mit PM reagiert und andererseits eine Reaktion mit Lymphozyten nicht erfolgt (s.1.1 und 2.4.).

CD36 kam erst zum Einsatz, nachdem die Reaktion lymphoider Zellen mit CD68 als Reaktion plasmazytoider Monozyten (s.oben) erklärt werden konnte. Die nachträgliche Untersuchung mit diesem Antikörper war somit nur in solchen Fällen möglich, in denen ungefärbte Reservepräparate zur Verfügung standen. Dies waren


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8 Lavagen von Sklerodermiepatienten (1Raucher) und 7 von Patienten mit Sarkoidose (3 Raucher).

Die durchschnittliche Anzahl positiver plasmazytoider Monozyten an der Gesamtzahl lymphoider Zellen betrug bei der Sarkoidose 14,3 ! 13,2%; bei der SSc 4,8 ! 3,0%. In 2 Lavagen (je 1 Sarkoidose und SSc) waren keine plasmazytoiden Monozyten vorhanden, die CD36 exprimieren.

Eine statistische Auswertung im Sinne eines Mittelwertvergleichs konnte aufgrund fehlender Reservepräparate der Kontrollpopulation nicht erfolgen. Eine Korrelation zwischen antigentragenden plasmazytoiden Monozyten und Alveolarmakrophagen bestand nicht.

3.3.2. Reaktionen lymphoider Zellen mit den entzündungsassoziierten Antikörpern 27E10,G16/1 und RM3/1

Die entzündungsassoziierten Antikörper 27E10, G16/1 und RM3/1 sind weitgehend Makrophagen-spezifisch und reagieren nach Angaben des Herstellers und Literaturangaben nicht mit Lymphozyten. Wie bereits dargelegt, konnten eindeutige positive Reaktionen lymphozytenähnlicher Zellen mit diesen Markern nachgewiesen werden.

Die Antigenexpression in den verschiedenen Krankheitsgruppen unterschied sich für keinen der Antikörper signifikant. Die prozentualen Anteile der positiven Zellen an der Lymphozytenpopulation sind der Tabelle 7 zu entnehmen.

Tabelle 7: Anteil der lymphozytenähnlichen Zellen, der mit den entzündungsassoziierten Antikörpern 27E10, G16/1 und RM3/1 positiv reagiert (in % aller lymphoider Zellen)

Erkrankung

27E10

G16/1

RM3/1

Sarkoidose (n=19)

7,1 ± 8,5

5,2 ± 5,7

7,6 ± 10,9

Sklerodermie (n=17)

11,1 ± 10,1

7,0 ± 10,6

6,2 ± 6,1

SLE (n=4)

12,3 ± 9,6

9,8 ± 10,8

4,5 ± 5,8

Kontrolle (n=10)

9,0 ± 12,4

2,6 ± 4,9

15,9 ± 19


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Auffällig ist der große Anteil RM3/1-positiver Zellen in der Kontrollgruppe im Gegensatz zu den interstitiellen Erkrankungen, der Unterschied ist statistisch nicht signifikant.

Entsprechend der Spezifität der entzündungsassoziierten Antikörper ist es als wahrscheinlich anzunehmen, daß die antigentragenden lymphoiden Zellen plasmazytoide Monozyten sind. Der Diskussion vorgreifend werden diese Zellen nachfolgend plasmazytoide Monozyten genannt.

3.3.3. Rauchen und Antigenexpression

Die Antigenexpression auf plasmazytoiden Monozyten ist für alle verwendeten Antikörper bei Rauchern im Gegensatz zu Nichtrauchern erhöht. Signifikanz ließ sich für alle Antikörper bis auf CD68,KP1 nachweisen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 dargelegt.

Tabelle 8: Antigenexpression auf PM bei Rauchern und Nichtrauchern unter Verwendung von CD68,KP1, CD36, 27E10, G16/1 und RM3/1.

CD68,KP1

CD36

27E10

G16/1

RM3/1

Raucher

n=16

39,4 ± 11,7

19,1 ± 16,1*

17,1 ± 14,4*

9,3 ± 10,2*

16,6 ± 16,5*

Nichtraucher

n=34

33,8 ± 21,4

5,6 ± 3,8

5,2 ± 3,4

3,5 ± 5,1

4,3 ± 3,8

*p< 0,05 (Signifikanz für Raucher gegen Nichtraucher, Mann-Whitney)

Auffällig neben den Signifikanzen ist die starke Streuung der Werte. Um dieses Ergebnis anschaulich zu machen und dessen Eindeutigkeit trotz der großen Streuung darzustellen, sind in den folgenden Grafiken die Einzelwerte und Standardabweichungen für die entzündungsassoziierten Antikörper dargestellt. Für CD68,KP1 wurde wegen der fehlenden Signifikanz, für CD36 wegen des nur kleinen untersuchten Kollektivs darauf verzichtet.


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Abbildung 4: Anteil 27E10-positiver plasmazytoider Monozyten an der Gesamtzahl der Lymphozyten bei Rauchern und Nichtrauchern (in %), signifikante Erhöhung bei Rauchern

Abbildung 5: Anteil G16/1-positiver plasmazytoider Monozyten an der Gesamtzahl der Lymphozyten bei Rauchern und Nichtrauchern (in %), signifikante Erhöhung bei Rauchern


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Abbildung 6: Anteil RM3/1-positiver plasmazytoider Monozyten an der Lymphozytenpopu-lation bei Rauchern und Nichtrauchern (in %), signifikante Erhöhung bei Rauchern

Es bestand keine Korrelation zwischen positiven plasmazytoiden Monozyten und positiven Alveolarmakrophagen für den jeweiligen Marker.


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3.4. Charakterisierung der Alveolarmakrophagen mit den Antikörpern CD4, 27E10, G16/1, RM3/1, CD36 und CD68,KP1

3.4.1. Vergleich der Antigenexpression in Abhängigkeit von der Art der Erkrankung und der Therapie mit Glukokortikoiden

Die Untersuchung der Alveolarmakrophagen erfolgte mit dem Ziel, die Antigenexpression in Abhängigkeit von der Art der Erkrankung, vom Entzündungszustand der pulmonalen Gewebe und von der Therapie mit Kortikoiden darzustellen. Der prozentuale Anteil positiver Makrophagen an der Gesamtmakrophagenzahl bei Reaktion mit den Antikörpern CD4, 27E10, G16/1, RM3/1, und CD68 geht aus Tabelle 9 hervor.

Tabelle 9: Antigenexpression bei Sarkoidose, Sklerodermie und SLE (Angaben in % aller Makrophagen) bei Reaktion mit CD4, 27E10, G16/1, RM3/1, CD68

Erkrankung

CD4

27E10

G16/1

RM3/1

CD68

Sarkoidose

36,4 ± 25

32,7 ± 17,1

42,1 ± 24,6***

52,1 ± 20,4

80,9 ± 10,0

Sklerodermie

35,5 ± 20,8

29,6 ± 15,6

55,9 ± 19,0***

66,8 ± 10,4

77,2 ± 11,6

SLE

64,6 ± 5,3*

36,8 ± 14,5

26,0 ± 27,8

67,2 ± 10,5

82,1 ± 8,4

Kontrolle

43,4 ± 20,2

27,0 ± 7,6

10,5 ± 8,9

62,3 ± 13,4

80,8 ± 7,2

***p< 0,001,* p< 0,05 (Signifikanz zur Kontrollgruppe, Mann-Whitney)

Der erhöhte Anteil CD4-positiver Makrophagen beim SLE (*) stellt einen signifikanten Unterschied zur Kontrollgruppe dar (p=0,02).

Die Unterschiede für den Marker 27E10 (frühe Entzündungsphase) sind nicht signifikant (p=0,6, Kruskal-Wallis). Die Aussage dieses Markers bezieht sich auf die akute Entzündung und läßt ähnlich wie die CD4/CD8-Ratio der Lymphozyten eine Aktivitätsbeurteilung der Erkrankung zu. Zwischen diesen beiden Parametern findet sich zusätzlich eine signifikante positive Korrelation (p<0,01, r=0,49).

Der Anstieg G16/1-positiver Makrophagen ist bei Sarkoidose (***) und SSc (***) im Vergleich zur Kontrolle hochsignifikant (Sarkoidose p=0,0006, SSc p=0,0001).


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Der Antikörper RM3/1 wird besonders in der Heilungsphase einer Entzündung nachgewiesen und wird von Monozyten/Makrophagen verstärkt bei der Zufuhr von Glukokortikoiden exprimiert ( 100 ). In der Gruppe der Sarkoidosepatienten wurden zwei von 19 Patienten, bei den Kollagenosen 13 von 21 mit Prednisolon behandelt. Die Antigenexpression für RM3/1 bei erfolgter niedrigdosierter Prednisolontherapie zum Zeitpunkt der Untersuchung verhält sich wie folgt: mit Kortikoiden=64,4!8,3%, ohne Kortikoide=57,1!9,4% (Patienten mit Therapie n=15, ohne Therapie n=25), Signifikanz ließ sich nicht nachweisen.

3.4.2. Rauchen und Antigenexpression

Die Antigenexpression auf Alveolarmakrophagen unterscheidet sich bei Rauchern und Nichtrauchern für keinen Antikörper signifikant, obwohl die CD4-positiven Alveolarmakrophagen bei Rauchern im Gegensatz zu Nichtrauchern deutlich verringert sind.

Tabelle 10: Antigentragende Alveolarmakrophagen (in % aller Makrophagen) bei Rauchern und Nichtrauchern bei Reaktion mit CD4, 27E0, G16/1, RM3/1 und CD68

CD4

27E10

G16/1

RM3/1

CD68,KP1

Raucher

n=16

27,0 ± 25,3

28,2 ± 12,4

36,7 ± 27,6

61,5 ± 12,7

80,9 ± 9,3

Nichtraucher

n=34

45,1 ± 17,4

32,4 ± 16,1

39,4 ± 26,1

60,2 ± 18,4

79,8 ± 9,7

Bei Untergliederung der Raucher und Nichtraucher in Patienten mit interstitiellen Lungenerkrankungen und Patienten der Kontrollgruppe konnte für CD4 innerhalb dieser nun vier Gruppen mit dem Kruskal-Wallis-Test ein signifikanter Unterschied festgestellt werden, mit dem Mann-Whitney-Test ließ sich dieser Fakt nicht bestätigen.


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3.5. Charakterisierung der Lymphozytensubpopulationen

Der Vollständigkeit halber seien noch die Ergebnisse der Untersuchung an Lymphozyten dargelegt.

Es bestehen deutliche Unterschiede in der Anzahl zytotoxischer T-Zellen (CD8+) bei Sarkoidose und SSc im Vergleich zur Kontrollgruppe, Signifikanz ließ sich nur für die Sarkoidose feststellen (p=0,007). Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 zusammengefaßt.

Tabelle 11: CD8-und CD4-positive Lymphozyten bei Sarkoidose, SSc, SLE (in % der Gesamtlymphozytenzahl)

CD8

CD4

Sarkoidose (n=19)

24,6 ± 17,0**

45,0 ± 22,6

SSc (n=17)

30,4 ± 18,0

38,3 ± 21,2

SLE (n=4)

39,0 ± 13,5

40,2 ± 10,4

Kontrolle (n=10)

39,8 ± 15,6

43,9 ± 16,6

**p=0,007 (Signifikanz zur Kontrollgruppe, Mann-Whitney)

Die CD4/CD8-Ratio unterscheidet sich im untersuchten Kollektiv nicht signifikant und ist in allen Krankheitsgruppen niedrig: Sarkoidose=2,3 ± 1,6; PSS=2,3 ± 2,0; SLE=1,2 ± 0,6; Kontrolle=1,5 ± 1,4

Die Ergebnisse in Abhängigkeit vom Tabakkonsum sind in Tabelle 12 dargestellt.

Tabelle 12: CD8-und CD4-positive Lymphozyten bei Rauchern und Nichtrauchern ( in % der Gesamtlymphozytenzahl)

ILD,CD8

ILD,CD4

Kontrolle CD8

Kontrolle CD4

Raucher

27,2 ± 12,5 (n=12)

41,7 ± 20,1

38,9 ± 27,1

(n=4)

38,1 ± 26,9

Nichtraucher

28,4 ± 19,6 (n=28)

43,4 ± 22,0

40,4 ± 9,2

(n=6)

46,8 ± 11,0


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