Meißner, Wassilios: Vergleich verschiedener Konservierungslösungen in der Langzeitperfusion der Leber anhand klinisch-chemischer Parameter

12

Kapitel 2. Material und Methode

2.1. Versuchstiere

In unserer Studie machten wir insgesamt 24 Versuche (n = 24), zu denen jeweils eine weibliche Sau der Rasse ”Deutsche veredelte Landrasse“, Fa. Sommerfeld als Organspender zur Hepatektomie benötigt wurde. Das durchschnittliche Gewicht der verwendeten Tiere betrug 37,2 kg (± 16,2). Die Gewichtsunterschiede ergaben sich aufgrund des Altersunterschiedes der Versuchstiere, welcher zwei bis sechs Wochen betrug.

2.2. Versuchsablauf

Organentnahme

Vor der Hepatektomie müssen Vena jugularis interna und Arteria carotis interna präpariert werden, um einen Gefäßzugang für die Abnahme der klinisch-chemischen Parameter und die spätere Entblutung zu bekommen.

Die Hepatektomie wird nach einem standardisierten Verfahren durchgeführt, welches später ausführlich beschrieben wird.

Am Ende der Operation, nach erfolgter Kanülierung der Arteria hepatica communis und der Vena portae wird eine Flush-Konservierung durchgeführt. Mit jeweils einem Liter Belzer- UW-Lösung (Gruppe I, II, III) beziehungsweise jeweils zwei Litern der Gerlach A-FU-Lösung (Gruppe IV) werden Vena portae und Arteria hepatica communis perfundiert.

Kaltperfusion / Kaltlagerung

Die drei Gruppen II, III, IV werden nach der Hepatektomie bei 4 °C über ungefähr 44 Stunden in der Perfusionskammer nach Neuhaus kaltperfundiert. Hierbei kommen die Belzer-UW-, die HTK- und die Gerlach B-FU-Lösung als Perfusionsmedien zum Einsatz. Die Gruppe I (Kaltlagerung mit UW) wird über den gleichen Zeitraum in einer Kühlbox bei 4°C gelagert. Anschließend wird das kaltgelagerte Organ in die Perfusionsapparatur eingebracht, und es erfolgt wie bei den drei anderen Gruppen eine fünfstündige Warmperfusion.


13

Warmperfusion

An die Kaltperfusion schließt sich nahtlos die Warmperfusion an. Als Sauerstofftransportmedium dient das während der Operation gewonnene Blut, welches auf die physiologische Schweinekörpertemperatur von 38-39 °C erwärmt wird. In einem Verlauf von fünf Stunden werden in standardisierten, regelmäßigen Abständen die klinisch-chemischen Parameter gemessen.

2.3. Organentnahme

Präoperative Vorbereitung und Narkoseführung des Tieres

Vorbereitend werden die verwendeten Schweine während der letzten 12-16 Stunden nüchtern belassen. Dabei steht ihnen Trinkwasser frei zur Verfügung.

Vor der Narkose wird die Sau mit 3-4 mg/kg Körpergewicht Azaperon i.m. (Stresnil®, Fa. Janssen Pharmaceutica) sediert. Gleichzeitig erfolgt die Gabe von 0,5mg Atropinsulfat i.m. (Fa. B. Braun Melsungen), um einer Hypersalivation vorzubeugen. Nach erfolgreicher Sedation können nun 3-4 mg/kg Körpergewicht Metomidat-Hydrochlorid (Hypnodil®, Fa. Janssen Pharmaceutica) und 0,4 ml/kg Körpergewicht Fentanyl (Fentanyl®-Janssen, Fa. Janssen Pharmaceutica) über einen in einer Ohrvene plazierten Verweilkatheter verabreicht werden, der während der Operation zur Fortführung der Narkose genutzt wird. Damit hat die eigentliche Narkose begonnen. Nachfolgend wird das Versuchstier intubiert und beatmet. Während der Operation werden Lachgas (N2O) und Sauerstoff (O2) in einem Verhältnis von einem Liter zu zwei Litern bei einem Atemzugsvolumen von 500 ml zugeführt. Im Anschluß daran wird eine Magensonde eingebracht, die es ermöglicht, den trotz Nahrungskarenz häufig erheblichen Mageninhalt zu entfernen, um auf diese Weise mehr Übersicht im Bauchraum während der Hepatektomie zu gewinnen. Die Aufrechterhaltung der Narkose vollzieht sich per Neuroleptanaesthesie, wobei Fentanyl und Hypnodil als Dauermedikation in einer Dosierung von je nach Gewicht 4-6 ml/Stunde über ein Perfusorsystem gegeben werden. Zur Muskelrelaxation werden 4 mg Pancuroniumbromid (Pancuronium Curamed®-CuraMED Pharma) verabreicht. Bei Bedarf, in der Regel alle 15-30 Minuten, erfolgt die erneute Injektion von 4 mg Pancuronium über den Verweilkatheter in der Ohrvene zur Gewährleistung der Relaxation. Über die Ohrvene läuft während der Operation eine elektrolythaltige Tropfinfusion


14

(Jonosteril® 1/1 E, Fa. Fresenius). Als letzte vorbereitende Maßnahme vor der Öffnung des Bauchraumes werden die rechten Halsgefäße kanüliert, um Zugänge zum venösen und arteriellen System zu erhalten. Diese sind zur Durchführung der Leberfunktionstests und den Entnahmen der Blutproben sowie zum intraoperativen Monitoring der Kreislaufparameter notwendig. Zunächst wird ein ca. 10 cm langer Halsschnitt in kraniokaudaler Richtung zwischen Trachea und Musculus sternocleidomastoideus geführt. Als nächster Schritt folgt die Durchtrennung des Platysmas und die Präparation der Vena jugularis interna und der Arteria carotis interna, wobei diese meist sehr medial in der Nähe des Larynx zu finden ist. Nach sauberer Freilegung der Gefäße werden diese auf beiden Seiten angeschlungen, wobei kranial die Zirkulation durch Zuknoten unterbrochen wird. Nun werden die beiden Gefäße nacheinander mit einer schräg angeschnittenen Heidelberger Verlängerung kanüliert und an einen Dreiwegehahn angeschlossen.

Hepatektomie

Das Abdomen wird durch einen Mittelschnitt unter Umgehung der Umbilikalgefäße vom Processus xiphoideus bis in die suprapubische Region eröffnet. Nach Einsetzen eines Bauchsperrers wird die Milz in ein Bauchtuch eingeschlagen und nach dorsal weggeschwenkt. Nun wird das Lig. hepatoduodenale aufgesucht und der Ductus choledochus präpariert und kanüliert. Die Kanülierung erfolgt mit Hilfe eines PVC-Schlauches, der mit einem Auffanggefäß verbunden ist. Die sezernierte Galle wird über eine Stunde gesammelt mit anschließender Mengenbestimmung. Während desselben Operationsschrittes werden die Arteria cycstica und der Ductus cysticus gallenblasennah ligiert. Das Lig. hepatoduodenale mit der Vena portae und Arteria hepatica communis wird weiter in die Richtung des Truncus coeliacus in einer Länge von 5 cm freipräpariert. Kleine Abgänge werden verödet, größere ligiert. Anschließend werden die Lebergefäße doppelt angeschlungen. Dies ist eine vorbereitende Maßnahme zur späteren Kanülierung. Es folgt die Mobilisierung der Leber an ihren fixierten Punkten dem Lig. coronarium, den Ligg. triangularia sin. et dextr. und dem Lig. falciforme.

Im Bereich des Diaphragmas wird zirkulär um den suprahepatischen Teil der Vena cava inf. sorgfältig koaguliert, um diesen freizulegen, wobei größere zuführende Gefäße ligiert werden. Nach gelungener Präparation wird die Vena cava inf. subdiaphragmal ebenfalls angeschlungen. Infrahepatisch wird gleichermaßen verfahren mit dem Ziel auch diesen Teil der Vena cava inf. anschlingen zu können. Die Entnahme zweier Biopsien von


15

unterschiedlichen Leberlappen zur histologischen Aufarbeitung ist vor der Kanülierung durchzuführen.

Am Ende der Operation wird nach venöser Gabe von 200 IE/kg Körpergewicht Heparin (Liquemin® N 25000, Fa. Hoffmann-La Roche) das Versuchstier über den arteriellen und venösen Zugang entblutet. Nachdem ca. 1000 ml Blut über den Konservenbeutel abgelaufen sind, werden die doppelt angeschlungenen Vena portae und Arteria hepatica comm. leberfern ligiert und lebernah kanüliert. Bei der Arteria hepatica communis wird derjenige Silikonschlauch zur Kanülierung verwendet, der auch zur anschließenden Kalt- und Warmperfusion in der Perfusionskammer benutzt wird. Zur Konservierung der Vena portae wird ein Multiorgan-Perfusions-Katheter CH 24 (Fa. Fresenius) verwendet. Anschließend ist der suprahepatische und der infrahepatische Anteil der Vena cava inf. leberfern zu ligieren und lebernah zu durchtrennen. Dadurch wird verhindert, daß während der anschließenden Flush-Konservierung Perfusionslösung in den systemischen Kreislauf und folglich in die Eigenblutkonserve gelangt. Die Flush-Konservierung, bei der gleichzeitig beide kanülierte Gefäße perfundiert werden, kann beginnen. Währenddessen geht die Entblutung weiter. Noch während der Flushkonservierung wird das Organ entnommen und in einer mit sterilem Eiswasser gefüllten Schüssel gelagert, um die Abkühlung auf 4°C zu beschleunigen und die warme Ischämie möglichst auf ein Minimum zu begrenzen, wobei darauf geachtet wird, daß die Leber nicht in direkten Kontakt mit dem Eis gerät. Die Leber wird nach der Flush-Konservierung ohne Verletzung der Sterilität gewogen. Im Anschluß erfolgt die Vorbereitung des Flush-konservierten Organs zur Lanzeitperfusion.

Flush-Konservierung

Nach Kanülierung der Arteria hepatica comm. und der Vena portae werden beide Gefäße bei der UW-, der HTK- und der Kaltlagerungsgruppe jeweils mit 4°C kalter 1000 ml Belzer-UW- Lösung (ViaSpan®, Fa. DuPont-Pharma) über ein urologisches TUR-Schlauchset der Fresenius AG gespült, um im Leberkreislauf befindliches Blut zu entfernen und eine schnelle Abkühlung des Organs mit möglichst kurzer warmer Ischämiezeit zu erzielen. Die Arterie wird über eine Druckmanschette mit einem Druck von 180 mm Hg perfundiert. Neben diesen festen Bestandteilen wird ein Liter Flush-Lösung mit jeweils einem ml Heparin (Liquemin® N 25000, Fa. Hoffmann-La Roche)/l, einem ml Benzylpenicillin-Natrium (Penicillin G®, Fa. Grünenthal 1 Mega)/l, einem ml


16

Humaninsulin/l (H-Insulin-Hoechst®, Fa. Hoechst, 1 ml=40 IE) und einem ml/l Prednisolon-21-hydrogensuccinat (Soludecortin®, Fa. MERCK=25 mg/l Lösung) versetzt. Die Standard-UW-Lösung ist folgendermaßen zusammengesetzt (in mmol/l):

Tabelle 1: Zusammensetzung der Standard-UW-Lösung

Laktobionat

100

Raffinose

30

K-H2PO4/K-HPO4-

25

Mg-Sulfat

5

Glutathion

3

Adenosin

5

Allopurinol

1

HAES

50 g/l

pH=7,4, Osmolalität 320 mosmol/kg, Natrium 29 mmol/l, Kalium 125 mmol/l

In der FU-Gruppe wird mit jeweils 2000 ml der Gerlach A-FU-Lösung die Flush-Konservierung der Leber über die Arteria hepatica comm. und die Vena portae durchgeführt. Für die Gerlach A-FU-Lösung ergibt sich in mmol/l folgende Zusammensetzung :

Tabelle 2: Zusammensetzung der Gerlach A-FU-Lösung

Calcium

0,8

Magnesium

0,8

Chlor

ca.126,6

Sucrose

30

Tris max. auf 310 mosmol

20

Penicillin G

200000 IE/l

PH 7,4, Osmolalität 310-330 mosmol/kg, Natrium 120 mmol/l, Kalium 5 mmol/l


17

Die Eigenblutentnahme wird während der Flush-Konservierung fortgesetzt bis zum Eintreten des Herzstillstandes. Hiermit tritt der Tod des Versuchstieres ein. Im Anschluß erfolgt ein Verschluß der Laparatomie und eine versuchstiergerechte Entsorgung.

Vorbereitung des Flush-konservierten Organs zur Langzeitperfusion

Der Anschluß an die Perfusionskammer wird vorbereitet. Dabei werden nacheinander der suprahepatische Anteil der Vena cava inf. verschlossen, der infrahepatische Anteil und die Vena portae mit Silikonschläuchen kanüliert, die an ihren Enden mit Spiralen versehen sind. Diese sollen einer Embolisierung und Kollabierung entgegenwirken. Die Schläuche werden über eine halbmondförmige Anschlußplatte mit der Perfusionskammer verbunden und unter leichtem Zug gehalten, um eine hämodynamische Beeinträchtigung der Leberzirkulation durch Abknicken zu vermeiden. Die Arteria hepatica comm. ist, wie oben dargestellt, bereits vor der Flush- Konservierung mit einem Silikonschlauch versehen worden. Der schon während der Operation entsprechend mit einer Heidelberger Verlängerung kanülierte Ductus choledochus wird ebenfalls mit der Anschlußplatte verbunden. Die sezernierte Galle wird separat in einen Auffangbehälter abgeleitet.

Als letzte vorbereitende Maßnahme vor Anschluß an die Perfusionsapparatur werden die Gefäße und Schläuche mit der jeweiligen Perfusionslösung gefüllt, wobei auf die Entfernung etwaiger Luftblasen zu achten ist.

2.4. Aufbau der Perfusionsapparatur

Die Perfusionsapparatur besteht aus vier Rollerpumpen, einer abschließbaren Perfusionskammer aus Plexiglas mit einer Anschlußplatte zum Durchtritt für die mit den Gefäßen und dem Gallengang verbundenen Silikonschläuche, einem kleinem Reservebehälter zum Auffangen von lymphatischem Nebenfluß aus dem Beutel, einem Oxygenator mit Blutfilter und einem Dialysator. Dieser wird nur während der Warmperfusion eingesetzt.

2.4.1. Perfusionskammer

Die Leber wird in der Perfusionskammer in einem Isolationsbeutel aufgehangen, der das Organ vom umgebenden Wasser trennt. Die Kammer wird danach langsam mit Wasser aus einem Reservebehälter gefüllt. Die Perfusionskammer ist über ein Schlauchsystem mit einem Ausgleichsbehälter verbunden, der den Kammerdruck über einen angeschlossenen


18

Niveauregler registriert und reguliert. Bei zu hohem Druck in der Kammer wird über eine Ablaßpumpe Wasser abgepumpt, während bei zu niedrigem Druck über eine Füllpumpe Wasser zugeführt wird. Pegelschwankungen im Ausgleichsbehälter um einen Zentimeter entsprechen einer Wasserbewegung von 100 Millilitern. Neben diesen Mechanismen findet eine komplizierte Kammerdruckregulation statt, mit Hilfe welcher versucht wird, die intraabdominellen Druckverhältnisse während der normalen Atemexkursionen zu

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Aufbaus der Perfusionsapparatur mit Kammer, Blutpumpen und Regelkreisen

simulieren. Mit einer Frequenz von 6/Minute sendet ein Kammerdruckregler, der über einen Druckaufnehmer mit dem Ausgleichsbehälter in Verbindung steht, Impulse an eine Luftpumpe. Die Signale folgen einer Sinuskurve. Über eine Luftinsufflation ändert sich der Druck im Ausgleichsbehälter und somit auch in der Perfusionskammer.


19

2.4.2. Pumpen und Pumpenregulation

Die vier verwendeten Rollerpumpen gewährleisten die Kreislaufzirkulation. Mit ihrer Hilfe werden an der isolierten Leber physiologische Perfusionsverhältnisse simuliert mit arteriellem und gemischtvenösem Zufluß, sowie venösem Abtransport des Blutes aus der Leber.

Das oxygenierte Blut wird zu jeweils 150 ml/Minute der Arteria hepatica comm. über die Pumpe 1 und der Vena portae über die Pumpe 2 zugeführt. Die Vena portae bezieht über die Pumpe 3 aus dem venösen Schenkel zur Mischung weitere 300 ml/Minute, die nicht oxygeniert sind. Auf diese Weise zirkuliert in der die Vena portae gemischtvenöses Blut, was den physiologischen Verhältnissen entspricht. Insgesamt wird die Leber mit 600 ml/Minute perfundiert. Der venöse Abfluß aus der Leber erfolgt zu jeweils 300 ml/Minute über die Pumpe 3 für die venöse Beimischung zur Vena portae und über die Pumpe 4, die das Blut/Perfusat zum Dialysator befördert. Um eine gleichmäßige Perfusion des Organs auch bei schwankenden intrahepatischen Widerständen zu gewährleisten, müssen die Pumpen flexibel reguliert werden. Insofern müssen sie sich den veränderten Bedingungen anpassen können.

Den Pumpen 1 und 2 ist ein Druckaufnehmer nachgeschaltet, der den aktuellen Druck, den sogenannten Istdruck registriert. Dieser wird mit einem Solldruck verglichen, den der angeschlossene Rechner aus den intrahepatischen Druck- und Widerstandsverhältnissen ermittelt. Der Solldruck ist die berechnete Größe, bei der der vorgewählte Minutenfluß aufrechterhalten wird. In dem der Leber nachfolgenden venösen Schenkel befindet sich ein Niveauaufnehmer in einem Reservoir, der den Fluß der Pumpe 4 steuert und der die Pumpe 3 bei zu geringem posthepatischen Blutfluß stoppen kann. Diese Regulation ist aufgrund der enormen sinusoidalen Speicherkapazität der Leber notwendig, da sonst über ein leergepumptes Reservoir bei geringerem Rückfluß aus der Leber und gleichbleibender Pumpleistung Luft in das System eingebracht werden könnte. Eine arterielle und portalvenöse Luftembolie wäre die Folge.

Durch eine Druckspitzendämpfung im Verlauf des portalvenösen Schenkels werden durch die Pumpen hervorgerufene Druckspitzen geglättet. In der Regel pendelt der Druck für die Arteria hepatica comm. um 60 mm Hg und für die Vena portae um 15 mm Hg. Ein Druck von maximal 200 mm Hg arteriell und 30 mm Hg portalvenös wurde als Obergrenze betrachtet mit nachfolgender Gegenregulation auf Kosten der Organperfusion. Der


20

cavalvenöse Druck bewegt sich in der Regel um -2 mm Hg.

2.4.3. Oxygenator

Abbildung 2: Schematische Darstellung des Oxygenatorkreislaufs

Während der Kaltperfusion wird bei Fehlen von Sauerstoffträgern im zellfreien Medium eine physikalische Oxygenierung durchgeführt. Während der Warmperfusion durchfließen den Oxygenator (VPCML Plus, Fa. COBE) 300 ml/Minute Blut, die bereits den Dialysekreislauf passiert haben. Die Oxygenierungsparameter sind auf 200 ml/Minute O2 und auf 100 ml/Minute Carbogen (95% O2, 5% CO2) eingestellt. Das oxygenierte Blut/Perfusat sammelt sich anschließend in einem Reservoir. Vor der Perfusion der Leber mit dem oxygenierten Blut/Perfusat findet eine Filterung statt.

2.4.4. Dialysator

Zur Aufrechterhaltung des milieu intérieur während der Warmperfusion dient die Dialyse. Verwendung findet ein Alwall GFS 12 Blood fiber Dialyzer (Fa. Gambrio). 300 ml der sich in einem Dialysatbehälter befindenden 4500 ml Dialysats (SH 01, Fa.) zirkulieren in der Minute, angetrieben von einer Pumpe. Diese Flußrate kann bei Bedarf verändert werden. Auf der venösen Seite fließen in der Regel ebenfalls 300 ml/Minute.


21

Abbildung 3: Schematische Darstellung des Dialysekreislaufs

2.4.5. Temperaturregulation

Vier Wärmeaustauscher halten die gewünschte Temperatur aufrecht. Einer befindet sich im Dialysatbehälter, einer im Blutfilter, einer in dem mit der Kammer verbundenden Wasserbehälter und einer in der Perfusionskammer selbst.

Im Prinzip gibt es drei Temperaturmodi. Während der Kaltperfusion sind die Perfusat- und die Kammertemperatur auf den Sollwert von +4°C eingestellt. In der Erwärmungsphase unmittelbar im Anschluß an die Kaltperfusion wird versucht, in kürzester Zeit die für die Warmperfusion angestrebten Temperaturen zu erreichen. In diesem dritten Temperaturmodus ist die Perfusionskammer auf einen Sollwert von 38°C und das Blut auf 39°C eingestellt.

2.5. Kaltperfusion

Der Beginn der Kaltperfusion ist definiert als Zeitpunkt, an dem die Blutpumpen 1 und 2 gestartet werden. Die kalte Ischaemiezeit zwischen Ende der Flush-Konservierung und Beginn der Kaltperfusion endet hier. Die Leberperfusion beginnt. Die Kaltperfusion endet mit dem Ablassen des Perfusats aus dem Reservoir. Durch die niedrige Temperatur während der Kaltperfusion soll der Leberstoffwechsel reduziert werden, um den zu erwartenden Perfusionsschaden auf ein Minimum zu begrenzen. Es erfolgt eine regelmäßige Kontrolle der physikalisch gelösten Gase. Serumentnahmen nach acht,


22

sechzehn, vierundzwanzig, zweiunddreißig und vierzig Stunden postoperativ dienen der Aufzeichnung von Veränderungen in den klinisch-chemischen Parametern während der Kaltperfusion.

Die für die UW-, FU- und HTK-Gruppe verwendeten Perfusionslösungen zirkulieren im Kreislauf der beschriebenen Apparatur über einen Zeitraum von ungefähr 44 Stunden bei 4°C. Die Zusammensetzungen der verschiedenen Lösungen werden im Abschnitt Versuchsgruppen , Seite 25 ausführlich erläutert. Am Ende der Kaltperfusion wird das zellfreie Effluat verworfen mit nachfolgender Warmperfusion.

2.6. Kaltlagerung

Die Kaltlagerung wird mit sechs Schweinelebern als Kontrolle zu den kontinuierlich perfundierten Lebern durchgeführt. Präoperatives Vorgehen, Hepatektomie und Flush-Konservierung entsprechen dem Ablauf in den anderen Gruppen. Vorbereitend auf die spätere Warmperfusion werden die Gefäße bereits zu diesem Zeitpunkt mit Silikonschläuchen kanüliert, mit Standard-Belzer-UW Lösung gefüllt und verschlossen. Die Leber wird anschließend in einen sterilen mit Standard-Belzer-UW Lösung gefüllten Beutel gelegt. Dieser muß sorgfältig verschlossen werden, wobei vorhandene Luft zu entfernen ist, um eine optimale Kühlung nicht zu gefährden. Danach wird das sich im Beutel befindende Organ in eine mit Trockeneis vorbereitete Kühlbox eingebracht. Nach ungefähr 44 Stunden kalter Ischämie erfolgt der Anschluß an die Perfusionskammer mit nachfolgender Warmperfusion, die analog zu den anderen Gruppen abläuft.

2.7. Warmperfusion

Nach ungefähr 44 Stunden Kaltperfusion wird die für den jeweiligen Versuch verwendete Lösung aus dem Kreislauf entfernt. Das Blutreservoir wird dazu bis auf ein Restvolumen von 50-100 ml abgelassen. Eine weitere Reduzierung des Restvolumens beinhaltet die große Gefahr des Auftretens einer Luftembolie, die zu einer irreparablen Schädigung der Leber führen könnte. Das Perfusat wird durch während der Operation gewonnenes Eigenblut ersetzt. Sobald es verworfen ist definieren wir den Beginn der Erwärmungsphase. Dieser Zeitpunkt ist der Nullpunkt. Das Eigenblut wird langsam auf die physiologische Körpertemperatur des Schweines von 38-39°C erwärmt. Parallel wird das kalte Wasser aus der Perfusionskammer nach Neuhaus entfernt und durch warmes ersetzt. Für die kaltgelagerten Lebern entfällt diese Prozedur. Diese Lebern werden nach der


23

Kaltlagerung sofort in die Perfusionskammer eingebracht, angeschlossen und mit dem während der Operation gewonnenen Schweineblut perfundiert, welches ebenfalls auf 38-39°C erwärmt wird.

Es erfolgt die erste Blutentnahme über den venösen Schenkel und die erste Blutgasanalyse. Hiernach kann Pufferung mit Natriumbikarbonat zur Korrektur erfolgen. Weitere regelmäßige Blutentnahmen und Blutgasanalysen werden zu den bei 2.9, Seite 31 genannten standardisierten Zeitpunkten durchgeführt. Stündlich wird die über den Ductus choledochus drainierte Galle gemessen. Nach Versuchsende wird die Leber nochmals gewogen.

2.8. Versuchsgruppen

Insgesamt haben wir siebenundzwanzig Versuche durchgeführt. Vierundzwanzig Tiere gelangten in die Auswertung. Drei Versuche mußten abgebrochen werden. Dabei kam es in jeweils einem Fall in der Kaltlagerungs- und der HTK-Gruppe zu operationstechnischen Fehlern, die während der Konservierungssphase zum Abbruch zwangen. Während eines Versuchs trat in der HTK-Gruppe ein technischer Defekt der Versuchsapparatur während der Kaltperfusion auf.

Es erfolgte eine Einteilung in vier Gruppen, wobei sechs Versuche jeweils eine Gruppe bilden.

Eine vollständige Randomisierung konnte aufgrund der unterschiedlichen Verfügbarkeit der einzelnen Lösungen nicht erfolgen. Sie erfolgte indirekt durch eine nicht vorhersehbare Verfügbarkeit über die Apotheke.

Tabelle 3: Einteilung der Versuchsgruppen

Gruppe

UW

FU

HTK

Kaltlagerung

n

6

6

6

6

mittleres Gewicht

30,9±10,5 kg

42,7±11,2 kg

43,3±8,2 kg

31,6±6,4 kg

mittlere Kaltkon-

servierungszeit

43h 48min

±60 min

44h 34min

±66 min

44h 53min

±71 min

44h 11min

±61 min


24

2.8.1. Kaltperfusion mit der modifizierten Maschinen-UW-Lösung

Die bei dieser Gruppe zur Kaltperfusion eingesetzte Maschinen-UW-Lösung differiert in ihrer Zusammensetzung von der für die Flush-Konservierung verwendeten Standard-UW-Lösung. Die Darstellung der Konservierungslösungen erfolgt in mmol/l.

Tabelle 4: Vergleich der Zusammensetzung der Maschinen-UW-Lösung mit der Standard UW-Lösung

 

Maschinen-UW-Lösung

Standard-UW-Lösung

Na-insgesamt

100

29

K-insgesamt

25

125

Gluconat

100

-

Laktobionat

-

100

Raffinose

35

30

K-H2PO4/K-HPO4-

25

25

Mg-Sulfat/Mg-Gluconat

5

5

Glutathion

3

3

Adenosin

5

5

Adenin

1

1

HAES

50 g/l

50 g/l

HEPES

10

-

Glucose

5

-

Ribose

1

-

Calciumchlorid

1,5

-

pH=7,4, Osmolalität 320 mosmol/kg


25

Die Maschinen-UW-Lösung besitzt im Gegensatz zur Standard-UW-Lösung mit inverser Natrium-Kalium-Relation ein physiologisches Natrium-Kalium-Verhältnis. Dies ist der entscheidende Unterschied zwischen den beiden Konservierungslösungen. Als Impermeant dient bei der Maschinen-UW-Lösung Gluconat, während in der Standard-UW-Lösung Laktobionat eingesetzt wird. Die übrigen Komponenten liegen in annähernd gleichen Konzentrationen vor. HEPES, Glucose, Ribose und Calciumchlorid sind weitere Bestandteile der Maschinen-UW-Lösung.

2.8.2. Kaltperfusion mit HTK-Lösung

In dieser Gruppe kommt die seit Jahren zur Kardioplegie und vor allem zur Organkonservierung der Niere verwendete HTK-Bretschneider Lösung (Custodiol®, Fa. Dr. F. Köhler Chemie) zum Einsatz. Ihre einzelnen Bestandteile (in mmol/l) sind folgende:

Tabelle 5: Zusammensetzung der HTK-Bretschneider Lösung

NaCl

15

KCl

9

Kaliumhydrogen-2 ketoglutarat

1

MgCl _ 6 H20

4

Histidin _ HCl H20

18

Histidin

180

Tryptophan

2

Mannitol

30

CaCl

0,015

Anion: Chlorid

50

in 1000 ml Aqua ad injectabile, pH 7,02-7,2, Osmolalität 310 mosmol/kg


26

2.8.3. Kaltperfusion mit Gerlach B-FU-Lösung

Hier wird die bereits oben in ihrer Zusammensetzung beschriebene Gerlach A-FU-Lösung zur Flush-Konservierung verwendet (siehe 0 , Seite 16). Zur Kaltperfusion kommt die Gerlach B-FU-Lösung (“Konservierung“) zum Einsatz. Am Ende der Kaltperfusion nach ungefähr 44 Stunden wird im Gegensatz zu den anderen Gruppen mit Hilfe der Gerlach C-FU-Lösung ein ”Rinse“ durchgeführt. Die beiden Konservierungslösungen setzten sich folgendermaßen zusammen (mmol/l).

Tabelle 6: Vergleich der Zusammensetzung der Gerlach B-FU-Lösung mit der Gerlach C-FU-Lösung

 

Gerlach B-FU-Lösung

Gerlach C-FU-Lösung

Natrium

120

120

Kalium

5

5

Calcium

0,8

0,8

Magnesium

0,8

0,8

Chlor

ca. 126,6

ca. 126,6

Sucrose

30

30

Tris max. auf 310 mosM

20

20

HAES

30 g/l

-

Glutathion

3

3

Allopurinol

1

1

Adenosin

5

5

Insulin

40 IE/l

40 IE/l

Dexamethason

16 mg/l

16 mg/l

Penicillin G

200000 IE/l

200000 IE/l

pH 7,4, Osmolalität 310-330 mosm/kg H2O


27

Durch diese Freispülung wird die Gerlach B-FU-Lösung aus dem Perfusionskreislauf entfernt. Im Anschluß wird die Gerlach C-FU-Lösung aus dem Kreislauf entfernt und die Warmperfusion mit Eigenblut begonnen (siehe 0 , Seite 24). Die Gerlach FU-Lösung besitzt wie die Maschinen-UW-Lösung ein physiologisches Natrium-Kalium Verhältnis. Im Unterschied zur Gerlach B-FU-Lösung wird der C-Lösung kein HAES zugefügt.

2.8.4. Kaltlagerung mit UW

In dieser Gruppe wird nach erfolgter Hepatektomie und Flush-Konservierung mit Belzer-UW-Lösung die oben beschriebene Kaltlagerung durchgeführt.

2.9. Parameter

Die Messung der ausgewählten Parameter erfolgte zu definierten Meßzeitpunkten während der Warmperfusion.

2.9.1. Klinisch-chemische Parameter

Die Bestimmung der entnommenen Proben erfolgte durch das Zentrallabor der Charité Campus Virchow-Klinikum. Zu jedem Entnahmezeitpunkt wird eine Serum-, eine EDTA- und eine Zitratmonovette entnommen, die nach den Standards der klinischen Routine im Zentrallabor untersucht wurde.

Die Auswahl der zu bestimmenden Parameter erstreckt sich über die klassischen Transaminasen GOT und GPT, die Gallengangsenzyme AP und GGT, das Gesamtbilirubin, die PCHE als Parameter der intrahepatischen Synthese und das Albumin.

Die Entnahmen des Routinelabors vollziehen sich intraoperativ nach Präparation und Kanülierung der Halsgefäße vor jeglicher intraabdomineller Manipulation, während der Kaltperfusion nach acht, sechzehn, vierundzwanzig, zweiunddreißig und vierzig Stunden, sowie während der Warmperfusion nach 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240 und 300 Minuten. Hämoglobin und Hämatokrit wurden intraoperativ, nach 0 und nach 300 Minuten gemessen und dienten der ausschließlichen Qualitätsbeurteilung des zirkulierenden Blutes.

GOT (Glutamat-oxalacetat-transaminase, AST)

Der subzelluläre histologische Aufbau des Hepatozyten unterscheidet ein mitochondriales (GOT-m) und ein zytoplasmatisches Kompartiment (GOT-c).

Die beiden Isoenzyme sind in einem Verhältnis von 4:1 verteilt. Die Freisetzung der AST-


28

m erfolgt aufgrund der mitochondrialen Lokalisation erst bei stärkeren Schädigungen. Die Aktivität der AST-c ist frühzeitig bei Leberstoffwechselstörungen erhöht. Die Halbwertzeit beträgt 17±5 Stunden.

Neben den Hepatozyten findet sich die GOT ubiquitär in vielen Geweben, z. B. im Skelettmuskelgewebe und Myokard. Eine Beeinflussung der Serumkonzentration durch Freisetzung des Enzyms in diesen Organen entfällt durch unseren Versuchsaufbau mit isolierter Perfusion der Leber in der Perfusionskammer nach Neuhaus.

GPT (Glutamat-pyruvat-transaminase, ALT)

Der Anstieg der GPT ist ein spezifisches Zeichen einer Leberzellschädigung und eignet sich deshalb besonders zum Nachweis eines Perfusionsschadens. Die intrahepatische Verteilung ist im Gegensatz zur GOT zu 85 % zytoplasmatisch und zu 15 % mitochondriär. Die Relation von leicht freisetzbarem (zytoplasmatisch) zu schwer freisetzbarem (mitochondrial) Enzym ist hier in Richtung einer frühen Aktivitätserhöhung bei beginnendem Perfusionschaden verschoben. Die Halbwertzeit beträgt 47±10 Stunden.

Im funktionellen Azinus nach Rappaport sind die GOT und die GPT besonders in der nährstoff- und sauerstoffreichen Zone 1 lokalisiert, in der Stoffwechselprozesse wie beispielsweise die Gluconeogenese, die Atmungskette, der Citratzyclus und die Oxidation von Fettsäuren ablaufen.

GGT (Gamma-Glutamyl-transferase)

Die GGT ist ein ubiquitär vorkommenes Enzym mit hoher Aktivität in der Niere, dem Pankreas und der Leber. In den Erythrozyten konnte keine GGT-Aktivität nachgewiesen werden. Die gamma-GT ist in den Hepatozyten an die Membranen des glatten endoplasmatischen Retikulums gebunden und kanalikulären Segment der Hepatozytenmembran lokalisiert. Bei einer Schädigung der intra- oder extrahepatischen Gallengänge kommt es zu einer Induktion der Synthese der membrangebundenen Form und zu einer Solubilisierung der kanalikulären Form mit Erhöhung der Serumkonzentration.

AP (Alkalische Phosphatase)

Die AP ist hepatisch im Zytosol der Zellen anzutreffen. Zusätzlich findet sich ein großer Anteil membrangebunden kanalikulär. Hohe AP-Konzentrationen lassen sich auch im Knochengewebe und in der Plazenta nachweisen.


29

Bei intra- oder extrahepatischer Schädigung der Gallengänge kommt es zu einer Konzentrationserhöhung aufgrund der Induktion der Neusynthese des Enzyms durch Gallensäuren, weiterhin durch Solubilisierung der kanalikulären Anteile und durch aktive Sekretion der Hepatozyten.

Eine alleinige Beeinträchtigung der Hepatozyten ohne Mitbeteiligung der Gallengänge kann zu einer mäßigen Erhöhung der AP-Serumkonzentration führen.

Gesamtbilirubin

Bilirubin entsteht beim Katabolismus von Hämoproteinen. Bei der Elimination dieser apolaren, lipophilen Stoffwechselprodukte kommt der Leber eine entscheidende Rolle zu. Prä,- intra- und posthepatische Störungen können einen Anstieg des Gesamtbilirubin nach sich ziehen.

PCHE (Pseudocholinesterase)

Die PCHE katalysiert die Hydrolyse synthetischer Thiocholinester. Dieses Enzym ist ein diagnostischer Marker für die Synthesekapazität der Leber. Die Syntheseleistung korreliert mit der des Albumin. Die Halbwertzeit beträgt ungefähr 10 Tage.

Albumin

Der Untergang von Leberparenchym führt zu einer Verminderung der hepatischen Synthese von Albumin. Im Blut zeigt sich eine Hypoalbuminämie. Die Plasmahalbwertzeit beträgt 20 Tage. Der Abbau erfolgt mit einer Abbaurate von täglich 10 %, welches der täglichen Syntheserate entspricht.

2.9.2. Gallesekretion

Die Gallesekretion wurde intraoperativ nach Kanülierung des Gallenganges über eine Stunde gemessen. Anschließend wurde die Galle während der Kaltkonservierung und der Warmperfusion gesammelt.

2.9.3. Gefäßwiderstand der Arteria hepatica communis

Während der gesamten Konservierungsphase und Warmperfusion wurde in engmaschigen Abständen der Gefäßwiderstand der Arteria hepatica communis gemessen.

Dieser resultiert aus der unter 2.4.2 beschriebenen Pumpenregulation mit eingestellten maximalen Grenzen für arteriellen Blutfluß und arteriellen Blutdruck.


30

2.9.4. Lebergewicht postoperativ und nach Warmperfusion

Jede Leber wurde nach der Hepatektomie und nach der Warmperfusion gewogen.

2.9.5. Statistische Verfahren

Die Ergebnisse der klinisch-chemischen Parameter, der Gallesekretion und der Lebergewichtszunahme zwischen den einzelnen Versuchsgruppen wurden mit Hilfe des Kruskal-Wallis-Test für mehrere unverbundene Stichproben statistisch untersucht. Dabei wurde die Irrtumswahrscheinlichkeit alpha mit 1 bzw. 5 % festgesetzt. Somit wurde ein p<0,01 als stark bzw. <0,05 als schwach signifikant angesehen. Bei signifikantem Ergebnis des Kruskal-Wallis-Test wurde eine multiple Testung zwischen den einzelnen Gruppen anhand des Student-Newman-Keuls-Test durchgeführt.


[Titelseite] [1] [2] [3] [4] [5] [Bibliographie] [Abkürzungsverzeichnis] [Lebenslauf] [Danksagung] [Selbständigkeitserklärung]

© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.

DiDi DTD Version 1.1
a subset from ETD-ML Version 1.1
Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML - Version erstellt am:
Mon Dec 20 19:52:41 1999