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Kapitel 2. MATERIAL UND METHODE

2.1. Material

2.1.1. Geräte der Probenaufbereitung

Extraktionsröhrchen: Varian Bond Elut®, (Fa. Varian, Harbor City, USA); Vakuumextraktionsgerät: Adsorbex® SPU-Absaugeinheit (Fa. E. Merck, Darmstadt, BRD); Zentrifuge: Megafuge 1.0 (Rotor 3360) (Fa. Heraeus Sepatech, Osterode, BRD); Schüttelgerät: (Fa. Heidolph, Kelheim, BRD). Weiterhin sind zur Probenaufbereitung Eppendorfpipetten, Pasteurpipetten und Probengefäße notwendig.

2.1.2. Aufbau der Probenaufbereitung

2.1.2.1. Präparation der Plasmaproben

Die Plasmaproben werden aus venös entnommenen, heparinisierten Blutproben gewonnen. Das heparinisierte Blut wird fünf Minuten bei 3000 U/min. zentrifugiert. Jeweils 1 ml Plasma wird in 10 ml-Röhrchen gefüllt und dient entweder der direkten Weiterverarbeitung oder der Aufbewahrung bei -40°C.

2.1.2.2. Extraktionsröhrchen und Konditionierung

Die Wand der Extraktionsröhrchen besteht aus chemisch inertem PTFE. Das Säulenvolumen beträgt 2,8 ml. Die Füllung (500 mg) setzt sich aus modifiziertem Kieselgel (-Si-C18H37) mit einer Partikelgröße von 40 µm zusammen, welches in einer Silanisierungsreaktion mit hydrophoben n-Octadecyl Liganden chemisch gebunden wurde. Dieses Füllungsmaterial macht eine reversed-phase Extraktion möglich. Die bis zu 24 Extraktionsröhrchen werden auf die SPU-Absaugeinheit gesteckt und mit 3 ml Methanol und danach mit 3 ml Wasser gefüllt. Diese Konditionierung ist nötig, um die Adsorbentien vollständig zu benetzen und damit auf der gesamten Oberfläche der Kieselgele ein System zwischen fester Phase (Octadecyl-Gruppe) und mobiler Phase (Wasser) zu schaffen.

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2.1.2.3. Vakuumabsaugeinheit und Extraktion der Plasmaproben

Die frisch gewonnenen oder wiederaufgetauten 1 ml Plasmaproben werden mit 200 µl internem Standard und 1 ml 0,1 molarer Salzsäure versetzt und mit dem Vortex-Mischer für ungefähr zehn Sekunden gemischt. Die Proben haben nach diesem Schritt ein Volumen von 2,2 ml. Das Zentrifugieren der wiederaufgetauten Proben mit der Zentrifuge bei 3000 U/min. für zwei Minuten ist zur Abtrennung von Eiweißgerinnseln von der Probenmatrix notwendig. Von den 2,2 ml Proben werden jeweils 2,0 ml auf die vorher konditionierten Röhrchen mit der Eppendorfpipette gegeben, welche auf dem SPU-Vakuumextraktionsgerät senkrecht fixiert sind. Der Unterdruck entsteht durch ein Wasserhahnventil und läßt sich stufenlos regulieren. Das Eluat fließt aus den Säulen in der Position ”Collect” in 5 ml-Glasröhren und in der Position ”Waste” in einen Abfallbehälter ab. Nachdem die 2,0 ml Proben vollständig durch die Extraktionsröhrchen geflossen sind, werden jeweils 3 ml Waschlösung auf die Röhrchen pipettiert. Anschließend werden aus dem Säulenbett mit einem Unterdruck von ca. 20 mmHg die Reste der Waschlösung abgesaugt. Die SPU-Absaugeinheit wird nun von ”WASTE” auf ”COLLECT” umgestellt, so daß im letzten Schritt, der Elution, der Durchfluß aus den Extraktionsröhrchen in den 10 ml-Glasgefäßen aufgefangen wird. Die Elution erfolgt durch Gabe von 1 ml Elutionsgemisch auf die Extraktionsröhrchen und nachfolgendes vollständiges Leersaugen des Säulenbettes.

2.1.2.4. Weiterverarbeitung der Proben

Aus den 10 ml-Glasgefäßen werden mit Hilfe von Pasteurpipetten die 1 ml-Glasgefäße mit Eluat gefüllt und mit Gummistopfen und Aluminiumkappe verschlossen und stehen anschließend für die Analyse im Autosampler bereit.

2.1.3. Geräte der HPLC

Filtrationseinheit SM 16309 Volumen: 250/1000 ml, mit Membranfilter: SM 11606 (Porengröße 0,45 mm) aus regenerierter Zellulose (Fa. Sartorius, Göttingen, BRD); Ultraschallgerät Sonorex TK 52 (Fa. Bandelin, Berlin, BRD); 2 HPLC-Pumpen Typ 364.00, Dynamische Mischkammer Typ 73249, Injektionsventil A0258, Verbindungselemente, Lambda-Selektor , Spektralphotometer Typ 87 (Fa. Knauer,

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2.1.4. Aufbau der HPLC

2.1.4.1. Filtration der Eluenten

Die Filtration sämtlicher, in der HPLC eingesetzter Lösungsmittel durch 0,45 µm regenerierte Zellulose dient dem Schutz der Pumpen und der Trennsäule vor größeren Schmutzpartikeln. Die Zellulosefilter eignen sich gleichermaßen für Wasser und organische Lösungsmittel.

2.1.4.2. Entgasung der Eluenten

Es standen zwei Methoden der Entgasung der mobilen Phase zur Wahl: die kontinuierliche Einleitung von Helium in die Eluenten und das zehnminütiges Ultraschallbad der Eluenten. Beide Methoden lieferten mit dieser HPLC-Anlage einwandfreie Ergebnisse. Aufgrund des geringeren apparativen Aufwands, kommt die Entgasung mit dem Ultraschallbad zum Einsatz.

2.1.4.3. HPLC-Pumpen

Die verwendeten Pumpen (Fa. Knauer, Typ 64) sind Zweikolbenpumpen mit Förder- und Ausgleichskolben, die einen Förderhub von nur 20 µl aufweisen. Pulsationen, also Schwankungen des Förderdrucks, werden durch den kleinen Hub und die damit verbundene hohe Pumpfrequenz weitgehend reduziert (<1% bei Maximaldruck), was letztlich zu einem geringeren Grundrauschen bei der Detektion führt. Die parallele Anordnung der Pumpen erlaubt sowohl isokratische (konstantes Verhältnis der Eluenten), als auch Gradientenelution (variables Verhältnis der Eluenten). Die Flußsteuerung durch ein externes Signal macht auch mehrteilige, zeitgesteuerte Gradientenelutionen möglich.

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2.1.4.4. Mischkammer

Die dynamische Mischkammer ist in der beschriebenen Anlage erforderlich, um während der Gradientenelution eine möglichst homogene Mischung der unterschiedlichen Lösungsmittel bei kleinstmöglichem Volumen zu erzielen.

2.1.4.5. Injektionssystem

Das Injektionssystem besteht aus einem Sechswegeventil und einer Probenschleife mit einem Volumen von 100 µl. Die Probenaufgabe erfolgt mit dem automatischen Probengeber. Das Injektionssystem ist in den Autosampler integriert.

2.1.4.6. Verbindungselemente

Es kommen ausschließlich Edelstahlkapillaren zum Einsatz. Alle Verbindungen des Hochdruckteils der Anlage zeichnen sich durch einen niedrigen Innendurchmesser aus, um ein möglichst geringes Volumen zu erzielen.

2.1.4.7. Autosampler

Der eingesetzte Autosampler macht die serielle Analyse von bis zu 96 verschiedenen Proben möglich. Vor jeder Injektion einer Probe wird die Probenschleife automatisch mit 100 µl Wasser gereinigt und mit 230 µl Probe durchflossen, um Verunreinigungen aus vorangegangenen Probeninjektionen auszuschließen.

2.1.4.8. Vorsäule

Die Vorsäule kommt zum Einsatz, um die Trennsäule vor Verschmutzung chemischer oder mechanischer Art zu schützen. Die Vorsäule wird direkt vor die Trennsäule geschaltet. Das Füllungsmaterial der Vorsäule entspricht dem der Trennsäule (C 18-gebundenem Kieselgel).

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2.1.4.9. Chromatographische Trennsäule

Die µBondapak C18-Säule mit einer Länge von 300 mm und einem Innendurchmesser von 3,9 mm gewährleistet bei einer Partikelgröße vom 10 µm eine optimale Trennung in reversed-phase Technik bei einem adäquaten Pumpendruck.

2.1.4.10. Lambda-Selektor und Spektralphotometer

Der Lambda-Selektor erlaubt eine zeitabhängig programmierbare Wellenlängenumschaltung während einer singulären chromatographischen Untersuchung. Das Spektralphotometer stellt einen Detektor mit variabler Wellenlänge dar, der die Lichtabsorption im UV-Bereich (190 - 400 nm) bei einer vom Lambda-Selektor gesteuerten Wellenlänge mißt.

2.1.4.11. Integrator und Software

Die quantitative Auswertung des Detektorensignals erfolgt durch den Integrator und die nachgeschaltete Recheneinheit. Der Integrator wandelt das analoge Signal des Spektralphotometers in ein digitales Signal um. In der Recheneinheit erfolgt die Speicherung und Analyse der Chromatogramme.

2.1.4.12. Übersicht der HPLC-Anlage

In Abbildung 3 ist der schematische Aufbau der HPLC-Anlage dargestellt. Die Verbindungslinien entsprechen den Edelstahlkapillaren. Die Steuerung der Pumpen, der Detektoreinheit und des Autosamplers erfolgt automatisch über die Recheneinheit.

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ABBILDUNG 3: Schematische Darstellung des chromatographischen Meßplatzes

2.1.5. Chemikalien

Pyrimethamin [2,4-diamino-5-(4-chlorophenyl)-6-ethylpyrimidine] (zur Verfügung gestellt von Fa. Wellcome, Beckenham, England); Dapson (4,4'-diaminodiphenyl sulphone) (zur Verfügung gestellt von Fa. Wellcome, Beckenham, England); Monoacetyldapson (4-N-acetylamino-4'-aminodiphenyl sulphone) (zur Verfügung gestellt von Fa. Wellcome, Beckenham, England); Sulfadimethoxin (interner Standard) (N1-3,5-dimethoxy-4-pyrimidinyl-sulphanilamide) (zur Verfügung gestellt von Fa. Hoffmann-La Roche, Grenzach-Wyhlen, BRD); Salzsäure (Fa. E. Merck, Darmstadt, BRD); Methanol (LiChrosolv, gradient grade) (Fa. E. Merck, Darmstadt, BRD); Acetonitril (LiChrosolv, gradient grade) (Fa. E. Merck, Darmstadt, BRD); Wasser (bidestilliert) (Fa. Braun, Melsungen, BRD); PIC-B5 (Wasser, Methanol, Pentansulfonsäure, Kalziumazetat) (Fa. Waters, Milford, USA); PIC-B6 (Wasser, Methanol, Hexansulfonsäure, Kalziumazetat) (Fa. Waters, Milford, USA).

2.1.6. Stamm- und Standardlösungen

Die Stammlösungen der Pharmaka und des internen Standards (IS) wurden mit einer Präzisionswaage eingewogen. Als Lösungsmittel diente Methanol. Die Stammlösungen wiesen folgende Konzentrationen auf: Pyrimethamin 0,5 mg/ml; Dapson 1,0 mg/ml; Monoacetyldapson 0,25 mg/ml; Sulfadimethoxin (interner

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TABELLE 5: Standardlösungen von PYR, DDS und MADDS

STANDARD	A	B	C	D	E	F	G	H	I
Verdünnung	1:5	1:10	1:20	1:50	1:100	1:200	1:500	1:1000	1:5000
PYR	100	50	25	10	5	2,5	1,0	0,5	0,1
DDS	200	100	50	20	10	5	2	1	0,2
MADDS	50	25	12,5	5	2,5	1,25	0,5	0,25	0,05

Alle Konzentrationsangaben in µg/ml

2.2. Entwicklung der Probenaufbereitung

2.2.1. Auswahl der grundlegenden Methode

Als Probenaufbereitung wurde bei den bisher beschriebenen Methoden zur Bestimmung von DDS, MADDS und PYR die zeitaufwendige Flüssig-Flüssig-Extraktion eingesetzt. Daher sollte eine Flüssig-Fest-Extraktion als Probenaufbereitung mit einmal verwendbaren reversed-phase Extraktionsöhrchen etabliert werden. Aufgrund der hydrophoben Eigenschaften von DDS, MADDS und PYR wurde als Füllungsmaterial (Adsorbens) ein ebenfalls hydrophobes reversed-phase Kieselgel gewählt. Dieses gewährleistet eine möglichst starke, jedoch reversible Bindung zwischen der stationären Phase und den zu analysierenden Substanzen.

Die reversed-phase Festphasenextraktion gliedert sich prinzipiell in drei Teile.

1. RETENTION: Hydrophobe Substanzen in einem wässerigem Medium fließen durch ein Säulenbett mit einem ebenfalls hydrophoben Adsorbens. Die hydophoben Substanzen lagern sich an das Adsorbens an.
2. WASCHEN: Mit einer Spülflüssigkeit werden hydrophile Verunreinigungen entfernt.
3. ELUTION: In dem letzten Schritt trennt ein stark hydrophobes Lösungmittel die Bindung der gesuchten Substanzen mit dem Adsorbens. Das so gewonnene Eluat enthält die gesuchten Substanzen und nur noch wenige Verunreinigungen, und kann so einer quantitativen Analyse zugeführt werden.

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2.2.2. Chromatographische Bedingungen und Konditionierung

Die Entwicklung der Probenaufbereitung als Festphasenextraktion für DDS, MADDS und PYR erforderte konstante chromatographische Bedingungen für die HPLC. Diese Bedingungen basierten auf der von Edstein et al. beschriebenen Methode. (Analytische Säule: µBondapak C18, 300 x 3,9 mm, Mobile Phase: Wasser/Methanol/Acetonitril = 65/25/15, 0,005 M Pic B5 low UV, Fließgeschwindig-keit: 1,5 ml/min.). Während der Entwicklung der Methode der Probenaufbereitung wurde jeder Schritt der Festphasenextraktion (RETENTION, WASCHEN, ELUTION) isoliert erarbeitet. Die Analyse im wässerigen Medium diente der Optimierung und Überprüfung der einzelnen Probenaufbereitungsschritte.

2.2.3. Kapazitätsprüfung mit DDS, MADDS, PYR und IS in Wasser

Um einen Verdünnungseffekt bei der finalen Elution der Substanzen aus den Extraktionsröhrchen zu vermeiden, mußte das Füllungsvolumen dieser Säulen gering sein. Andererseits galt es eine ausreichende Kapazität des Säulenbettes zu gewährleisten. Die Füllungsmenge von 500 mg der Varian Bond Elut®-Röhrchen sicherte eine zufriedenstellende Kapazität bei kleinem Volumen. Eine Überschreitung der Kapazität der vorher konditionierten Röhrchen trat erst ab einer Konzentration von 500 mg DDS, 500 mg MADDS oder 500 mg PYR pro ml auf.

2.2.4. Retentionsprüfung mit DDS, MADDS, PYR und IS in Wasser

1 ml einer wässerigen Lösung mit 10 mg DDS, 10 mg MADDS, 10 mg PYR und 10 mg IS wurde auf die Extraktionsröhrchen gegeben und der Durchfluß analysiert. Es waren keine spezifischen Peaks nachweisbar, d.h. die Retention der Substanzen auf den Extraktionsröhrchen war vollständig.

2.2.5. Elutionsversuche mit DDS, MADDS, PYR und IS in Wasser

Ziel der Elutionsversuche war es, einen Eluent zu entwickeln, der die zu analysierenden Substanzen mit nur 1 ml Volumen vollständig eluiert. Unter dieser Voraussetzung (Elutionsvolumen gleich Probenvolumen) wurde eine Verdünnung,

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2.2.6. Verarbeitung von Plasmaproben

Zur Ermittlung der optimalen Probenaufbereitung von Plasmaproben wurden ”spiked” Plasma (1000 ml Plasma, 100 ml DDS/MADDS/PYR-Lösung, 200 ml IS-Lösung, 900 ml 0,1 N HCl) und Leerplasma (1000 ml Plasma, 300 ml Wasser, 900 ml 0,1 N HCl) verwendet. Als ”spiked” Plasma bezeichnet man Blutplasma, welches mit einer definierten Menge Pharmaka versetzt wurde. Leerplasma dagegen enthält keine Medikamente. Die Ansäuerung der Plasmaproben war notwendig, um die hohe Proteinbindung der Pharmaka zu lösen.

2.2.7. Prüfung verschiedener Waschlösungen

Es wurden jeweils 3 ml der Waschlösungen a) 100% Wasser, b) 90% Wasser/10% Methanol, c) 80% Wasser/20% Methanol auf konditonierte und mit ”spiked” Plasma bzw. Leerplasma beladene Extraktionsröhrchen gegeben. Bei den Waschlösungen mit organischem Anteil zeigte sich eine zusätzliche Interferenz im Retentionsbereich des Pyrimethamin-Peaks. Folglich wurde weiterhin auf Wasser als Waschsubstanz bei der Probenaufbereitung zurückgegriffen.

2.2.8. Retentions- und Elutionsprüfung mit Plasmaproben

Die Überprüfung der Probenaufbereitungsmethode für Plasmaproben erfolgte mit der Retentionsprüfung und Elutionsprüfung in Plasma. In diesem Versuchsabschnitt wurde jeder Schritt (1-7) der Probenaufbereitung einzeln kontrolliert. Die Analyse der

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(Schritt 1) Die angesäuerten Proben wurden auf die zuvor konditionierten Extraktionsröhrchen gebracht. Ohne Unterdruck aus der Absaugeinheit traten die Proben durch die Extraktionsröhrchen. Der Durchfluß enthielt keine der Pharmaka. Auch eine nochmalige Ansäuerung des Durchflusses mit 900 ml 0,1 N HCl setzte keine der gesuchten Substanzen frei, die Retention war also vollständig. (Schritt 2-4) Auf die C18-Säulen wurden dreimal je 1 ml Wasser gegeben, wodurch polare Verunreinigungen aus dem Säulenbett gewaschen wurden. Der nachweisbare Verlust der Pharmaka betrug bei

Schritt 2: DDS 0,4 %, MADDS 0,9 %, PYR 1,8 %, IS 0,0 %,

Schritt 3: DDS 0,0 %, MADDS 0,0 %, PYR 0,5 %, IS 0,0 %,

Schritt 4: DDS 0,0 %, MADDS 0,0 %, PYR 0,5 %, IS 0,0 %.

(Schritt 5) Danach wurde das in dem Säulenbett verbliebene Wasser unter Sog entfernt. Auch hier waren keine Verluste nachweisbar. (Schritt 6) Nun wurden mit 1 ml Eluent (Methanol/Acetonitril/0,1 N Salzsäure = 1/1/1) die Substanzen, zuerst nur unter Schwerkraft und dann der auf den Säulen verbleibende Rest unter Sog, eluiert. (Schritt 7) Bei einer zweiten Elution mit 1 ml Eluent (Methanol/Acetonitril/0,1 N Salzsäure = 1/1/1) waren keine Peaks mehr detektierbar, die erste Elution war also vollständig.

2.2.9. Zusammenfassung der Probenaufbereitung

Zunächst werden die Varian Bond Elut® Extraktionsröhrchen auf die Adsorbex® SPU-Absaugeinheit gesteckt. Die 500 mg Extraktionsröhrchen werden mit zuerst 3 ml Methanol und dann mit 3 ml Wasser konditioniert. Danach wird 1 ml Plasma mit 1 ml 0.1 molarer Salzsäure und 200 ml internem Standard (2 mg Sulfadimethoxin) versetzt und anschießend 10 Sekunden mit dem Vortex-Mischer geschüttelt. 2 ml der Probe werden in das Extraktionsröhrchen pipettiert. Im nächsten Schritt wird das Röhrchen mit 3 ml Wasser gewaschen. Die Elution erfolgt mit 1 ml Methanol/ Acetonitril/0,1 N Salzsäure. 100 µl des durch das Extraktionsröhrchen geflossenen Eluats werden in die HPLC-Säule injiziert.

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2.3. Entwicklung der HPLC-Methode

2.3.1. Variation der mobilen Phase mit Pic B5

Bei der von Edstein et al. etablierten Methode handelt es sich bei der HPLC um eine Reversed-Phase-Ion-pair-Chromatographie. Als Ion-pairing Substanz wurde PIC B5 (Hauptbestandteil Pentansulfonsäure) gewählt. Die geänderte Probenaufbereitung machte die Entwicklung neuer geeigneter chromatographischer Bedingungen notwendig. Um diesen Prozeß zu vereinfachen wurde von einem weitgehend identischem chromatographischem Verhalten von DDS und seinem Hauptmetaboliten MADDS ausgegangen. Daher wurde bei der systematischen Ermittlung der optimalen mobilen Phase nur DDS, PYR und IS eingesetzt. Bei konstantem Anteil von Wasser (60%) und konstanter Konzentration von Pic B5 (5 mmol/l) wurde das Verhältnis von Methanol zu Acetonitril systematisch variiert. Die resultierenden Retentionszeiten sind in Abbildung 4 wiedergegeben.

ABBILDUNG 4: Retentionszeiten bei Variation der organischen Eluenten

Wie aus der Abbildung 4 ersichtlich, nimmt die Retentionszeit von PYR mit zunehmendem Anteil von Acetonitril ab. Der gleiche Effekt läßt sich auch für IS nachweisen. Die Retentionszeit von DDS hingegen bleibt von der Variation des Methanol/Acetonitril-Quotienten weitgehend unbeeinflußt. Mit der in dieser Arbeit

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Aufgrund der unbefriedigenden Trennung von DDS und Plasmapeaks wurde eine Verminderung der Fließmittelstärke erforderlich, um längere Retentionszeiten für DDS zu erhalten. Das konnte durch eine Erhöhung des Wasseranteils von 60% auf 65% bzw. 70% erreicht werden. Die Retentionszeiten der Substanzen und einem interferierenden Peak (IF) für den jeweiligen Wasseranteil, bei optimalem Methanol/ Acetonitril-Quotienten, sind in Abbildung 5 dargestellt.

ABBILDUNG 5: Retentionszeiten bei höherem Wasseranteil

Die Trennung von DDS und den frühen Plasmapeaks war teilweise akzeptabel. Die Interferenz (IF) im Bereich von Pyrimethamin (Abbildung 5) machte diese Eluenten jedoch ungeeignet. Daher war mit dem Ionenpaar-Reagenz Pic B5 (Hauptbestandteil

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2.3.2. Variation der Pic B5 Konzentration

In diesem Reihenversuch wurde bei konstantem Verhältnis der drei Lösungsmittelkomponenten (Wasser/Methanol/Acetonitril:65/15/25) die Konzentration von Pic B5 in der mobilen Phase systematisch variiert (Abbildung 6).

ABBILDUNG 6: Retentionszeiten bei Variation der Konzentration von Pic B5

Wie in Abbildung 6 zu sehen ist, verschlechterte eine Erhöhung der Pic B5-Konzentration die Trennung von PYR und der endogenen Interferenz (IF). Eine niedrigere Pic B5 Konzentration war durch die dann unzureichende Trennung von DDS und MADDS ebenfalls ungeeignet.

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2.3.3. Erfolgreiche Variation der mobilen Phase mit Pic B6

Aufgrund der Retentionszeiten der auftretenden endogenen Interferenzen, bei Verwendung des Ionenpaar-Reagenz Pic B5, wurde Pic B6 (Hauptbestandteil Hexansulfonsäure) in der Konzentration von 5 mmol/l eingesetzt. Bei konstantem Anteil von Wasser (65 %) und konstanter Konzentration von Pic B6 (5 mmol), wurde das Verhältnis von Methanol und Acetonitril in Anlehnung an die Ergebnisse aus den Reihenversuchen mit Pic B5 variiert. Die Retentionszeiten in Abhängigkeit von dem Verhältnis der organischen Anteile der mobilen Phase sind in Abbildung 7 wiedergegeben.

ABBILDUNG 7: Retentionszeiten unter Variation der organischen Eluenten mit Pic B6

Eine optimale Trennung bei möglichst kurzen Analysenzeiten wurde bei einem Verhältnis von Methanol zu Acetonitril (20 : 20) erreicht. Eine endogene Interferenz in dem Retentionszeitenbereich von PYR war nicht mehr zu beobachten. Das Ionenpaar-Reagenz PIC B6 und ein Methanol/Acetonitril-Verhältnis von 1 : 1 wurde damit für die mobile Phase der HPLC-Methode festgelegt.

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2.3.4. Gradientenelution

Um die Analysenzeit zu verkürzen und die Empfindlichkeit für Pyrimethamin zu erhöhen, wurde eine Gradientenelution eingesetzt. Als optimal erwies sich folgender Gradient: Lösung A: 5,0 mmol/l Pic B6 (Hexansulfonsäure) in Wasser; Lösung B: Methanol : Acetonitril = 1 : 1.

0-5	Minuten	Lösung A: 65 %; Lösung B: 35 %
5-15	Minuten	Lösung A: von 65 % auf 55 % linear abfallend
	Lösung B: von 35 % auf 45 % linear ansteigend
15-20	Minuten	Lösung A: 65 %; Lösung B: 35 %

2.3.5. Detektionswellenlängen für DDS, PYR und IS

Um die Empfindlichkeit der Methode zu erhöhen, wurde die optimale Detektionswellenlänge von DDS, PYR und IS ermittelt. ”Spiked” Plasma wurde nach beschriebener Probenaufbereitung auf die Säule gegeben und die Wellenlänge im Bereich von 200 nm bis 300 nm systematisch variiert (Abbildung 8).

ABBILDUNG 8: Peakhöhen bei Variation der Detektionswellenlänge

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Für die Routineanalyse von Patientenplasmaproben wird der Lambda-Selektor auf folgende Detektionswellenlängen programmiert: 0-10 Minuten: 295 nm und 10-20 Minuten: 210 nm. In den Abbildungen 9 und 10 sind zwei repräsentative Chromatogramme wiedergegeben. Die Abbildung 9 zeigt ein Chromatogramm einer Plasmaprobe ohne Pharmaka und internen Standard. Dem ist in Abbildung 10 das Chromatogramm einer Probe mit ”spiked” Plasma gegenübergestellt. Es zeigt sich eine ausreichende Trennung der Substanzen und die Abwesenheit von störenden Interferenzen. Unter diesen chromatographischen Bedingungen ergeben sich folgende Retentionszeiten: Dapson (4,62 Min.), Monoacetyldapson (5,95 Min.), Sulfadimethoxin (9,42 Min.) und Pyrimethamin (14,23 Min.).

ABBILDUNG 9: Chromatogramm einer Plasmaprobe ohne Pharmaka

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ABBILDUNG 10: Chromatogramm einer Plasmaprobe mit DDS (1,0 µg/ml), MADDS (0,25µg/ml), IS und PYR (0,5 µg/ml). Die Retentionszeiten von DDS (4,62 Min.), MADDS (5,95 Min.), IS (9,42 Min.) und PYR (14,23 Min.) sind entsprechend notiert.

2.3.6. Zusammenfassung der HPLC-Methode

Es wird eine µBondapak C-18 Säule eingesetzt. Die Gradientenelution erfolgt mit Methanol, Acetonitril, Wasser und Pic B6. Die Detektionswellenlänge beträgt 295 nm (DDS, MADDS, IS) und 210 nm (PYR). Die Retentionszeiten liegen im Bereich von 4,62 bis 14,23 Minuten.

2.4. Validierung der Methode

2.4.1. Kalibration und Auswertung

Die Kalibration erfolgt zu Anfang jeder Meßserie. Es werden vier Plasmaproben eingesetzt. Somit stehen für jedes der drei Pharmaka vier Eichpunkte zu Verfügung

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TABELLE 6: Kalibrationspunkte von PYR, DDS und MADDS.

Eichpunkt	1	2	3	4
PYR (ng/ml)	100	250	500	1000
DDS (ng/ml)	200	500	1000	2000
MADDS (ng/ml)	50	125	250	500

Die Auswertung erfolgt mit Hilfe der Barspec-Software auf der HPLC-Recheneinheit. Nach Basislinienbestimmung und Lokalisation der Peaks wird der Quotient Peakhöhe der Substanz geteilt durch Peakhöhe des internen Standards gebildet. Für jede Substanz wird aus den Quotienten der vier Eichpunkte mit Hilfe der linearen Regression eine Eichgerade errechnet. Anhand dieser Eichgerade werden die Spiegel der Patientenproben bestimmt.

2.4.2. Überprüfung der Methode

Wiederfindung: Die Wiederfindung der Probenaufbereitung ist ein Maß für die Vollständigkeit der Extraktion der gesuchten Substanzen aus der Probe. Die Wiederfindung wurde durch den Vergleich der Peakhöhen der Pharmaka nach Probenaufbereitung mit den Peakhöhen der Standardlösungen gleicher Konzentrationen in einem Leerplasmaextrakt ermittelt. Das Leerplasmaextrakt konnte durch Probenaufbereitung von Leerplasma gewonnen werden. Durch die Probenaufbereitung entstand eine Verdünnung von 10/11, da von 2,2 ml Plasma/interner Standard/Salzsäure nur 2,0 ml auf die präparativen Säulen gegeben wurden. Der Verdünnungsfaktor von 10/11 wurde bei der Bestimmung der Wiederfindung korrigiert.

Präzision: Die Bestimmung der Präzision erfolgte a) als Mehrfachanalyse (n=5) in einem Meßgang und b) als Analyse von Tag-zu-Tag (n=10). Bei beiden Teilen der Präzisionsprüfung stammten alle Proben einer Serie aus der selben, mit Standard-lösung versetzten Plasmaportion.

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Spezifität: Die Spezifität der Methode wurde durch den Ausschluß von Interferenzen demonstriert. Es wurde Plasma von zwanzig verschiedenen HIV-seropositiven Patienten ohne Dapson/Pyrimethamin-Einnahme auf interferierende Peaks getestet.

2.5. Prophylaxe mit Pyrimethamin und Dapson

2.5.1. Patientenkollektiv

Die HIV-seropositiven Patienten wurden im Rahmen einer vergleichenden Studie (100 mg DDS + 25 mg PYR oder 500 mg SDX + 25 mg PYR) an der II. Medizinischen Klinik (Infektiologie) des UKRV, Berlin per Zufallsverteilung dem Dapson/Pyrimethamin-Prophylaxeregime zugeordnet. Einschlußkriterien waren primäre Pneumocystis carinii-Pneumonie oder primäre Toxoplasma gondii-Enzephalitis in der Krankengeschichte oder eine CD4-Zellzahl von unter 200/µl.

Das Prophylaxeregime sah eine Gabe von 100 mg DDS (2 Tabletten Dapson- Fatol®), 25 mg PYR (1 Tablette Daraprim®) und 15 mg Folinsäure (1 Tablette Leukovorin 15®) zweimal pro Woche vor. Die Tabletteneinnahme am Montag/Donnerstag oder Dienstag/Freitag wurde empfohlen. Der Abstand zwischen den Einnahmen betrug demnach abwechselnd drei und vier Tage.

Von 31 AIDS-Patienten wurden die Plasmaspiegel von DDS, MADDS und PYR aus 224 Blutproben bestimmt. Die Geschlechtsverteilung war 27 (87,1%) männliche zu 4 weiblichen (12,9%) Patienten. Von den 31 Patienten nannten 20 (64,5%) Homosexualität, 7 (22,6%) i.v.-Drogenabusus und 3 (9,7%) Heterosexualität als Risikofaktor. Ein Patient gab sowohl Homosexualität, als auch i.v.-Drogenabusus an. Bei vier Patienten war eine primäre zerebrale Toxoplasmose und bei sieben Patienten eine Pneumocystis carinii-Pneumonie der Anlaß zu Beginn einer

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Die quantitativen Daten des Patientenkollektivs sind in Tabelle 7 dargestellt. Die Anzahl der Leukozyten und der CD4 positiven Lymphozyten im Blut wurde bei Einschluß in die Studie bestimmt. Bei den Parametern Beobachtungszeitraum und mittlerer Probenabstand wurden nur Patienten mit mehr als einer Probe analysiert.

TABELLE 7: Charakteristische Daten der Patientenkollektivs

	Mittelwert	Median	SD*	Minimum	Maximum
Alter der Patienten (Jahre)	36,9	34	9,5	26	54
Beobachtungs-zeitraum (Tage)	445,2	375	357,2	22	1154
Anzahl der Proben	7,2	4	7,2	1	28
Mittlerer Proben-abstand (Tage)	72,4	64	39,6	22	222
CD4+ Zellzahl bei Beginn (Zellen/µl)	47,3	47	6,0	2	143
Leukozyten bei Beginn (Zellen/nl)	3,75	3,7	0,26	1,4	6,4

*Standardabweichung

2.5.2. Abnahme der Proben

Die Abnahme der Proben erfolgte im Rahmen von ambulanten Routine-untersuchungen in der Tagesklinik der II. Medizinischen Klinik oder während stationärer Aufenthalte. 224 Proben wurden analysiert. Die Proben wurden in fünf aufeinanderfolgenden Zeitabschnitten gewonnen: a) 4-12, b) 20-28, c) 44-52, d) 68-76 und e) 92-100 Stunden nach der Tabletteneinnahme.

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2.5.3. Compliance

In der hier vorgestellten Arbeit wurde als Teilaspekt der Compliance die Einnahmetreue der HIV-seropositiven Patienten bei dem untersuchten Prophylaxeregime gemessen. Die Compliance der Tabletteneinnahme konnte anhand der Plasmaspiegel von DDS und PYR bestimmt werden. Pyrimethamin war mit einer Halbwertszeit von ca. 100 Stunden geeignet, die durch den ”white coat effect” vorgespiegelte vollständige Medikamenteneinnahmetreue zu widerlegen. In die Auswertung der Medikamentenspiegel und der Einnahmetreue wurden nur Patienten mit vier oder mehr Blutprobenmessungen aufgenommen. Dieser Probenumfang war notwendig, um zwischen Compliance und Non-Compliance zu differenzieren.

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