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Kapitel 3. ERGEBNISSE

3.1. Validität der Methode

3.1.1. Wiederfindung

Die Bestimmung der Wiederfindung der zu analysierenden Substanzen nach der Probenaufbereitung erfolgte als Mehrfachmessung (n=5) in dem jeweils relevanten Konzentrationsbereich. Die ermittelten Meßwerte zeigten eine Wiederfindung von 89 - 98% für Pyrimethamin, 85 - 90% für Dapson und 85 - 91% für Monoacetyldapson. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 zusammengefaßt.

TABELLE 8: Wiederfindung von PYR, DDS, und MADDS

Substanz	Konzentration (µg/ml)	Wiederfindung*(%)
PYR	0,05	98
	0,2	94
	1,0	89
	2,0	89
	5,0	89
Mittelwert±SD		92±4
DDS	0,05	89
	0,2	87
	1,0	90
	2,0	85
	5,0	87
Mittelwert±SD		88±2
MADDS	0,05	85
	0,2	89
	1,0	87
	2,0	86
	5,0	91
Mittelwert±SD		88±3

* Mittelwerte von fünf Bestimmungen für jede Konzentration

Die Umrechnung von µg/ml zu µmol/l erreicht man durch die Multiplikation mit dem Faktor 3,5 für MADDS (MG 290) und 4,0 für DDS (MG 248) und PYR (MG 249).

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3.1.2. Präzision

Die Reproduzierbarkeit der Methode wurde durch die Bestimmung der Präzision in der Serie und von Tag-zu-Tag ermittelt. Der Mittelwert der Variationskoeffizienten in den Serienversuchen lag bei 3,51 für Pyrimethamin, 1,21 für Dapson und 1,89 für Monoacetyldapson. In den Versuchen an aufeinanderfolgenden Tagen zeigten sich mit 4,13 für Pyrimethamin, 4,92 für Dapson und 5,15 für Monoacetyldapson erwartungsgemäß größere mittlere Variationskoeffizienten. Die vollständigen Daten der Präzisionsversuche sind in Tabelle 9 dargestellt.

TABELLE 9: Variationskoeffizienten von PYR, DDS und MADDS in Serie und von Tag-zu-Tag

	Konzentration	Variationskoeffizient in Serie	Variationskoeffizient von Tag-zu-Tag
	(µg/ml)	(n = 5)	(n = 10)
PYR	0,10	5,59	4,36
	0,25	4,71	5,16
	0,50	1,91	4,69
	1,00	1,84	2,31
Mittelwert±SD		3,51±1,92	4,13±1,26
DDS	0,20	1,26	6,92
	0,50	0,89	4,92
	1,00	1,47	4,00
	2,00	1,20	3,84
Mittelwert±SD		1,21±0,24	4,92±1,42
MADDS	0,05	3,87	6,99
	0,125	1,24	5,08
	0,25	1,52	4,08
	0,50	0,93	4,43
Mittelwert±SD		1,89±1,34	5,15±1,30

Die Umrechnung von µg/ml zu µmol/l erreicht man durch die Multiplikation mit dem Faktor 3,5 für MADDS (MG 290) und 4,0 für DDS (MG 248) und PYR (MG 249).

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3.1.3. Sensitivität

Um die untere Erfassungsgrenze (Signal/Rauschpegel > 2) zu ermitteln, wurden die Substanzpeaks bei 10 ng/ml gemessen. Daraus resultierte eine konzentrations-abhängige Signalhöhe von 0,017 mV*ml/ng für PYR, 0,021 mV*ml/ng für DDS und 0,020 mV*ml/ng MADDS. Das Detektorrauschen lag unter den gegebenen chromatographischen Bedingungen bei 0,05 mV. Als Nachweisgrenze (limit of detection) ergaben sich somit 6 ng/ml für Pyrimethamin und 5 ng/ml für Dapson und Monoacetyldapson.

Als Quantifikationsgrenze (Präzision < 15%) für die drei Substanzen konnte eine Konzentration von 15 ng/ml bei Verwendung von 1,0 ml Plasmaproben ermittelt werden. Die mittleren Variationskoeffizienten (n=10) betrugen 14,8 (PYR), 13,8 (DDS) und 12,3 (MADDS).

3.1.4. Spezifität

Die Spezifität konnte durch die Analyse von zwanzig Plasmaproben HIV-infizierter, und medikamentös behandelter Patienten nachgewiesen werden. Es fanden sich keine Interferenzen mit Aciclovir, Clindamycin, Ketoconazol, Levomethadon, Ofloxacin, Pentamidin, Phenytoin oder Zidovudin. Lediglich das in der Prophylaxe mit Fansidar® enthaltene Sulfadoxin interferierte mit dem Dapsonpeak.

3.1.5. Linearität

Die Kalibration erfolgt mit Hilfe von vier relevanten Eichpunkten für jede der drei Substanzen. Die Eichpunkte zeigen einen linearen Verlauf in der Regressionsanalyse. Die Korrelationskoeffizienten liegen bei 0,9995 - 1,0. In Abbildung 11 und Abbildung 12 sind repräsentative Kalibrationskurven wiedergegeben.

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ABBILDUNG 11: Repräsentative Kalibrationskurven von DDS und MADDS

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ABBILDUNG 12: Repräsentative Kalibrationskurve von Pyrimethamin

3.2. Compliance

In die Auswertung der Medikamentenspiegel und der Einnahmetreue wurden nur Patienten mit vier oder mehr Blutprobenmessungen aufgenommen. Dieser Probenumfang war notwendig, um zwischen Compliance und Non-Compliance zu differenzieren. 20 der 31 Patienten erfüllten dieses Kriterium. Von elf Patienten waren weniger als vier Blutproben vorhanden. Sechzehn Patienten (80%) wurden als compliant klassifiziert. Vier Patienten (20%) wurden als non-compliant eingestuft.

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3.3. Medikamentenspiegel

Zur pharmakokinetischen Auswertung wurden nur Meßwerte der sechzehn als compliant klassifizierten Patienten herangezogen. Die Plasmakonzentrationen für Dapson lagen im Bereich von 36,1-2220,2 ng/ml. Der arithmetische Mittelwert aller Meßwerte betrug 675,9 ng/ml, der Median 557,2 ng/ml. Der zeitliche Verlauf der medianen Plasmakonzentrationen im steady-state Bereich zeigte eine Kinetik erster Ordnung mit einer Halbwertszeit von t½ = 30,4 Stunden. In Abbildung 13 sind die Plasmawerte in Abhängigkeit von der Anzahl an Stunden nach der Medikamenteneinnahme als Boxplots dargestellt.

ABBILDUNG 13: Boxplots der steady-state Plasmaspiegel von Dapson in ng/ml

Die sogenannten Boxplots bestehen aus Rechtecken, die 50% der Werte zwischen der 25. und 75. Perzentile beinhalten und Extensionslinien, welche die Minimal- und Maximalwerte darstellen. Die Mediane sind durch horizontale Balken innerhalb der Rechtecke angegeben. Extremwerte sind als Kreise und Sterne eingetragen.

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Abbildung 14 zeigt die entsprechenden Boxplots.

ABBILDUNG 14: Boxplots der steady-state Plasmaspiegel von Monoacetyldapson in ng/ml

Erklärung der Boxplots siehe Abbildung 13

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ABBILDUNG 15: Boxplots der steady-state Plasmaspiegel von Pyrimethamin in ng/ml

Erklärung der Boxplots siehe Abbildung 13

In Tabelle 10 sind die statistischen Daten (arithmetischer Mittelwert, Median, Minimum, Maximum, Standardabweichung) der gemessenen Plasmakonzentrationen in Abhängigkeit zu der Dauer nach Tabletteneinahme in Stunden zusammengefaßt.

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TABELLE 10: Plasmakonzentrationen von Pyrimethamin, Dapson und Monoacetyldapson

	4-12 h	20-28 h	44-52 h	68-76 h	92-100 h
Pyrimethamin
Mittelwert	336,0	324,9	263,9	229,9	244,3
Median	313,3	279,3	265,0	230,7	241,2
Minimum	50,6	113,4	44,0	137,8	159,2
Maximum	672,6	1052,2	444,5	323,4	316,6
Standardabweichung	130,5	172,1	98,7	64,0	48,8
Dapson
Mittelwert	1183,9	666,5	379,4	194,1	198,6
Median	1162,4	731,0	456,1	135,7	174,7
Minimum	331,2	104,4	127,0	84,6	36,1
Maximum	2220,2	1558,0	813,8	409,2	446,8
Standardabweichung	492,1	360,4	191,5	109,7	108,3
Monoacetyldapson
Mittelwert	555,2	293,2	225,7	64,5	53,6
Median	358,6	181,8	135,0	41,4	53,4
Minimum	59,6	28,5	34,6	24,0	13,2
Maximum	1452,3	951,3	911,7	196,7	109,6
Standardabweichung	405,1	268,5	212,3	51,0	27,5

Alle Konzentrationsangaben in ng/ml.

3.4. Acetyliererphänotyp

Der Acetyliererphänotyp der HIV-seropositiven Patienten wurde anhand des individuellen medianen Plasmaspiegelquotienten aus MADDS zu DDS bestimmt. Der Median der Quotienten für jeden Patienten berechnete sich aus allen für MADDS und DDS positiven Plasmaproben. Patienten mit einem Verhältnis von MADDS zu DDS kleiner 0,35 konnten als langsame Acetylierer und Patienten mit einem Verhältnis von MADDS zu DDS größer 0,35 als schnelle Acetylierer klassifiziert werden.

Von den klassifizierbaren Patienten (n=29) waren siebzehn (58,6%) langsame und zwölf (41,4%) schnelle Acetylierer. Der arithmetische Mittelwert der medianen

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ABBILDUNG 16: Anzahl von Patienten mit bestimmten MADDS/DDS-Plasmaspiegel-quotienten

Die Verteilung des Acetyliererstatus der untersuchten HIV-seropositiven Patienten entspricht dem Verhältnis in der Normalbevölkerung weißer Hautfarbe. Ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen Acetyliererphänotyp und Alter, Geschlecht oder Risikogruppenzugehörigkeit der Patienten war nicht vorhanden.

3.5. Wirksamkeit der Prophylaxe

In dem Kollektiv der 31 in die Studie aufgenommenen Patienten entwickelte ein Patient eine sekundäre, zerebrale Toxoplasmose und ein zweiter Patient eine sekundäre Pneumocystis carinii-Pneumonie innerhalb des Beobachtungszeitraumes. Der an Toxoplasmose erkrankte Patient war als non-compliant klassifiziert. In der

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Der an Pneumocystis carinii-Pneumonie erkrankte Patient hingegen war als compliant eingestuft. Die Medikamentenspiegel dieses Patienten war über einen Beobachtungszeitraum von 1154 Tagen mit 28 Plasmaproben gut dokumentiert. Der mittlere Abstand zwischen den Blutentnahmen lag bei 43 Tagen. Die Plasmakonzentrationen der beiden antiprotozoalen Wirkstoffe lagen bei dem betreffenden Patienten in einem relativ hohen Bereich. So erreichte die mittlere Pyrimethaminkonzentration 406,9 ng/ml mit einem Minimalwert von 216,4 ng/ml und einem Maximalwert von 672,6 ng/ml. Der Mittelwert der Dapsonspiegel bezifferte sich auf 866,2 ng/ml mit einem Minimalwert von 132,8 ng/ml und einem Maximalwert von 1727,2 ng/ml. Die Häufigkeit der sekundären Pneumocystis carinii-Pneumonie lag in der compliant Gruppe (n=16) somit bei 6,3%.

3.6. Routineeinsatz der Methode

Die Methode wurde von den medizinisch-technischen Mitarbeitern der II. Inneren Abteilung des Virchow-Klinikums übernommen und bewährt sich im klinischen Routineeinsatz. Das Verfahren dient in erster Linie der Überprüfung der Medikamentenspiegel von ambulanten HIV-seropositiven Patienten unter Pyrimethamin/Dapson-Prophylaxe.

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