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Kapitel 4. DISKUSSION

In der hier vorgestellten Arbeit konnte erstmals eine HPLC-Methode mit Festphasenextraktion zur simultanen Bestimmung von Dapson, dessen Hauptmetabolit Monoacetyldapson und Pyrimethamin entwickelt werden. Die bislang in der Literatur beschriebenen chromatographischen Methoden haben als gemeinsamen Nachteil die Flüssig-Füssig-Extraktion als Probenaufbereitung. Dieses Extraktionsverfahren setzt eine organische und eine anorganische Phase zur Trennung der Pharmaka von den Plasmabestandteilen ein. Durch mehrere aufeinanderfolgende Arbeitsschritte wie Mischung, Zentrifugation, Trennung, Evaporation und Redilution ist dieses Verfahren relativ komplex und zeitaufwendig (Edstein et al. 1984 ; Jones und Ovenell 1979 ; Lee et al. 1985 ; Lemnge et al. 1993 ; Opravil et al. 1994 ; Rønn et al. 1995 ). Zusätzlich waren einige der beschriebenen Verfahren wegen flüchtiger Bestandteile in der mobilen Phase nur schlecht zu standardisieren (Jones und Ovenell 1979 ) oder erreichten nur eine eingeschränkte Präzision mit Variationskoeffizienten zwischen 12,9 und 15,8% (Lee et al. 1985 ). Die analogen Variationskoeffizienten der hier präsentierten Methode lagen mit 4,1% (PYR), 4,9% (DDS) und 5,2% (MADDS) deutlich niedriger und weisen auf eine gute Reproduzierbarkeit hin. In den meisten der bisher veröffentlichen Nachweismethoden wurde nur die Standarddetektionswellenlänge 254 nm verwendet (Edstein et al. 1984 ; Jones und Ovenell 1979 ; Opravil et al. 1994 ). Im Gegensatz dazu wurden hier durch die systematische Analyse der Detektionswellenlängen in dem Bereich von 200 bis 300 nm die relativen Absorptionsmaxima 210 nm und 295 nm für Pyrimethamin und Dapson bestimmt und zur Quantifizierung genutzt. Um die Dauer der chromatographischen Analyse auf zwanzig Minuten zu verkürzen und die Sensitivität weiter zu erhöhen, wurde in der hier beschriebenen Methode eine Gradientenelution herangezogen. So lag die untere Nachweisgrenze mit 5 ng/ml für DDS, MADDS und 6 ng/ml für PYR in einem zufriedenstellend niedrigen Bereich. Andere HPLC-Methoden waren deutlich weniger sensitiv mit Nachweisgrenzen von 20 ng/ml für DDS und MADDS bis 30 ng/ml für PYR (Opravil et al. 1994 ). Durch die Anwendung der Festphasenextraktion können bis zu 24 Plasmaproben parallel vorbereitet werden. Die Wiederfindung der Substanzen war konstant und reproduzierbar und lag nach dieser Probenaufbereitung zwischen 88 und 92%. Zusammenfassend läßt sich sagen, daß die beschriebene Methode sensitiv, präzise, spezifisch und einfach durchzuführen ist. So konnte das Verfahren problemlos im klinischen Routineeinsatz verwendet werden. Die beschriebene chromatographische Methode wurde zusammen mit einem parallel entwickelten Verfahren zur simultanen Bestimmung von

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Die steady-state Plasmaspiegel der HIV-seropositiven Patienten wurden unter antiprotozoaler Prophylaxe mit zweimal wöchentlich 100 mg Dapson plus 25 mg Pyrimethamin ermittelt. Die medianen Plasmakonzentrationen von Dapson lagen mit 731 ng/ml circa 24 Stunden nach der Tabletteneinnahme nur geringfügig höher als die analogen Konzentrationen von 374 bis 710 ng/ml in der Malariaprophylaxe mit 100 mg Dapson plus 12,5 mg Pyrimethamin pro Woche (Edstein et al. 1990 ; Jones und Ovenell 1979 ; Lee et al. 1985 ). Eine Ursache dieser relativ niedrigen Plasmaspiegel könnte der Umstand sein, daß es bei einer Gabe zweimal pro Woche aufgrund der relativ kurzen Eliminationshalbwertszeit von ungefähr 24 Stunden bei Dapson nicht zu einer ausgeprägten Akkumulation kommt. Die Plasmakonzentrationen von Pyrimethamin nach ungefähr 24 Stunden lagen mit 325 ng/ml dagegen drei- bis fünfmal höher als die Spiegel in der Malariaprophylaxe (68-121 ng/ml). Diese Pyrimethaminplasmaspiegel korrelieren einerseits mit der etwa vierfachen Wochendosis, legen andererseits auch eine Akkumulation aufgrund der langen Eliminationshalbwertszeit von circa 100 Stunden nahe. Die minimalen medianen Plasmaspiegel vor der nächsten Tabletteneinnahme lagen bei 136 ng/ml für Dapson und 230 ng/ml für Pyrimethamin. Als Vergleich eignet sich die Studie von Opravil et al. 1994 , in der Plasmakonzentrationen unter einerer antiprotozoalen Prophylaxe mit 200 mg Dapson plus 75 mg Pyrimethamin einmal pro Woche ermittelt wurden. Hierbei zeigten sich minimale Pyrimethaminkonzentrationen von 125 ng/ml sechs bis sieben Tage nach Tabletteneinnahme. Die mediane Dapsonkonzentration war zu diesem Zeitpunkt unter die Nachweisgrenze von 20 ng/ml gesunken. Diese Daten verdeutlichen, daß zu einer Aufrechterhaltung der Dapsonplasmaspiegel in diesem Dosisbereich, mindestens eine Gabe zweimal pro Woche notwendig ist. Ein weiterer Kritikpunkt an der Arbeit von Opravil et al. 1994 ist die geringe Anzahl von nur 36 Plasmaproben bei 33 eingeschlossenen HIV-seropositiven Patienten. Als mögliche Ursache für die relativ niedrigen Plasmaspiegel von Dapson wurde bereits die geringgradige Akkumulation genannt. Andere Gründe könnten die bei AIDS-Patienten häufigen gastrointestinale Absorptionsstörungen sein, verursacht z.B. durch die HIV-assozierte Enteropathie, die CMV-Enteritis oder die intestinale Kryptosporoidose. In diesem Zusammenhang könnte der enterohepatischer Kreislauf bei der Exkretion von Dapson von Bedeutung sein. So konnte gezeigt werden, daß bei Patienten nach der oralen Applikation von Aktivkohle sich die Eliminationshalbwertszeit von Dapson ungefähr halbiert (Endre et

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In der kombinierten antiprotozoalen Prophylaxe hat Pyrimethamin den Wirkungsschwerpunkt in der Suppression von Toxoplasma gondii, während das Sulfon Dapson hauptsächlich gegen Pneumocystis carinii gerichtet ist. So lagen die für Toxoplasma gondii inhibitorischen Pyrimethaminkonzentrationen bei in-vitro Studien (Enzymaktivität der DHFS/Zellkultur) im Bereich von 40 bis 60 ng/ml (Derouin et al. 1989 ; Chio und Queener 1993 ). In der Behandlung der tierexperimentellen akuten Toxoplasmose hingegen waren Plasmaspiegel von mindestens 500 ng/ml zur Heilung erforderlich (Weiss et al. 1992 ). Die Therapie der akuten Toxoplasma gondii-Enzephalitis machte sogar Plasmakonzentrationen von über 750 ng/ml notwendig (Weiss et al. 1988 ). Diese Diskrepanz erklärt sich unter anderem durch die unterschiedliche Verteilung der Substanz in verschiedenen Kompartimenten. So beträgt beispielsweise der Liquorspiegel von Pyrimethamin nur 13 bis 28% des korrespondierenden Plasmaspiegels (McLeod et al. 1992 ; Weiss et al. 1988 ). Die medianen Plasmaspiegel von Pyrimethamin in der hier vorgestellten Arbeit (230-336 ng/ml) lagen deutlich unter den angenommenen therapeutischen Minimalspiegeln. Der beobachtete prophylaktische Effekt ist vermutlich durch die additive Wirkung von Dapson und die Akkummulation von Pyrimethamin im zentralen Nervensystem während der Langzeitmedikation bedingt.

Eine reversible Wachstumshemmung von Pneumocystis carinii konnte in Zellkulturen mit 100 ng/ml Dapson beobachtet werden (Cushion et al. 1985 ). In der Behandlung der tierexperimentellen Pneumocystis carinii-Pneumonie zeigte Dapson in einer täglichen Dosis von 100 mg/kg einen guten therapeutischen Effekt. Eine Dosis von 15 mg/kg pro Tag hingegen reichte nicht zu einer signifikanten Reduktion der intrapulmonalen Pneumocystis carinii Dichte aus (Walzer et al. 1988 ; Walzer et al. 1992 ). Unter der Prophylaxe mit 100 mg Dapson zweimal wöchentlich lagen die medianen Plasmaspiegel mit 136 bis 1184 ng/ml über den zur Wachstumshemmung von Pneumocystis carinii notwendigen Minimalspiegeln. Die hier applizierte Dapsonquantität entspricht umgerechnet circa 0,5 mg/kg pro Tag und beträgt daher nur ein Bruchteil der tierexperimentellen wirksamen Dosis. Grundsätzlich jedoch sind

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Im Rahmen der quantitativen Analyse der Plasmaspiegel von Dapson und Monoacetyldapson konnte der individuelle Acetyliererphänotyp der HIV-infizierten Patienten anhand des Quotienten aus MADDS und DDS bestimmt werden. Dapson ist als Testsubstanz zur Ermittlung des hepatischen Acetyliererstatus seit geraumer Zeit eingeführt (Gelber et al. 1971 ; Philip et al. 1984 ; Wiggan et al. 1991 ). Die Messung des MADDS/DDS-Quotienten kann weitgehend unabhängig von der Tabletteneinnahme durchgeführt werden, da das Verhältnis zwischen MADDS und DDS im Blutplasma wenige Stunden nach der Ingestion annähernd konstant bleibt (Gelber et al. 1971 ). Andere Pharmaka wie Procainamid und Isoniazid wurden alternativ zur Bestimmung des Acetyliererstatus eingesetzt (Reidenberg et al. 1975 ; du Souich und Lambert 1981 ). In dem hier untersuchten Kollektiv konnten 58,6% der Patienten als langsame und 41,4% als schnelle Acetylierer klassifiziert werden. Die Verteilung der Acetyliererphänotypen bei gesunden Probanden weißer Hautfarbe lag mit 43 bis 56% langsame Acetylierer und 44 bis 57% schnelle Acetylierer in einem korrespondierenden Bereich (Carr et al. 1978 ; May et al. 1990 ). Probanden asiatischer Herkunft hingegen sind überwiegend schnelle Acetylierer. So konnten z.B. bei einer Studie von Lee et al. 1985 die thailändischen Testpersonen zu 97% dem schnellen Acetyliererphänotyp zugeordnet werden. Opravil et al. 1994 konnten bei 18 von 33 eingeschlossenen HIV-infizierten Patienten den MADDS/DDS-Quotient bestimmen und eine gleichmäßige Verteilung mit neun langsamen und neun schnellen Acetylierern in diesem Kollektiv demonstrieren. Für einige Pharmaka konnte ein Zusammenhang zwischen Acetyliererstatus einerseits und therapeutischer Wirkung und unerwünschten Nebenwirkungen anderseits nachgewiesen werden. Auch die Plasmaspiegel der Ausgangssubstanzen waren teilweise von der Acetylierungskapazität abhängig. Bei Dapson hingegen ist der therapeutische Effekt, die Nebenwirkungsrate und die Dapsonplasmakonzentration unabhängig von dem Acetyliererphänotyp (May et al. 1990 ; Zuidema et al. 1986 ). Die Bestimmung des Acetyliererstatus scheint also für die Behandlung mit Dapson eine untergeordnete Rolle zu spielen. Der Einfluß der Acetylierungskapazität auf die Wirkung der in der Therapie der fortgeschrittenen HIV-Erkrankung verordneten Medikamente ist jedoch fast vollständig unbekannt. Die Einmalgabe von Dapson als Testsubstanz wäre für weiterführende Untersuchungen geeignet.

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Die Kombination von Dapson und Pyrimethamin zur Prophylaxe der Pneumocystis carinii-Pneumonie und der Toxoplasma gondii-Enzephalitis hat sich in mehreren Studien als hoch wirksam erwiesen (Girad et al. 1993 ; Grünewald et al. 1993 ; Opravil et al. 1995 ; Podzamczer et al. 1993 ). So konnte in einer statischen Analyse verschiedener Studien gezeigt werden, daß das Risiko an PCP zu erkranken bei den auf Dapson basierenden Prophylaxen gegenüber der Inhalation mit Pentamidin mit einem relativen Risiko von 0,93 in etwa gleich war. Für die zerebrale Toxoplasmose zeigte sich im Vergleich mit Trimethoprim/Sulfamethoxazol ebenfalls eine ähnliche Wirksamkeit (Ioannidis et al. 1996 ). Die Kombinationsprophylaxe mit Dapson und

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