Petersen, Simone: Identifizierung genetischer Läsionen in der Progression und Metastasierung von Bronchialkarzinomen

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Kapitel 2. Material

2.1. Puffer und Lösungen

1x TBE:

0,089 M Tris-HCl pH 7,5

0,089 M Borat

0,02 M EDTA

20x SSC:

3 M NaCl

0,3 M Natriumcitrat

20x SSPE:

3,6 M NaCl

0,2 M Natriumphosphat

0,02 M EDTA

pH 7,7

1x PBS:

0,0015 M KH2PO4

0,008 M Na2HPO4

0,0027 M KCl

0,139 M NaCl

Stop-Lösung:

98% Formamid

10 mM EDTA

0,025% Bromphenolblau

DEPC-H2O:

1 l Aqua bidest.

1 ml Diethylpyrocarbonat

über Nacht unter dem Abzug einwirken lassen

autoklavieren

2.2. Medien

1x LB-Medium:

1% Bacto Tryptone (Difco)

0,5% Bacto Yeast Extract (Difco)

1% NaCl


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1x LBAgar:

LB-Medium mit 1,5 % Bacto Agar (Difco)

YT-Broth-Medium:

1,6% Bacto Tryptone (Difco)

1% Bacto Yeast Extract (Difco)

0,5% NaCl

RPMI-Medium:

RPMI 1640 (PAA)

10% FKS

1% Glutamin

L15-Medium:

10% FKS

0,5% Glutamin

Waymouth’s-Medium:

Waymouth MB 752/1 (SIGMA)

pro Liter 29,9 ml Natriumbicarbonat (7,5% w/v)

pH 7,0

10% FKS

McCoys-Medium:

McCoys 5A-Medium (GIBCO BRL)

10% FKS

1% Glutamin

Einfriermedium (für humane Zellen):

95% FKS

5% DMSO

2x Bakterien-Einfriermedium:

8,25 g K2HPO4*3H2O

1,80 g KH2PO4

0,45 g Na-Citrat*2H2O

0,09 g MgSO4*7H2O

5,90 g (NH4)2SO4

35,75 ml 87%-iges Glycerol

auf 500 ml H2O auffüllen, autoklavieren


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2.3. Zellinien

Tab. 3: Auflistung der in der Arbeit verwendeten Tumorzellinien

Name

Diagnose

Herkunft

Medium

H526

Kleinzeller

ATCC

RPMI

H209

Kleinzeller

ATCC

RPMI

D-51

Adenokarzinom

Charité

L15

D-54

Adenokarzinom

Charité

L15

D-97

Großzelliges Karzinom

Charité

L15

D-117

Adenokarzinom

Charité

L15

BEN

Metastase NSCLC

DSMZ

DMEM+4,5 g Glucose

DMS79

Kleinzeller

ATCC

Waymouth's

H82

Kleinzeller

ATCC

RPMI

CPC-N

Kleinzeller

DSMZ

McCoys

COLO-668

Metastase von Kleinzeller

DSMZ

RPMI

COLO-677

Kleinzeller

DSMZ

RPMI

COLO-699

Adenokarzinom

DSMZ

RPMI

H446

Kleinzeller

ATCC

RPMI

DMS114

Kleinzeller

ATCC

Waymouth's

H1688

Metastase von Kleinzeller

ATCC

RPMI

H187

Kleinzeller

ATCC

RPMI

H378

Kleinzeller

ATCC

RPMI

DV-90

Adenokarzinom

DSMZ

RPMI

SHP77

Großzelliges Karzinom

ATCC

RPMI

A427

Nichtkleinzeller

ATCC

RPMI

N417

Kleinzeller

ATCC

RPMI

2.4. Tumormaterial

Die Arbeiten basieren auf insgesamt drei Tumorkollektiven. Zum einen wurden Proben von Autopsien, die an der Pathologie der Charité, dem Pathologischen Institut der Christians-Albrecht-Universtät Kiel und dem Department für Pathologie der Universität Zürich durchgeführt wurden, untersucht. Tumor- und


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Normalgewebsproben wurden in der Regel tiefgefroren. Dieses Kollektiv wurde insbesondere für die Analyse der hämatogenen Metastasierung von Lungenkarzinomen mit herangezogen, indem synchrone Primär- und Sekundärtumoren untersucht werden konnten.

Bei den weiteren Kollektiven handelt es sich um Resektate von Patienten mit einem Karzinom der Lunge, die an der Charité von Herrn Prof. Gellert operiert wurden. Das Gewebe vom Primärtumor, etwaigen Metastasen und konstitutionellem Normalgewebe wurde innerhalb von 30 min in Flüssigstickstoff schockgefroren und bei -80°C bis zur Aufarbeitung asserviert. Aus angelegten Primärkulturen wurden die Zellinien D51, D54, D97 und D117 etabliert (siehe Abschnitt 2.3 ).


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