Petersen, Simone: Identifizierung genetischer Läsionen in der Progression und Metastasierung von Bronchialkarzinomen

Kapitel 3. Methoden

3.1. Comparative Genomische Hybridisierung (CGH)

Die CGH ist eine molekularzytogenetische Methode, die der Detektion chromosomaler Imbalanzen v.a. in soliden Tumoren dient.

Sie beruht auf der kompetitiven Hybridisierung von unterschiedlich markierter Tumor- und Normal-DNA auf normale Chromosomenmetaphasen, die aus Blutlymphozyten präpariert werden. Der dabei eingesetzte Überschuß an humaner Cot1-DNA dient der Absättigung hochrepetitiver Sequenzen und somit der Suppression ungewünschter Fluoreszenzsignale, insbesondere im Bereich der Chromosomenzentromeren.

Die Genome binden quantitativ an ihre entsprechenden Bindungsstellen auf den Chromosomen. Im Tumor relativ weniger vorkommende Sequenzen führen zur quantitativ überwiegenden Hybridisierung von Normal-DNA in diesem Bereich, das Fluoreszenzsignal des Normalgenoms überwiegt. Im umgekehrten Fall einer DNA-Überrepräsentierung oder Amplifkation bindet entsprechend mehr Tumor-DNA und


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die Fluoreszenz des Tumorgenoms überwiegt. Durch die Aufnahme unterschiedlicher Bilder am Fluoreszenzmikroskop mit geeigneten Farbfiltern und einer anschließenden quantitativen Auswertung der Fluoreszenzsignale entlang der Chromosomen, können die DNA-Imbalanzen eines Tumors berechnet werden. Das Ergebnis wird in Form eines Ratio-Profiles dargestellt werden, bei dem Ausschläge nach links einer Deletion und Ausschläge nach rechts einer DNA-Überrepräsentierung entsprechen (siehe Abbildung 4).

Abb. 4 Die Komparative Genomische Hybridisierung (CGH)

3.1.1. Indirekte Markierung von DNA mittels Nicktranslation

10x NT-Puffer:

0,5 M Tris pH 8,0

50 mM MgCl2

0,5 mg/ml BSA

dNTP’s:

dATP, dCTP, dGTP je 0,5 mM

dTTP 0,1 mM


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Während der Nicktranslation werden durch die DNase Einzelstrangbrüche (”Nicks“) in der DNA erzeugt. Bei der Neusynthese von DNA durch die Kornberg-Polymerase werden an den Fragmentenden Hapten-modifizierte Nukleotide eingebaut. Dabei wurde insbesondere Biotin-16-dUTP im Falle der Markierung von Tumor-DNA und Digoxigenin-11-dUTP im Falle der Normal-DNA aus Blutlymphozyten eingesetzt.

Zur Markierung wurden jeweils 5 µg DNA in einem Endvolumen von 31 µl gelöst und 5 µl NT-Puffer, 5 µl ß-Mercaptoethanol (0,1 M), 5 µl dNTP‘s, 2 µl Biotin-16-dUTP bzw. Digoxigenin-11-dUTP (beides Boehringer Mannheim), 1 µl DNase (3 mg/ml, 1:2000 verdünnt) und 1 µl Kornberg-DNA-Polymerase (Boehringer Mannheim) dazupipettiert. Die Reaktion erfolgte für 30 bis 40 min bei 14-16°C im Wasserbad.

Zur Überprüfung der Fragmentlängen wurden 5 µl-Aliquots der Proben auf 1,5%-ige Agarosegele aufgetragen. Die optimale Fragmentlänge sollte zwischen 200-500 bp liegen. Gegebenenfalls wurde die Inkubation nach Zugabe von frischem Enzym verlängert und erneut getestet. Die Reaktion wurde mit 2 µl EDTA (0,5 M) und 2 µl SDS (20%) gestoppt. Die Proben wurden bis zur Hybridisierung bei \|-\|20°C gelagert.

3.1.2. Hybridisierung

Mastermix:

20% Dextransulfat/4x SSC

Denaturierungslösung für Objektträger:

49 ml Formamid

7 ml 20x SSC (pH 5,3)

16 ml H2O bidest.

pH 7,0

Zur Hybridisierung wurden 10 µl Tumor-DNA, 10 µl Normal-DNA, 30 µl humane Cot1-DNA (1 mg/ml, Gibco) sowie 1 µl Heringssperm-DNA (10 mg/ml, Promega) mit 5,1 µl 3 M Natriumacetat und 150 µl absolutem Ethanol über Nacht bei -20°C oder für


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30 Minuten bei \|-\|80°C gefällt. Die DNA wurde daraufhin bei 14000 rpm bei 4°C für 30 min zentrifugiert, dekantiert, mit 70% Ethanol gewaschen, erneut zentrifugiert, dekantiert und luftgetrocknet. Danach wurde das Pellet in 5 µl Formamid resuspendiert und bei 37°C für 10 Minuten inkubiert. Nach Zugabe von 10 µl Mastermix wurde die DNA für 5 Minuten bei 77°C denaturiert und anschließend zur Vorhybridisierung 2-3 h bei 37°C inkubiert. Dieser Schritt diente der Bindung von Cot 1-DNA an repetitive DNA-Sequenzen innerhalb der Genome.

In der Zwischenzeit wurden die Objektträger denaturiert. Zur Hybridisierung auf normale Chromosomen-Metaphasen wurden vornehmlich kommerziell erwerbliche Objektträger der Firma Vysis eingesetzt. Diese wurden für 5 Minuten in einer Küvette mit auf 70°C vorgewärmter Denaturierungslösung denaturiert und daraufhin in einer aufsteigenden Alkoholreihe (70%, 90%, 100% eiskalter Ethanol) dehydriert und luftgetrocknet.

Auf diese Objektträger wurden die Proben aufgetragen, mit 16x16 mm2 großen Deckgläsern abgedeckt und mit Flüssigklebstoff abgedichtet. Die Hybridisierung erfolgte für 3 Tage in einer feuchten Kammer bei 37°C im Wasserbad.

3.1.3. Detektion

Bei diesem Schritt erfolgt der Nachweis der hybridisierten DNA durch die Kopplung von sekundären Fluorochrom-gekoppelten Antikörpern an Digoxygenin bzw. Biotin. Dazu wurden die Deckgläschen entfernt und die Objektträger zunächst mehrfach gewaschen: dreimal 2 min in Formamid/2x SSC bei 37°C, dreimal 2 min in 0,1x SSC bei 60°C und einmal 5 min in 4x SSC/0,1x Tween 20 bei 37°C. Zum Abblocken unspezifischer Bindungen wurden anschließend pro Objektträger 125 µl 3%-iges BSA in 4x SSC/0,1x Tween 20 aufgetragen und bei 37°C in der feuchten Kammer für 20 min inkubiert. Nach einem weiteren Schritt in 4x SSC/0,1x Tween 20 bei 37°C


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erfolgte der eigentliche Detektionsschritt mit je 125 µl 3%-iger BSA-Lösung, der im Verhältnis 1:100 Anti-Dig-Rhodamin (TRITC, Boehringer Mannheim) und 1:125 Fluoreszein-Avidin (FITC, Vector Laboratories) zugegeben worden sind. Die Inkubation wurde in der feuchten Kammer bei Dunkelheit für 30 min im 37°C-Wasserbad durchgeführt. Anschließend wurden die Objektträger noch dreimal je 3 min in 4x SSC/0,1x Tween 20 bei 45°C gewaschen und für 5 min in DAPI-Lösung (40 ng/ml) gefärbt. Nach einem kurzen Spülen in Aqua bidest. wurden die Objektträger in 35 µl DABCO eingebettet.

Zur Verzögerung des Ausbleichens der Fluorochrome wurden die letzten Schritte unter Vermeidung direkter Belichtung durchgeführt und die Präparate in einer Mappe bei 4°C aufbewahrt.

3.1.4. Bildaufnahme

Pro Fall wurden ca. 15 Metaphasen unter Verwendung eines Zeiss-Axiophot-Fluoreszenzmikroskopes aufgenommen. Dabei wurden entsprechend angefertigte einzelne Filter für FITC (Zeiss-Filterset 10, Anregung: BP 450-490, Emission: BP 515-565), TRITC (Chroma-Filterset HQ Cy3+Exzitationsfilter vom Zeiss-Filterset 15, Anregung: BP 546/12, Emission: BP 570-650) sowie DAPI (Zeiss-Filterset 02, Anregung: G365, Emission: LP 420) verwendet.

Für die Digitalisierung der Fluoreszenzbilder wurde eine CCD-Kamera (Photometrics, Tucson, Arizona) verbunden mit einem Macintosh Quadra 950 (Apple, Cupertino, Kalifornien) mit dem Softwareprogramm Nu200 2.0 benutzt. Die Belichtung erfolgte mit einer 100 W Quecksilberlampe. Die Belichtungszeiten hingen von der Intensität der Fluoreszenzsignale ab und lagen für FITC zwischen 2 und 6 s, für TRITC zwischen 1 und 5 s und für DAPI zwischen 0,1 und 0,3 s. Die von der CCD-Kamera


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aufgenommenen Fluoreszenzbilder wurden als Dateien im 8 bit-TIFF-Format (256 Graustufen) gespeichert.

3.1.5. Statistische Auswertung

Die so gewonnenen Metaphasen-Bilder wurden in mehreren Schritten mit einem in der Arbeitsgruppe erstellten CGH-Programm zu Karyogrammen sortiert. Dabei erfolgte zunächst die Übereinanderlegung der einzelnen Bilder und die Berechnung eines Ratio-Bildes aus dem FITC- und TRITC-Bild, wobei die Veränderungen in Falschfarben dargestellt werden. In weiteren Schritten wurden die Metaphasen zerschnitten, karyotypisiert und alle Metaphasen eines Falles übereinandergelegt. Die Veränderungen eines Falles sind als Summenkaryogramm darstellbar und verschlüsseln DNA-Überrepräsentationen (grün), DNA-Verluste (rot) bzw. die Äquivalenz zwischen Tumor- und Normal-Genom (blau). Auf die Details des Programmes kann in diesem Rahmen nicht eingegangen werden. Die in diesem CGH-Programm verwendeten Algorithmen sind publiziert (Roth et al, 1997).

Bei der Analyse größerer Fallzahlen ist die Zusammenfassung von einzelnen Entitäten bzw. Subgruppen möglich. Dabei werden die entsprechenden Fälle einer Tumorgruppe entweder als sogenannte Superkaryogramme oder als Histogramme zusammengefaßt. Das ermöglicht einen Hinweis auf chromosomale Veränderungen und deren Inzidenz in der entsprechenden Entität, macht aber andererseits auch einen statistischen Vergleich zweier Subgruppen möglich. Die Details bzw. deren Anwendung ist den beigefügten Arbeiten (Bockmühl et al, “Patterns of chromosomal alterations in metastasizing and non-metastasizing primary head and neck carcinomas“ sowie Petersen et al, “Patterns of chromosomal imbalances in adenocarcinoma and squamous cell carcinoma of the lung“ ) zu entnehmen.


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3.2. Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung von PAC-Klonen

Die Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung von PAC-Klonen dient zum einen der chromosomalen Lokalisation von Genen, kann aber auch bei der Hybridisierung auf Tumor-Metaphasen Hinweise auf chromosomale Rearrangements liefern. Die Hybridisierung ähnelt prinzipiell den o.a. Protokollen für die CGH. Die PAC-Klone wurden ebenfalls mittels Nicktranslation markiert und auf Metaphasen-Chromosomen hybridisiert (ohne Einsatz von Normal-DNA und Cot1-DNA). Die wie unter 3.2.1 präparierten Tumor-Metaphasen wurden nach dem Auftropfen mindestens eine Woche getrocknet und in der entsprechenden Denaturierungslösung für 2 bis 2,5 min denaturiert. Die Proben wurden ohne längere Vorhybridisierungszeit aufgetragen.

Die Detektion erfolgte mit dem entsprechenden Fluorochrom wie unter 3.1.3 angegeben.

3.2.1. Metaphasenpräparation von Tumorzellen

Hypotone Lösung:

0,8% Natriumcitrat

Fixativ:

75% Methanol

25% Essigsäure

Die Präparation von Tumormetaphasen erfolgte von 60-70% konfluenten Zellen. Diese wurden über Nacht mit 10-20 µl Colcemid (10 µg/ml) auf 15 ml Medium behandelt. Die Zellen wurden am nächsten Tag mit 1x PBS gespült und mit 1,5 ml frischem Trypsin-EDTA für 5 min bei 37°C inkubiert bis alle Zellen abgelöst waren. Das Trypsin wurde durch Zugabe von Medium gestoppt. Nach dem Mixen mit der Pipette wurde die homogene Zellsuspension in Zentrifugenröhrchen transferiert und für 10 min bei 800 rpm zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in Hanks-Lösung gewaschen und erneut zentrifugiert.


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Der Überstand wurde entfernt und tropfenweise 5 ml frisch angesetzte, vorgewärmte (37°C) hypotone Lösung zugegeben. Dabei muß eine Verklumpung des Zellpellets unbedingt vermieden werden. Die Zellen wurden für 20 min im 37°C-Wasserbad inkubiert und anschließend 8 min bei 800 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt, das Pellet durch Schnipsen am unteren Rand des Röhrchens aufgelockert, und in 5 ml Fixativ resuspendiert. Dieser Fixationsschritt wurde nach der Zentrifugation fünf- bis sechsmal wiederholt. Nach der letzten Zentrifugation wurde das Pellet in 0.5 bis 1 ml Fixativ resuspendiert. Davon wurden 3 bis 4 Tropfen auf einen kalten, feuchten Objektträger aufgetropft und im Phasenkontrastmikroskop untersucht. Danach wurde die optimale Verdünnung ermittelt und die Metaphasen so aufgetropft, daß die Metaphasen gut gespreizt waren.

3.3. Isolation von genomischer DNA

Digestionspuffer:

50 mM Tris (pH 8,5)

1 mM EDTA

0,5% Tween 20

Zur Präparation von genomischer DNA aus Zellinien wurde das Zellkulturmedium abgesaugt, die Zellen mit 1x PBS gewaschen und trypsiniert. Das Trypsin wurde durch Zugabe von Medium inaktiviert und die Zellen anschließend im Zellkultur-Röhrchen bei 1000 rpm für 5 min zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 1x PBS gewaschen und erneut zentrifugiert. Die Zellen wurden in 800 µl Digestions-Puffer aufgenommen und mit 40 µl Proteinase K (20 mg/ml) versetzt. Der Verdau erfolgte für 48 h bei 50°C.

Von den tiefgefrorenen Tumorproben wurden am Gefriermikrotom 20-30 Schnitte (Schnittdicke 30 µm) angefertigt und in 2 ml-Eppendorfgefäße mit je 800 µl Digestionspuffer überführt. Der erste und letzte Schnitt des jeweiligen Blockes wurde


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auf Objektträger aufgezogen, und zur histologischen Beurteilung mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt. Der Verdau erfolgte daraufhin über Nacht bei 50°C mit 20-30 µl Proteinase K (20 mg/ml). Zur DNA-Extraktion wurde das Lysat mit dem gleichen Volumen Phenol:Chloroform:Isoamylalkohl 25:24:1 (pH 8,0) ausgeschüttelt und bei RT für 15 min bei 14000 rpm zentrifugiert. Die wäßrige Phase wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt und erneut mit Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol ausgeschüttelt. Nach der Zentrifugation wurde die wäßrige Phase abpipettiert und zum Entfernen von Phenol-Resten mit dem gleichen Volumen Chloroform:Isoamylalkohol 24:1 versetzt und wie oben beschrieben zentrifugiert.

Anschließend wurde die obere Phase mit 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat und 1 Volumen Isopropanol gefällt.

Die Präzipitation erfolgte durch Zentrifugation bei 14000 rpm bei 4°C für 30 min. Der Überstand wurde entfernt und das Pellet mit 70%-igem Ethanol gewaschen und bei 14000 rpm, 4°C für 20 min zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und das luftgetrocknete DNA-Pellet in 50-100 µl H2O gelöst.

3.4. Restriktionsverdau

Zum Verdau von genomischer DNA für Southern Blot-Analysen wurden 10 µg DNA mit 60 U Restriktionsendonuclease (Boehringer Mannheim) in Anwesenheit des empfohlenen Puffers bei 37°C über Nacht inkubiert.

Für die Restriktionsanalyse von Plasmid-DNA wurden 0,5-2 µg aufgereinigtes Plasmid mit einer Einheit Restriktionsenzym pro µg DNA verdaut. Die Inkubation erfolgte für 1-3 h bei 37°C.


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3.5. DNA-Agarose-Gelelektrophorese

Die Auftrennung von DNA-Fragmenten erfolgte mittels Agarosegelen in 0,5x TBE, wobei die Konzentration der Gele in Abhängigkeit von der Fragmentlänge variiert wurde. Für Southern Blot-Analysen wurde die restringierte genomische DNA in 0,7%-igen Agarosegelen bei 60 V für 3-4 h aufgetrennt.

Die elektrophoretische Auftrennung von Plasmid-DNA erfolgte in 1%-igen und die von PCR-Fragmenten in 1,5%-igen Agarosegelen bei 100 V.

3.6. Southern Blotting

Bei dieser Technik werden elektrophoretisch aufgetrennte DNA-Fragmente auf Nitrozellulose transferiert. Dazu wurden die Gele nach der Dokumentation zunächst in 0,25 M Salzsäure für 30 min depuriniert. Anschließend wurden sie 2x 15 min in Denaturierungslösung (1,5 M NaCl/0,5 M NaOH) gewaschen und in zwei weiteren 15-minütigen Waschschritten in 3 M NaCl/1 M Tris (pH 7,0) neutralisiert. Der Transfer der DNA erfolgte über Vakuumblotting bei 5 mm Hg für 90 min in 10x SSC. Dazu wurden die Gele kurz in 10x SSC gewaschen und die Nitrozellulose-Membran (Amersham) in 2x SSC getränkt. Auf angefeuchtetes Whatmanpapier und die darauf befindliche Membran wurde die Maske gelegt, um einen luftdichten Abschluß der Blot-Apparatur zu gewährleisten. Anschließend wurde das Agarosegel aufgelegt und das Vakuum angeschlossen. Nach dem Abbau der Apparatur wurde die Membran 5 min in 2x SSC gewaschen, luftgetrocknet und 3 min unter UV-Licht quervernetzt.

3.7. Allelotypisierung

Die LOH-Analyse (loss of heterozygosity) basiert auf der Untersuchung von polymorphen genetischen Markern innerhalb des Genoms. Es werden heutzutage vor allem sogenannte Mikrosatelliten-Polymorphismen eingesetzt, bei dem sich die


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Allele durch die Anzahl kurzer repetitiver Sequenzen unterscheiden. Insbesondere wenn sich das paternale und maternale Allel in der Fragmentlänge unterscheiden (Heterozygotie), kann durch den Vergleich beider Allele in Tumor- und Normal DNA eines Individuums eine Deletion als Heterozygotie-Verlust (LOH) festgestellt werden. Der Nachweis von Allelverlusten kann damit zur Lokalisation von Tumorsuppressorgenen (”deletion mapping“) benutzt werden.

Die genauen präparativen Schritte sowie die Auswertung sind in den beigefügten Arbeiten (Petersen et al, ”Allelic loss on chromosome 10q in human lung cancer: association with tumor progression and metastatic phenotype“ und ”Distinct regions of allelic imbalance on chromosome 10q22-q26 in squamous cell carcinomas of the lung“) aufgeführt.

3.8. SSCP-Analyse

Die Einzelstrang-Konformations-Polymoprhismus-Analyse (Single Strand Conformation Polymorphism Analysis, SSCP) dient der Detektion von DNA-Mutationen auf Nukleotid-Ebene. Dabei werden mittels PCR amplifizierte DNA-Fragmente denaturiert und auf einem hochauflösenden Poylacrylamid-Gel unter nicht-denaturierenden Bedingungen aufgetrennt.

150 ml SSCP-Gel:

37,5 ml MDE-Hydrolink-Lösung (Biozym)

9,0 ml 10x TBE

112,5 ml Aqua bidest.

600 µl 10% APS

60 µl TEMED

Zur Mutationsanalyse des DMBT1-Genes wurden PCR-Fragmente von Tumor- und Normalgewebs-Proben, die Chromosom 10q-Allelimbalanzen aufwiesen amplifiziert. Dazu wurden zu je 100 ng DNA bzw. cDNA je 15 pmol der Primer dmbt1-8f 5'-


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GTCCTACCTGTGGAGCTG-3' und dmbt1-8r 5'-GACCAACCTCAAGGTGGCAT-3' und 200 µmol dNTP’s sowie Taq-Polymerase im entsprechenden Puffer pipettiert. Die Proben wurden denaturiert für 2 min bei 98°C und dann in 35 Zyklen amplifiziert (30 s bei 95°C, 15 s bei 58°C und 1 min bei 72°C) gefolgt von einem 10-minütigen Auffüllschritt bei 72°C. Ein 950 bp-langes cDNA-Fragment sowie die genomischen Fragmente der STS 60k, g14, g14ext, 101n, 36k und 74k wurden amplifiziert wie publiziert (Mollenhauer et al, 1997).

Für die Einzelstrang-Polymorphismus-Analyse wurden 0,8 mm dicke Polyacrylamidgele eingesetzt, die mindestens 3 h polymerisiert waren.

10 µl PCR-Produkt wurden mit 2 µl 1% SDS/10 mM EDTA und 2 µl Stoplösung (aus Sequenzier-Kit) versetzt, 15 min bei 98°C denaturiert und sofort für mindestens 10 weitere Minuten auf Eis gestellt. Die Auftrennung der Fragmente erfolgte über Nacht bei 8 Watt in 1x TBE.

Nach dem Lauf erfolgte zur Sichtbarmachung der PCR-Fragmente die Silberfärbung nach Budowle. Dazu wurde das Gel 10-15 min in 1%-iger Salpetersäure fixiert, kurz in Aqua bidest. gespült, 20-25 min in 0,2%-iger Silbernitratlösung gefärbt und 5-10 min in Aqua bidest. gewaschen. Die Entwicklung erfolgte in 0,28 M Natriumcarbonatlösung, der erst unmittelbar vor Gebrauch 37%-ige Formaldehydlösung (1,5 ml auf 3 l) hinzugefügt worden ist. Nach dem Erscheinen der Banden, wurde das Gel kurz in Wasser gespült und anschließend in 10%-iger Essigsäure fixiert. Nach kurzem Waschen in H2O wurde das Gel auf Filterpapier aufgezogen und ca. 1-1,5 h bei 80°C auf dem Geltrockner getrocknet.

3.9. Direkte Sequenzierung von PCR-Produkten

Diese Technik wurde insbesondere zur Mutationsanalyse des PTEN/MMAC1-Genes eingesetzt. Dazu wurden alle 9 Exons amplifiziert. Die Sequenzierung der PCR-


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Produkte erfolgte radioaktiv. Detaillierte Protokolle sind in der beigefügten Originalarbeit ”Distinct regions of allelic imbalance on chromosome 10q22-q26 in squamous cell carcinoma of the lung“ nachzulesen.

3.10. RNA-Präparation aus Zellen

Lysis-Puffer:

100 g Guanidinothiocyanat

1,54 g Natriumcitrat

1,01 g Sarkosil

116,8 ml DEPC-Wasser

autoklavieren

vor Gebrauch 2% ß-Mercaptoethanol hinzufügen

Phenol:

pulverisiertes Phenol bei 50°C schmelzen

zweimal mit 1 Volumen sterilem Aqua dest. ausschütteln

Zur Isolierung von Gesamt-RNA aus Zellen wurde nach dem Entfernen des Mediums mit eiskaltem 1x PBS gewaschen. Nach Zugabe von 4 ml Lysis-Puffer pro T175-Zellkulturflasche (Falcon) wurde das Lysat in Zellkulturröhrchen (Sarstedt) überführt. Die Proben sind in diesem Stadium sehr stabil und wurden gegebenenfalls bei -80°C aufbewahrt.

Die Lysate wurden mit 1/10 Volumen 2 M Natriumacetat (pH 4,0) angesäuert, gemixt, mit 1 Volumen Phenol versetzt, wieder gemischt und nach Zugabe von 2/10 Volumen Chloroform:Isoamylalkohol (24:1) und erneutem Mixen 5-7 min auf Eis inkubiert bis ein milchiger Niederschlag erscheint. Nach 20-minütiger Zentrifugation bei 9000 rpm bei 15°C, wurde der Überstand vorsichtig in ein neues Röhrchen überführt und 30 min bei -20°C mit 1 Volumen Isopropanol gefällt.

Die Proben wurden anschließend bei 11000 rpm für 20 min bei 4°C pelletiert. Nach Entfernen des Überstandes und einem Waschschritt mit 3 ml 80%-igem Ethanol und


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erneuter Zentrifugation bei 11000 rpm für 5 min bei 4°C, wurde der Überstand erneut entfernt.

Das luftgetrocknete Pellet wurde in 500 µl Lysis-Puffer gelöst und mit 1 Volumen Isopropanol für 1 h bei -20°C gefällt. Nach Präzipitation der RNA bei 14000 rpm für 20 min bei 4°C, und einem erneuten Waschschritt mit 80%-igem Ethanol wurde das luftgetrocknete RNA-Pellet in 50-100 µl DEPC- H2O gelöst und bei -80°C aufbewahrt.

3.11. RNA-Präparation aus Gewebe mittels QIAGEN-RNeasy Mini Kit

Um RNA aus Gewebe zu isolieren, wurden zunächst jeweils 60 Cryostat-Schnitte in Eppendorf-Röhrchen überführt, in die bereits 600 µl Lysispuffer vorpipettiert wurden.

Um das Gewebe vollständig aufzuschließen, wurde das Lysat über QIAshredder 3 min kalt bei 14000 rpm zentrifugiert. Das Eluat wurde mit 1 Volumen 70%-igem Ethanol mittels Pipette gut gemischt und auf RNeasy-Säulen aufgetragen. Nach kurzer Zentrifugation bei 10000 rpm wurden die Säulen zunächst mit 700 µl RW1-Puffer versetzt, bei 10000 rpm für eine Minute zentrifugiert und noch zweimal mit 500 µl RPE-Puffer gewaschen.

Die Elution der RNA in ein neues Röhrchen erfolgte mittels 30 µl RNase-freiem Wasser über einen 2-minütigen Zentrifugationsschritt (10000 rpm).

Um die Kontamination mit DNA zu beseitigen, wurden die eluierten Proben mit 2 µl RQ-RNase freier DNase (Promega) versetzt und 30 min bei 37°C inkubiert.

Um die DNase anschließend zu inaktivieren bzw. zu entfernen, wurden die Proben mit 70 µl RNase-freiem Wasser aufgefüllt, mit 350 µl RLT-Puffer sowie 250 µl absolutem Ethanol gemischt, auf die Säulen aufgetragen und bei 10000rpm 15 s zentrifugiert. Nach zwei Waschschritten mit 500 µl RPE-Puffer wurden die Säulen in neue Röhrchen überführt und mit 30 µl RNase-freiem Wasser eluiert.


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3.12. RNA-Agarose-Gelelektrophorese

10x MEN:

200 mM MOPS

50 mM Natriumacetat

10 mM EDTA

pH 7,0

RNA-Laufpuffer:

500 µl Formamid

2 µl EDTA (1 M)

5 µl Ethidiumbromid (10 mg/ml)

0,1% Bromphenolblau

Gesamt-RNA wurde in 1%-igen denaturierenden Agarosegelen aufgetrennt. Diese enthielten 6% Formaldehyd und 1x MEN. 10 µg RNA wurden vor dem Auftragen mit dem gleichen Volumen RNA-Laufpuffer gemischt, 10 min bei 56°C denaturiert und auf Eis abgekühlt. Die Elektrophorese erfolgte bei 60 V in 1x MEN-Puffer.

3.13. Northern Blotting

Das unter dem UV-Transilluminator fotographierte Gel wurde zum Transfer der RNA auf Nitrozellulose-Membranen (Amersham) zweimal 20 min in Aqua bidest. gespült, um das Formaldehyd zu entfernen. Der eigentliche Transfer erfolgte mittels Kapillarblotting. Dazu wurde in 10x SSC-getränktes Whatman-Papier so auf eine Glasplatte gelegt, daß die Ränder überstehen und in eine mit 10x SSC gefüllte Schale reichen. Darauf wurde umgekehrt (Taschen nach unten) das RNA-Gel gelegt. Auf dieses wurde luftblasenfrei eine in 2x SSC-befeuchtete Nitrozellulose-Membran und darüber zwei ebenfalls angefeuchtete und vier trockene Whatman-Papiere gelegt. Diese wurden mit einem Stapel saugfähigem Papier überschichtet und beschwert. Der Transfer erfolgte für mindestens 12 h.


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Anschließend wurde die Membran 5 min in 2x SSC gewaschen, luftgetrocknet und 3 min im UV-Crosslinker fixiert.

3.14. Radioaktive Markierung von Sonden

Als Sonden für die radioaktive Hybridisierung wurden PCR-Produkte eingesetzt. Diese wurden über den PCR purification Kit (QIAGEN) nach Bedienungsanleitung aufgereinigt und quantitativ auf dem Agarose-Gel abgeschätzt.

Die Markierung erfolgte mittels Multiprime Labelling Kit (Amersham). Dazu wurden 25 ng aufgereinigtes PCR-Produkt in einem Endvolumen von 28 µl verdünnt und bei 95°C für 5 min denaturiert und anschließend auf Eis gestellt. Nach Zugabe von 10 µl Puffer, 5 µl Primer, 2 µl Klenow-Polymerase und 4 µl alpha32P-dCTP erfolgte die Markierung für mindestens 4 h bei 37°C.

Die Sonden wurden über Sephadex Säulen aufgereinigt (Pharmacia) und vor der Zugabe zur Hybridisierungslösung 5 min bei 99°C denaturiert.

3.15. Radioaktive Hybridisierung von Northern- und Southern-Blots

Die radioaktive Hybridisierung von Northern- und Southern-Blots erfolgte prinzipiell gleich. Als Hybridisierungslösung wurde kommerziell erwerbliche ExpressHyb-Lösung (CLONTECH) benutzt. Die Blots wurden bei 58°C zunächst für mindestens 30 min prähybridisiert. Anschließend wurde die denaturierte Sonde hinzupipettiert und über Nacht bei derselben Temperatur hybridisiert.

Am nächsten Tag wurden die Blots zunächst zweimal 15 min bei RT in 2x SSPE/0,1% SDS gewaschen. Zwischendurch erfolgte die Messung der Blots, um die Effizienz der Waschschritte zu beobachten und ein Abwaschen der Sonde zu vermeiden. Gegebenenfalls wurden weitere stringente Waschschritte durchgeführt:


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15 min bei 60°C in 1x SSPE/0,1% SDS und 10 min bei 60°C in 0,1x SSPE/0,1% SDS.

Die Blots wurden eingeschweißt und auf BioMax-MR Filmen (Kodak) bei -80°C exponiert.

3.16. cDNA-Synthese

Bei der reversen Transkription von RNA in cDNA wurden jeweils 3 µg Gesamt-RNA umgeschrieben. Dazu wurde die RNA mit 2 µl Hexamer-Random-Primer (Promega) in einem Endvolumen von 10 µl 10 min bei 65°C denaturiert. Um die Bindung der Primer an die RNA zu ermöglichen, wurden die Proben danach kurz auf Eis inkubiert. Dazu wurden 4 µl 5x first strand buffer RT (Gibco), 2 µl 0,1 M DTT (Gibco), 2 µl 5 mM dNTP’s, 0,5 µl RNase Inhibitor (40 U/µl, Promega) sowie 1 µl Superscript II- Reverse Transkriptase (200 U/µl, Gibco) pipettiert. Die Reaktion erfolgte 1 h bei 42°C im Thermocycler und wurde anschließend durch eine 15-minütige Inkubation bei 70°C gestoppt.

Die cDNA-Proben wurden bei -20°C aufbewahrt.

3.17. Klonierung von PCR-Fragmenten

Um unbekannte PCR-Fragmente zu klonieren wurde das Verfahren der TA-Klonierung eingesetzt. Dabei wird die Erzeugung eines polyA-Schwanzes bei der PCR durch die Taq-Polymerase genutzt, welche in einen Vektor mit polyT-Enden einkloniert werden können.

LB-Platte:

10 ml LB-Agar

10 µl Ampicillin (50 mg/ml)

16 µl X-Gal (40 mg/ml)

2,5 µl IPTG (2 M)


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Die zu klonierenden PCR-Fragmente wurden über QIAGEN-Säulen (PCR Purification Kit) aufgereinigt, wie in der Kit-Vorschrift angegeben. Die Elution erfolgte mit 60 µl Tris-HCl (1 mM). Davon wurden 10 µl zur quantitativen Abschätzung auf einem Agarosegel aufgetragen. Sechs bis 10 ng wurden mit 50 ng pCR 2.1 Vektor mit 4 U T4 DNA-Ligase in Anwesenheit von 1x Ligationspuffer über Nacht bei 16°C ligiert (TA-Cloning Kit, Invitrogen).

Zur Transformation wurden kompetente E. Coli-Zellen (Invitrogen) auf Eis aufgetaut, mit 2 µl 0,5 M ß-Mercaptoethanol gemischt und der gesamte Ligationsansatz dazupipettiert und 30 min auf Eis gehalten. Danach wurde diese Mischung für exakt 30 Sekunden in ein 42°C warmes Wasserbad gehalten und anschließend 2 min auf Eis abgekühlt. Nach Zugabe von 250 µl 37°C-warmem SOC-Medium wurden die Bakterien eine Stunde im 37°C-Inkubator geschüttelt. Die Bakterien wurden dann in 2 Portionen zu 50 µl und 250 µl ausplattiert und über Nacht bei 37°über Nacht inkubiert. Die weißen Kolonien, welche durch Einbau des Inserts in das lacZ-Operon die Fähigkeit zur Farbentwicklung verloren hatten, wurden gepickt und für die Plasmidpräparation angezüchtet.

3.18. Plasmidpräparation

P1-Puffer:

15 mM Tris, pH 8,0

10 mM EDTA

vor Gebrauch 100 µg/ml RNase A hinzufügen, sterilfiltrieren

P2-Puffer:

0,2 N NaOH

1% SDS

autoklavieren, bei 4°C aufbewahren

P3

Puffer: 3 M Kaliumacetat, pH 5,5


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Zur Isolation von Plasmiden bzw. PAC’s wurden Übernachtkulturen im entsprechenden Medium (LB bzw. YT-Broth) mit Antibiotikazusatz angeimpft. Am nächsten Tag wurden diese bei 3500 rpm für 10 min pelletiert. Das Pellet wurde in 300 µl P1-Puffer resuspendiert und für 5 min mit 300 µl P2-Puffer lysiert. Daraufhin wurden die Proteine und die chromosomale DNA mit 300 µl P3-Puffer präzipitiert. Nach Inkubation auf Eis für 5 min wurden die Proben 10 min bei 14000 rpm bei 4°C zentrifugiert. In der Zwischenzeit wurden QIAGEN-Säulen mit dem entsprechenden Puffer equilibriert und anschließend der Überstand der Proben auf die Säulen aufgetragen. Nach vierfachem Waschen mit je 1 ml QC-Puffer, wurde die Plasmid-DNA mit 800 µl QF-Puffer eluiert und mit 560 µl Isopropanol umgefällt. Nach 30-minütiger Zentrifugation bei 14000 rpm bei 4°C wurde das Pellet mit 70%-igem Ethanol gewaschen und nach erneuter Zentrifugation getrocknet. Die Plasmid-DNA wurde in 11 µl Aqua bidest. resuspendiert.

Für die Maxi-Präparation wurden das Volumen der Puffer entsprechend erhöht.

3.19. Automatische Sequenzierung

6% Sequenziergel:

30 ml Sequagel XR (Biozym)

7,5 ml Sequagel-Puffer (Biozym)

400 µl DMSO

300 µl APS

Sequenzierprimer:

M13-forward:

5‘-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3‘

T7-Promotor:

5‘-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3‘

Die Sequenzierung erfolgte mittels Thermosequenase fluorescent labelled Cycle-Sequencing-Kit (Amersham). Die Sequenzierreaktionen wurden nach dem folgenden Schema pipettiert:


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1 µl H2O

1 µl Plasmid-DNA (100-400 ng/µl)

1 µl Nucleotid-Mix

1 µl Primer (2pmol/µl)

und mit Wachs überschichtet. Nach 5-minütiger Denaturierung bei 95°C folgten 30 Zyklen mit 30 s bei 95°C, 15 s bei 50°C und 60 s bei 70°C. Die Reaktionen wurden anschließend mit 4 µl Stoplösung beendet. Nach 5-minütigem Denaturieren bei 70°C wurde je 1µl der Proben auf die Sequenziergele geladen. Die Auftrennung erfolgte auf einem LiCOR-Sequenziergerät (MWG).

3.20. PolyA-RNA-Isolierung

Die Aufreinigung von mRNA aus Gesamt-RNA für die Erstellung von Expressionsbibliotheken wurde von 1-1,5 mg RNA mittels mRNA-Separator-Kit (CLONTECH) durchgeführt. Dazu wurde die RNA auf eine Konzentration von 1 mg/ml in DEPC-Wasser eingestellt und für 8 min bei 80°C denaturiert. In der Zwischenzeit wurden die Oligo-dT-Zellulose-Säulen wie in der Anleitung angegeben vorbereitet.

Nach der Denaturierung wurde die RNA für 5-8 min bei RT stehengelassen und unmittelbar vor der Beladung der Säule mit 1/5 Volumen Sample-Puffer versetzt. Unter intensivem Auf- und Abpipettieren wurde diese Suspension mit den Oligo-dT-Partikeln der Säule gemischt und für 10 min bei RT belassen, um die Bindung der PolyA-RNA an die Oligo-dT-Partikel zu gewährleisten. Anschließend wurde die Säule in einem Zellkulturröhrchen für 2 min bei 1500 rpm bei 4°C zentrifugiert. Dann wurde die Säule dreimal mit je 300 µl High-Salt-Puffer und dreimal mit je 600 µl Low-Salt-Puffer gewaschen. Zwischendurch erfolgte die Zentrifugation bei 1500 rpm für 2 bzw. 3 min bei 4°C.


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Die Elution erfolgte dreimal mit je 400 µl auf 65°C vorgewärmtem Elutions-Puffer unter Zentrifugation bei 1500 rpm für 2 min bei RT in Eppendorfgefäße.

Die Ausbeute und die Reinheit wurden spektrophotometrisch bestimmt unter Messung der Absorption bei 260 nm und dem Quotienten aus 260nm/280nm.

Gegebenenfalls wurde die Reinigung wiederholt. Der Prozentsatz von polyA-RNA sollte zwischen 2 und 3% der eingesetzten Menge liegen. Die Ratio sollte 1,8 bis 2,0 betragen.

Abschließend wurde die polyA-RNA mit 1/10 Volumen 2 M Kaliumacetat und 2,5 Volumen absolutem Ethanol über Nacht bei \|-\|20°C gefällt und am nächsten Tag präzipitiert. Die polyA-RNA wurde in einer Konzentration von 1 µg/µl in RNase-freiem Wasser gelöst.

3.21. Erstellung von Expressionsbibliotheken

Prinzip

Bei der PCR select (CLONTECH) werden differentielle cDNA-Fragmente selektiv amplifiziert, wohingegen unspezifischer Hintergrund unterdrückt wird (Diatchenko et al, 1996). In der Abbildung 5 sind die detaillierten Schritte der PCR select-cDNA-Subtraktion dargestellt. Zunächst werden beide cDNA-Populationen mit dem Restriktionsenzym RsaI, einem Enzym mit einer vier-Basen-Erkennungsregion, welches glatte Schnittstellen erzeugt, restringiert. Die tester-cDNA wird dann in zwei Subpopulationen geteilt, an die ein jeweils unterschiedlicher Adaptor ligiert wird. Dieser ist am Ende dephosphoryliert, so daß nur ein Strang des Adaptors an das 5’-Ende der cDNA-Moleküle ligiert wird. Beide Adaptoren haben unterschiedliche Sequenzen, um die Anlagerung von zwei unterschiedlichen PCR-Primern zu gewährleisten. Die driver-cDNA wird nicht ligiert.


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In der nun folgenden ersten Hybridisierung wird ein Überschuß an driver-cDNA zur tester-cDNA hinzugefügt, die Proben werden hitzedenaturiert und über Rehybridisierung entstehen unterschiedliche Produkte a, b, c und d (siehe Abbildung 5). Doppelsträngige Typ a-Moleküle werden angeglichen, da die Wiederzusammenlagerung von DNA-Molekülen für Moleküle, die in höherer Anzahl vorliegen, schnell erfolgt (Kinetik zweiter Ordnung). Gleichzeitig werden differentiell exprimierte einzelsträngige Typ a-Moleküle signifikant angereichert.

Beim zweiten Hybridisierungsschritt werden die beiden ersten Hybridisierungsproben ohne weiteren Denaturierungsschritt zusammengefügt. Nun können lediglich übriggebliebene einzelsträngige tester-cDNA-Moleküle reassoziieren und Typ e-Hybrid-Moleküle, doppelsträngige Moleküle mit unterschiedlichen Enden (Adaptorsequenzen 1 und 2), bilden. Frische denaturierte driver-cDNA wird zur weiteren Anreicherung der Fraktion e hinzugefügt.

Anschließend wird eine PCR durchgeführt, um die gewünschten differentiellen Gensequenzen zu amplifizieren. Dabei können Typ a- und d-Moleküle aufgrund der fehlenden Primer-Bindungsstellen nicht amplifiziert werden. Die meisten Typ b-Moleküle formen Sekundärstrukturen, was ebenfalls die exponentielle Amplifikation unterbindet. Da Typ c-Moleküle nur eine Primer-Bindungsstelle besitzen, werden sie linear amplifiziert, Typ e-Moleküle - also differentiell exprimierte Sequenzen hingegen als einzige exponentiell.

In einer zweiten PCR mit nested-Primern wird der Hintergrund reduziert und die differentiellen Genprodukte weiter angereichert. Diese PCR-Produkte können dann direkt in einen TA-Cloning-Vektor ligiert werden.


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Abb. 5 Schema zur Erstellung einer cDNA-Bibliothek mittels PCR-Select (aus PCR select, Kit-Vorschrift, CLONTECH)


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Durchführung

Es wurde jeweils eine Expressionsbibliothek von herauf- sowie von herabregulierten Genen kloniert. Der Vergleich erfolgte dabei von einer Bronchialepithel-Primärkultur (SAEC= small airway epithelial cells, CLONETICS) und der selbstetablierten Lungenkarzinom-Zellinie D51 (metastasiertes Adenokarzinom).

Die einzelnen Schritte wurden wie in der Kit-Anleitung beschrieben durchgeführt und umfaßten:


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