Petersen, Simone: Identifizierung genetischer Läsionen in der Progression und Metastasierung von Bronchialkarzinomen

46

Kapitel 4. Ergebnisse

4.1. Chromosomale Veränderungen in metastasierten und nicht-metastasierten Plattenepithelkarzinomen der Lunge

Die chromosomalen Veränderungen der 50 Plattenepithelkarzinome sind in der Abbildung 6 als Histogramm zusammengefaßt. Die genetischen Veränderungen sind in Form von Inzidenzkurven entlang der Chromosomenideogramme dargestellt.

Abb. 6 Zusammenfassung der chromosomalen Veränderungen in 50 Plattenepithelkarzinomen der Lunge in Form eines Histogramms. Areale auf der linken Seite entsprechen DNA-Verlusten, die auf der rechten Seite DNA-Überrepräsentationen. Die vertikalen Linien geben die Inzidenz der Veränderungen als prozentualen Anteil der Fälle an, welche diese Veränderungen aufweisen. Alterationen mit 99%-iger Signifikanz sind blau und mit 95%-iger Signifikanz grün dargestellt. Die Zentromer-Regionen der Chromosomen 1, 9 und 16 müssen von der Evaluation ausgeschlossen werden.

Die Kurven auf der linken Seite korrespondieren mit einem Verlust von genetischem Material, die Kurven auf der rechten Seite entsprechen einem DNA-Zugewinn. Die


47

Inzidenz der Veränderungen ist an den 50%- und 100%-Linien parallel zu den Chromosomen ablesbar. Der Vorteil dieser Darstellungsform der CGH-Ergebnisse im Gegensatz zur klassischen Darstellung als Strichdiagramm ist, daß chromosomale Abschnitte ablesbar sind, in denen die Häufigkeit der Veränderung am größten ist. Gleichzeitig lassen sich kleinere minimal betroffene Regionen definieren.

Mehr als 50% der untersuchten Fälle zeigten Deletionen der chromosomalen Regionen 1p21-p22, 2q36, 3p, 4p, 4q, 5q, 6q, 8p, 9p13-p21, 10q, 11p12-p14, 11q14-q22, 12q21, 13q, 18q und 21q21 sowie DNA-Überrepräsentationen auf 1q, 3q, 5p, 8q, 9q34, 11q13, 12p, 16p, 17q12-q21, 17q24-q25, 19, 20q und 22q.

Je ein Histogramm wurde auch für metastasierte bzw. nicht-metastasierte Plattenepithelkarzinome erstellt und statistisch auf Signifikanz einzelner Veränderungen in den entsprechenden Subgruppen über chi2\|-\|Test untersucht. Das resultierende Differenzhistogramm ist in Abbildung 7 dargestellt. Es basiert auf dem Vergleich von 25 Primärtumoren ohne Evidenz von Metastasen (Tumorstadium pN0/M0) sowie 25 metastasierten Tumoren (pN+/M+). In den metastasierten Tumoren überwiegen die genetischen Veränderungen, was sich im Überschuß der roten Farbe ausdrückt. Regionen mit statistisch signifikanten Veränderungen im Vergleich beider Tumorsubgruppen nach chi2-Test sind als Balken dargestellt. Graue Balken entsprechen dabei den Regionen mit 95%-iger Signifikanz (0.01<p<0.05), schwarze Balken denen mit 99%-iger Signifikanz (p<0.01). Insbesondere zeigten sich DNA-Verluste in den chromosomalen Regionen 3p12, 4p16, 6p22, 6q26, 8p23, 10q21-q24, 10q26 und 21q22 sowie DNA-Überrepräsentationen der Banden 8q24, 9q34 und 15q11-q13 als hochsignifikant für den metastatischen Phänotyp der Plattenepithelkarzinome. Veränderungen mit 95%-iger Signifikanz waren Überrepräsentationen von 1q21-q25, 6p23-p24, 6q25, 6q27, 8q und 11q13.


48

Abb. 7 Differenzhistogramm von nicht-metastasierten (grün)- und metastasierten (rot) Plattenepithelkarzinomen der Lunge. Regionen mit statistisch signifikanten Veränderungen im Vergleich beider Tumorsubgruppen nach chi2-Test sind als Balken dargestellt. Graue Balken entsprechen dabei den Regionen mit 95%-iger Signifikanz (0.01<p<0.05), schwarze Balken denen mit 99%-iger Signifikanz (p<0.01).

Der direkte Vergleich von 10 Primärtumoren und den korrespondierenden Metastasen zeigte eine überwiegende Anzahl gleicher chromosomaler Veränderungen in den Tumoren desselben Patienten, was für einen klonalen Zusammenhang spricht. Weiterhin bestätigte es die statistisch gefundenen Regionen. Obwohl nicht alle metastasierungs-assoziierten Veränderungen in jedem Fall aufzufinden waren, konnten sie meist bereits im Primärtumor beobachtet werden. In einigen Fällen waren diese Veränderungen jedoch in den Metastasen deutlicher ausgeprägt.


49

Beispiele hierfür sind in Abbildung 8 dargestellt.

Abb. 8 Vergleich chromosomaler Veränderungen von Primärtumoren und korrespondierenden Metastasen. (A) CGH-Strichdarstellung eines Primärtumors (Striche in der indizierten Position nahe am Chromosomenideogramm) und einer großen und kleinen Lebermetastase (Striche in der mittleren und äußeren Position). (B) Profile von Primärtumor und je einer Metastase für drei Chromosomen mit metastasierungsrelevanten Loci.

Abbildung 8A zeigt das Ergebnis der CGH-Analyse von einem Primärtumor und zwei korrespondierenden Lebermetastasen. Die Profile zeigen für die Chromosomen 2q, 6q und 8 eine Ausweitung der Deletionen im Laufe der Progression. Die Deletion der


50

Bande 3p12 war nicht im Primärtumor detektierbar. Beispiele für die Chromosomen 1, 8 und 10 sind in Abbildung 8B aufgeführt.

4.2. Allelverluste auf Chromosom 10q in der Progression und Metastasierung von Lungenkarzinomen

Die Allelotypisierungsstudien an 22 Kleinzellern, 40 Plattenepithelkarzinomen, 11 Adenokarzinomen, 4 großzelligen Lungenkarzinomen sowie einem Karzinoid mit zunächst 6 polymorphen Markern zeigten Allelverluste (LOH) in 91% der SCLC und 56% der metastasierenden Plattenepithelkarzinome. Während nicht-metastasierte Plattenepithelkarzinome lediglich in 14% LOH zeigten, war kein LOH in den übrigen NSCLC detektierbar. Die Assoziation mit der Metastasierung und Progression war statistisch hochsignifikant (p<0.01). Einzelheiten zu dieser Studie sind dem beigefügten Sonderdruck Petersen et al, 1998a zu entnehmen.

Abb. 9 Ergebnisse der Allelotypisierungs-Analyse in den 17 Plattenepithelkarzinomen mit Allelimbalanz. Die Marker sind in der oberen Reihe ohne den Präfix D10S aufgeführt. Kleine Zahlen dazwischen geben die genetische Distanz zwischen den einzelnen Markern in cM an. Schwarze Ellipsen entsprechen LOH, weiße Heterozygotie. Nicht- informative Marker sind grau dargestellt. Die drei minimal deletierten Regionen sind markiert. msi, Mikrosatelliten-Instabilität.


51

Im Gegensatz zu den Kleinzellern, welche in der Regel den Verlust einer gesamten Chromosom 10q-Kopie aufwiesen, zeigten die Plattenepithelkarzinome gehäuft interstitielle Deletionen. Daher wurde in einer zweiten Studie insbesondere dieses Tumorkollektiv herangezogen, um die minimal deletierten Regionen näher einzuengen. Siehe dazu auch den Artikel Petersen et al, 1998b.

Insgesamt waren in 17 der untersuchten 39 Plattenepithelkarzinome einer oder mehrere Allelverluste nachweisbar. Das Ergebnis dieser Arbeit ist in Abbildung 9 dargestellt. Es ließen sich drei minimale Regionen flankiert von den Markern Afm086/D10S541, D10S185 und D10S1782/D10S169 definieren.

4.3. Mutationsanalyse der Kandidatengene MXI1, PTEN/MMAC1 und DMBT1 auf Chromosom 10

Wie in Abbildung 9 ersichtlich, liegen die Kandidatengene MXI1 und PTEN/MMAC1 in unmittelbarer Nähe von minimal deletierten Regionen. Mittels SSCP-, Southern Blot-Analyse sowie direkter Sequenzierung konnten Mutationen innerhalb dieser Gene in den vorcharakterisierten Tumorkollektiven der Lunge ausgeschlossen werden. Die Untersuchungen auf RNA-Ebene ergaben weder eine Herabregulation in Zellinien noch alternative Transkripte in Tumoren. Diese Ergebnisse sind in den Arbeiten Petersen et al, 1998a und b erläutert.

Die Analyse des Genes DMBT1 (deleted in malignant brain tumors), welches in der Region 10q25.3-10q26.1 identifiziert wurde (Mollenhauer et al, 1997), zeigte in Lungentumoren keine homozygoten Deletionen. Die SSCP-Analysen von genomischer DNA aus dem Gen sowie von amplifizierten cDNA-Abschnitten zeigte Veränderungen im Laufverhalten. Da diese jedoch ausschließlich auch im korrespondierenden Normal-Gewebe nachweisbar waren, muß von Polymorphismen innerhalb dieses Gens ausgegangen werden. Ein Beispiel einer SSCP-Analyse ist in


52

Abbildung 10 dargestellt.

Abb. 10 Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus-Analyse von PCR-Produkten des STS 74k innerhalb der genomischen Sequenz des DMBT1-Gens. T, Tumor-DNA; N, korrespondierende normale Lungengewebs-DNA. Unterschiede im Laufverhalten zwischen einzelnen Patienten sind durch Polymorphismen des Gens verursacht.

Ebenfalls auf cDNA-Ebene zeigten amplifizierte PCR-Fragmente bei der SSCP-Analyse Veränderungen im Laufverhalten. Die Sequenzierung ergab einen Nukleotidaustausch sowohl im Tumor- als auch im Normal-Gewebe. Abbildung 11 zeigt einen Ausschnitt der Sequenzierung dieses Fragmentes im Vergleich zur Wildtyp-Sequenz. Es zeigte sich ein Austausch der Basen 3416 bis 3418 von CAC zu AGT.


53

Abb. 11 Sequenzierung von PCR-Produkten aus dem DMBT1-Gen. Rechts ist ein Teil der Wildtyp-Sequenz sichtbar, links ein Fragment des Falles 67. Die Sequenz ist ablesbar und ergibt einen Austausch der Basen 3416 bis 3418 von CAC zu AGT.

Die Northern Blot-Hybridisierung mit einer Sonde gegen das DMBT1-Gen ergab die Expression vergleichbarer Transkriptmengen in Tumorzellinien und in normalen Bronchialepithelzellen (SAEC). Bei den Southern Blot-Untersuchungen waren keine homozygoten Deletionen bzw. Rearrangements detektierbar.

4.4. Differentiell exprimierte Gene in Lungenkarzinomzellinien

Zur Identifizierung neuer Kandidatengene in der Progression und Metastasierung von Lungentumoren wurden zwei Bibliotheken kloniert, die cDNA-Fragmente


54

von vornehmlich herauf (I.Bibliothek)- bzw. herabregulierten (II.Bibliothek) Genen enthielten. Es wurden jeweils 315 bzw. 437 Klone gepickt und zur Plasmid-Präparation kultiviert. Davon wurden mittlerweile 457 Klone sequenziert. Der Sequenzvergleich mit der Datenbank des NCBI ergab Homologien zu bekannten Genen oder in voller Länge sequenzierter cDNAs in 78 (in I) und 99 (in II) Fällen, was einem Prozentsatz von weniger als 40% entspricht. Während bei lediglich 7% der Fragmente keine Homologie zu einem Eintrag in der Datenbank vorlag, konnten zu der Mehrheit der Genfragmente eine oder mehrere überlappende Sequenzen gefunden werden, welche von sogenannten EST‘s (expressed sequence taggs) stammen, d.h. aus ansequenzierten Genen, deren gesamte cDNA-Sequenz bzw. Funktion noch nicht aufgeklärt wurde. Um die Qualität der Bibliotheken zu überprüfen, wurden Northern Blot-Untersuchungen durchgeführt, um die differentielle Expression der einzelnen Klone zu überprüfen. Dazu wurde RNA von einer anderen Passage eingesetzt als zur Erstellung der Bibliotheken verwendet wurde, um eventuell auftretende Zellzyklus-Schwankungen auszuschließen. Es wurden bislang schwerpunktmäßig die bekannten Gene oder von ihrer genomischen Lokalisation interessante Fragmente getestet. Die Blots wurden mit ß-Actin kontroll-hybridisiert und die Expression zwischen Tumor- und Normal-Zellen visuell verglichen: +++ entsprach starker Expression, ++ mittlerer Expression, + schwacher Expression, - keiner Expression. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 4 zusammengefaßt. Diese beinhaltet lediglich bereits im Northern Blot überprüfte Sequenzen. Generell kann von Unterschieden in 30-40% der klonierten Genfragmente ausgegangen werden.


55

Tab. 4: Auflistung klonierter cDNA-Fragmente und der Northern Blot-Ergebnisse

Klon

Match in der NCBI-Datenbank

Insert

Transkr.

N

T

I

1

NY-CO-25

550 bp

1

+

++

3

some overlapping

607 bp

1

-

(+)

5

yw89a06.s1 Homo sapiens cDNA clone 259378

350 bp

2

(+)

+

6

AIM1

700 bp

1

++

-

7

nt99c10.s1 NCI_CGAP_Alv1 Homo sapiens cDNA

250 bp

1

+

+

8

no match

700 bp

1

-

+

9

no match

400 bp

1

+

+

10

AIM1

400 bp

2

++

-

11

KIAA0078

608 bp

1

+

+++

12

Deoxycytidin-kinase

650 bp

1

+

+

13

no match

650 bp

2

+

++

15

OXA1HS involved in cyt. c oxidase assembling

500 bp

1

+

+++

17

several ESTs

350 bp

1

++

++

18

no match

1

+

+

19

several ESTs

700 bp

1

+

+

20

ns66c12.r1 NCI_CGAP_Pr22 Homo sapiens cDNA

700 bp

1

++

++

21

yi90b07.r1 Homo sapiens cDNA clone 146485

527 bp

1

+

+

22

several ESTs

1

++

++

30

ribosomal S4 protein

1

+++

+++

31

Ran_GTP binding protein 5

>526 bp

1

-

+

33

no match

475 bp

1

-

+

36

several ESTs

155 bp

1

+

+

37

EST58841 Infant brain Homo sapiens cDNA

230 bp

1

+

+

38

no match

480 bp

1

++

++

43

S4 protein

1

+++

+++

44

cytochrome oxidase

500 bp

1

+

++

45

PAC 1q24-q25

400 bp

1

-

++

48

some overlapping ESTs

ca.600 bp

1

+

+

49

cytokeratin 18

400 bp

1

-

++

50

ERM-binding protein

550 bp

1

++

+

51

EF 1-alpha

1

++

++

53

no match

>450 bp

1

+++

+++


56

Tab. 4: (Fortsetzung)

54

qb94g05.x1 Soares_fetal_heart_NbHH19W Homo sapiens

336 bp

1

+

+

59

KIAA0063

>500 bp

1

+

++

71

nz04d08.s1 NCI_CGAP_GCB1 Homo sapiens cDNA

>450 bp

1

(+)

++

81

Human tra1 mRNA for human homologue of murine tumor rejection antigen gp96

487 bp

1

++

++

83

elongation factor 1-alpha

442 bp

1

++

++

94

EST178957 HCC cell line

>400 bp

1

+

++

95

Human putative transmembrane protein precursor (B5)

300 bp

1

(+)

++(+)

121

testis mitotic checkpoint BUB3

487 bp

2

++/++

++/+++

123

acidic ribosomal phosphoprotein P0

550 bp

1

+++

+++

124

Human histone (H2A.Z) mRNA

>500 bp

2

++/-

++/+

129

clk2 mRNA

>570 bp

1

(+)

++

130

Human mRNA for high mobility group-1 protein (HMG-1)

>565 bp

2

+

+++

131

vacuolar H(+)-ATPase subunit=13.7 kda F-ATPases subunit b homolog

352 bp

1

+++

++

138

mRNA for La/SS-B protein

380 bp

1

+

++

142

Ser/Arg-related nuclear matrix protein (SRM160)

>500 bp

1

++

+++

154

DNA-binding protein (CROC-1B)

>500 bp

2

++

++

176

Grb14

>550 bp

1

-

++

181

Proteasom-Subunit

1

+++

+++

200

Human calpastatin

600 bp

2

+++

+++

202

Human p62

>590 bp

1

++/-

++/+

205

BAC 747E2 on chromosome 22q12.1

500 bp

1

+++

+++

206

ubiquitin carboxyl extension protein

>380 bp

1

++

++

217

M-phase phosphoprotein, mpp9

ca. 400 bp

1

+

+

229

cytokeratin 18

375 bp

2

-

++

230

p300

>433 bp

2

+

+++

238

mitotic checkpoint protein kinase (BUB1)

>600 bp

1

++

++

243

BAC 747E2 on chromosome 22q12.1

>660 bp

1

+++

-

249

some overlapping ESTs

>500 bp

1

-

+

259

Homo sapiens transcriptional enhancer factor (TEF1)

485 bp

1

+

++

260

554 bp

1

++

++

266

Mus musculus WW-domain binding protein 2

333 bp

1

+

+

283

nonerythroid beta-spectrin mRNA

250 bp

1

+

+

296

Human keratin 18

514 bp

1

-

++


57

Tab. 4: (Fortsetzung)

306

Pr22 protein

378 bp

1

+

++

312

serine/threonine kinase (BTAK)/aurora-related kinase 1 (ARK1),20q13.2-q13.3

>586 bp

1

-

++

II

1

DNA sequence from PAC 130N4,13q12-13

>500 bp

1

+++

+++

4

Cdc25C associated protein kinase C-TAK1

>600 bp

1

++

+

7

163-247bp:EST56970 Infant brain Homo sapiens cDNA

355 bp

1

++

(+)

8

163-340bp:EST56970 Infant brain Homo sapiens cDNA

350 bp

-/++

++/++

12

bis 225 bp:several EST in normal tissue and ovary tumor

>500 bp

1

+

+(+)

16

vimentin

>500 bp

1

++

++

17

ny11g03.s1 NCI_CGAP_GCB1

>500 bp

1

(+)

++

24

83-480bp:ml45c01.r1 Stratagene mouse testis (#937308)

>600 bp

1

+++

+++

51

replication factor C, activator 1

>500 bp

1

-

+

61

ow37c07.s1 Soares_parathyroid_tumor_NbHPA

>500 bp

1

-

++

67

ow52e04.x1 Soares_parathyroid_tumor_NbHPA

250 bp

1

-

++

82

234-579bp: TEGT gene, 12q12-q13

1

++

+

85

ezrin

252 bp

1

+

++

91

PAC 163M9 on chromosome 1p35.1-p36.21

>400 bp

3

+

+

92

plasminogen activator inhibitor-2 (PAI-2) gene, exon 8

>160 bp

1

++

-

115

several overlapping est

>600 bp

1

+

+

118

22-188 bp:12q24 PAC RPCI1-315L15

>450 bp

1

119

translation initiation factor eIF3 p48 subunit INT6

>450 bp

1

+

+++

123

zl05h11.r1 Soares pregnant uterus NbHPU

>625 bp

1

+++

-

140

nuclear pore complex protein NUP107

>625 bp

1

+

++

141

thrombospondin

375 bp

1

+++

-

142

fibronectin receptor alpha subunit

332 bp

1

++

-

146

bis 400 no match, 400-600 bp phosphorylase-kinase

>600 bp

1

+

+

150

nuclear protein SDK3, desmosomal protein

506 bp

1

-

+

154

H.sapiens P1-Cdc21 (DNA-replication)

>530 bp

1

-

++

157

za04g09.r1 Soares melanocyte 2NbHM

>500 bp

++/+

-/+

158

thrombospondin

>410 bp

1

+++

-

173

bis 250 bp: 28 kDa heat shock protein

>350 bp

1

++

++

185

CUSP,p73H, p51B (members of p53 family)

>578 bp

1

++

-


58

Tab. 4: (Fortsetzung)

186

clones 24609 and 24716 beta-tubulin

235 bp

2

++

+++

187

herpesvirus associated ubiquitin-specific protease

>460 bp

2

+

+

191

PAC 265J14 on chromosome 6

>352 bp

1

-

++

192

pre-B cell enhancing factor (PBEF),G0S9 mRNA

328 bp

2

++

++

193

EST20610 Spleen I H.sapiens cDNA 5' end similar to lamin B receptor

186 bp

1

-

++

200

zb47c01.r1 Soares fetal lung NbHL19W

290 bp

1

++

++

205

Arp2/3 protein complex subunit p34-Arc (ARC34),BRCA2

465 bp

1

+++

++

207

PAC 370M22 on chromosome 22q12-qter

335 bp

1

++

++

217

nuclear ribonucleoprotein particle (hnRNP) C

>600 bp

1

+++

+++

218

PAC 163M9 on chromosome 1p35.1-p36.21

>439 bp

3

+

+

223

cellular fibronectin

>600 bp

1

+++

+

228

rab11a GTPase

>613 bp

1

++

++

229

chromosome 17, clone HRPC837J1

>788 bp

2

+

++

234

DEAD box RNA helicase-like protein 11q22-q23

>617 bp

2

+

+++

237

222-605bp:ab49h07.r1 Stratagene lung carcinoma 937218

>500 bp

2

+

+

244

Sm protein G

384 bp

++

+++

Es sind die Gene aufgeführt, die aus der NCBI-Datenbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST) ermittelt werden konnten. Wurden keine Homologien zu bekannten Genen gefunden, wurde die entsprechende EST-Datenbank abgefragt. Oft waren bereits zahlreiche überlappende Einträge gefunden, was mit dem Eintrag ”several ESTs“ vermerkt wurde. Falls Ähnlichkeiten zu bekannten Genen vermerkt waren, wurde das ebenfalls aufgeführt. Die Insertlänge wurde nach dem Sequenzierresultat vermerkt und gibt die Insertlänge abzüglich Vektor an, der sequenziert wurde.

Beispiele ausgewählter Blots gibt Abbildung 12.


59

Abb. 12 Beispiele von Northern Blot-Untersuchungen differentiell exprimierter Gene. N: normales Bronchialepithel (SAEC), T: metastasiertes Adenokarzinom (D51). Die gleichmäßige Beladung der Gele wurde mittels ß-Actin-Kontroll-Hybridisierung bestätigt.


60

Um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse und die Übertragbarkeit auf andere Lungenkarzinome zu überprüfen, wurde zunächst von drei interessanten Klonen die Expression in weiteren Zellinien überprüft. Abbildung 13 zeigt die Expressions-Untersuchungen des Genes AIM1 (absent in melanoma) auf Chromosom 6q21, welches in der Karzinomzellinie herunterreguliert war. Es zeigte sich in 4/13 Zellinien eine deutlich verminderte sowie in 9/13 eine fehlende Expression.

Abb. 13 Northern Blot-Untersuchung des AIM1-Genes in Lungenkarzinom-Zellinien.

Die Northern Blot-Untersuchungen des Genes p51 ergaben eine fehlende Expression in 13/13 Lungentumorzellinien.

Die Expression von dem Klon II-45, welche deutliche Homologie zu dem vom Sanger-Zentrum sequenzierten PAC HS102G20 auf Chromosom 1q24-q25 ergab,


61

wurde ebenfalls in mehreren Lungenkarzinom-Zellinien untersucht. Im Vergleich zum Normalepithel, wo nur eine sehr schwache Expression sichtbar war, zeigten alle Tumorzellen eine mittlere bis starke Expression dieses Gens (Abbildung 14).

Abb. 14 Northern Blot-Untersuchung des Klones II-45 auf Chromosom 1q24-q25 in Lungenkarzinom-Zellinien. Dieselbe Membran wurde anschließend mit einer ß-Actin-Sonde hybridisiert. 1) SAEC, 2) D117, 3) BEN, 4) H82, 5) COLO668, 6) D97, 7) A427, 8) H446, 9) DMS53, 10) CPC-N.

4.5. Charakterisierung des Genes für das humane Calcyclin-bindende Protein

Um die gesamte cDNA-Sequenz des Klones II-45 von Chromosom 1q24-q25 zu ermitteln, sollten cDNA-Bibliotheken gescreent werden. Dazu wurde der Service vom Resourcenzentrum innerhalb des Deutschen Humangenomprojektes in Anspruch genommen. Zunächst wurde jedoch die gewebespezifische Expression ermittelt, um geeignete cDNA-Bibliotheken für die Suche zu ermitteln. Es zeigte sich eine Expression in der Mehrheit der untersuchten Gewebe, d.h. in Pankreas, Plazenta,


62

Gehirn, Herz, Dickdarm, Dünndarm, Ovarien, Hoden, Prostata, Thymus und Milz. Besonders starke Expression zeigte die Skelettmuskulatur. Eine sehr schwache Expression zeigten Leber, Lunge und Niere (siehe Abbildung 15).

Abb. 15 Gewebespezifische Expression von Klon II-45 auf polyA-RNA-Northern Blots (CLONTECH): 1) Pankreas, 2) Niere, 3) Skelettmuskulatur, 4) Leber, 5) Lunge, 6) Plazenta, 7) Gehirn, 8) Herz, 9) Blutleukozyten, 10) Dickdarm, 11) Dünndarm, 12) Ovarien, 13) Hoden, 14) Prostata, 15) Thymus, 16) Milz.

In der Auswahl der Bibliotheken wurde auch die Qualität der dem Resourcenzentrum zur Verfügung gestellten cDNA-Bibliotheken, insbesondere die durchschnittliche Fragmentlänge der klonierten Sequenzen, berücksichtigt. Es wurden 3 humane cDNA-Bibliotheken gescreent, vom Dünndarm (Bibliothek-Nr. 593), vom Pankreas (Bibliothek-Nr. 562) und von Keratinocyten (Bibliothek-Nr. 550). Dabei wurden vier Klone identifiziert: DKFZp593O0924Q3, DKFZp593P0824Q2, MPMGp562M1231Q3 und ICRFp550I2355Q7. Die Stämme wurden auf LB-Platten vereinzelt, Klone gepickt und angezüchtet. Nach der Sequenzierung der Plasmide dieser Klone konnten zwei positive und zwei falsch-positive ermittelt werden. Die zwei positiven Klone


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DKFZ593P0824Q2 und MPMGp562M1231Q3 ergaben eine Transkriptlänge von 1537 bp der folgenden Sequenz:


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Der Sequenzvergleich mit der Datenbank ergab nun, daß es sich bei diesem Gen um das humane Calcyclin-bindende Protein (Accession-Nummer AF057356) handelt. Der Eintrag in der Datenbank zeigte, daß lediglich der 5‘-translatierte Bereich des Transkriptes bekannt war. Die ursprünglich klonierte Sequenz stammte aus dem 3‘-untranslatierten Bereich dieses Genes. Die Untersuchung der Basenabfolge ergab einen offenen Leserahmen von den Basen 125 bis 811 (siehe unterstrichene Codons). Es finden sich ab 1394 bp und 1509 bp zwei Polyadenylierungssignale AATAA.

Das humane Gen besitzt 87% Homologie zum Gen für das Calcyclin-bindende Protein der Maus.

Über Sequenzvergleiche mit dem PAC-Klon HS102G20 vom Sanger-Zentrum konnte die genomische Struktur des Genes ermittelt werden. Wie aus Abbildung 16 ersichtlich, umfaßt es 6 Exons und überspannt einen 10,7 kb-langen Breich genomischer DNA.

Abb. 16 Genomische Struktur des humanen Calcyclin-bindenden Proteins. Schwarze Balken entsprechen den Exons. Das Gen überspannt 10,7 kb genomische DNA.


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Tab. 5: Exons und flankierende intronische Sequenzen (fettgedruckt/unterstrichen)

Exon

Größe (bp)

Intron

Größe (bp) (bp)

1

139

1

4418

gcaggctgcagcgccgc...ccatggcttcagaagaggt

2

220

2

1911


ag
ctacagaaagatctaga...gaaaatcagtaattatggt

3

97

3

256


ag
gatgggatcagtcagat...gtgcatttcacagagaggt

4

100

4

1411


ag
gtcatttgatcttttgg...aaggcagttcaaaaaaagt

5

98

5

1215


ag
gtcaagactgatacagt...gagtgcaaagaaaaagagt

6

883


ag
gaagccctcctatgaca...tttttcttcattagaac

Alle identifizierten Intron/Exon-Grenzen werden von den konservierten GT/AG-Dinukleotiden flankiert. Die Länge der Exons bzw. Introns und die entsprechenden Exon/Intron-Grenzen sind in Tabelle 5 aufgeführt.

Abb. 17 Promotorregion des Gens für das Calcyclin-bindende Protein. Der transkribierte DNA-Bereich ist fettgedruckt. Es finden sich mehrere SP1-Bindungsstellen GGCGGG sowie eine TATAA-Box, welche unterstrichen sind. Das ATG-Startcodon ist ebenfalls unterstrichen.


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In Abbildung 17 ist die 300 bp aufwärts des Gens gelegene Promotor-Sequenz angegeben. Es finden sich mehrere SP1-Bindungsstellen sowie eine TATA-Box, die 285 bp vor dem vermutlichen Transkriptionsstart gelegen ist.

Aus dem offenen Leserahmen ergibt sich folgende 228 Aminosäuren umfassende Proteinsequenz:

Die Proteinsequenzanalyse über die EXPASY-Internetseiten vos Schweizer Instituts für Bioinformatik (http://expasy.hcuge.ch/) ergab für die Aminosäuren 143 bis 160 ein nukleäres Lokalisationssignal.

Weiterhin ergaben sich folgende Homologien zu Phosphorylierungsstellen:

(1) Protein-Kinase C-Phosphorylierungsstellen:

21-23 TRK

48-50 SQK

72-74 TVK

83-85 SDK

109-111 TER

141-143 SSK

142-144 SKK

(2) Casein-KinaseII-Phosphorylierungsstellen:

34-37 SKIE

161-164 TRWD

167-170 TQVE

183-186 TETD


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(3) Tyrosin-Kinase-Phosphorylierungsstelle:

174-181 KEKEKPSY

Der PAC-Klon HS102G20 vom Sanger-Zentrum wurde angefordert, um auf chromosomaler Ebene nach Amplifikationen bzw. Rearrangements dieses Gens in Lungentumoren zu schauen, da die CGH-Analysen von den unter Abschnitt 2.3 aufgelisteten Zellinien zeigten, daß in 15 von 22 Lungenkarzinom-Zellinien eine DNA-Überrepräsentation im Bereich 1q24-q25 vorlag.

Abb. 18 Fluoreszenz-in situ- Hybridisierung einer Tumormetaphase der kleinzelligen Bronchialkarzinomzellinie H209 mit dem PAC HS102G20, der das Gen für das humane Calcyclin-bindende Protein enthält. Links) DAPI-Färbung zur Identifizierung der Chromosomen, rechts) FITC-Signal mit zwei Signalen auf den Chromosomenabschnitten 1q24-q25 und ein drittes Signal auf einem aberranten Chromosom, welches über DAPI-Färbung nicht identifizierbar ist. Die spezifischen Signale sind mit Pfeilen angezeigt.


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Die PAC-Klone wurden angezüchtet, und über Southern-Blot-Untersuchungen konnte bestätigt werden, daß sie das Gen für das humane Calcyclin-bindende Protein enthalten. Auf normalen Metaphasen aus Blutlymphocyten wurde die Lokalisation auf den Banden 1q24-q25 bestätigt. Die Hybridisierung dieses PAC-Klones auf Tumor-Metaphasen ergab bei den meisten untersuchten Tumorzellinien mehr als zwei Signale in der überwiegenden Anzahl der Metaphasen sowie in den Zellkernen. Unter Berücksichtigung der Ploidie der Tumorzellen konnten über die FISH-Ergebnisse damit die CGH-Daten verifiziert werden. Ein Beispiel für diese FISH-Analyse zeigt Abbildung 18.

Es ist davon auszugehen, daß es sich bei der Überexpression dieses Gens sowohl um transkriptionelle Aufregulation handelt, die auch durch eine genomische Mutation bedingt ist.


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