Petersen, Simone: Identifizierung genetischer Läsionen in der Progression und Metastasierung von Bronchialkarzinomen

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Kapitel 5. Diskussion

5.1. CGH-Ergebnisse

Die komparative genomische Hybridisierung wurde erstmalig 1992 beschrieben (Kallioniemi et al, 1992; Du Manoir et al, 1993) und hat sich inzwischen als Screening-Verfahren in der Tumorgenetik durchgesetzt. Trotz der Limitation im Auflösungsvermögen bietet sie Vorteile, insbesondere kann durch nur eine Untersuchung ein komplexes Bild von den chromosomalen Veränderungen eines Tumors ermittelt werden.

Die Bedeutung einzelner Loci kann nur ermittelt werden, wenn die Inzidenz der einzelnen Veränderungen an größeren Tumorkollektiven bekannt ist. Die CGH-Studie an 50 Plattenepithelkarzinomen zeigte, daß in mehr als 50% der untersuchten Tumoren DNA-Verluste auf 1p21-p22, 2q36, 3p, 4p, 4q, 5q, 6q, 8p, 9p13-p21, 10q, 11p12-p14, 11q14-q22, 12q21, 13q, 18q und 21q21 sowie DNA-Gewinne auf 1q, 3q, 5p, 8q, 9q34, 11q13, 12p, 16p, 17q12-q21, 17q24-q25, 19, 20q und 22q zu detektieren sind.

Diese Vielzahl an chromosomalen Veränderungen spiegelt mit großer Wahrscheinlichkeit die Komplexität der genetischen Läsionen in Lungenkarzinomen wider. Einzelne Imbalanzen lassen sich gut mit Mutationen bekannter Gene korrelieren, von denen einzelne in Abb. 1 dargestellt sind. So treten häufig Deletionen auf Chromosom 9p bei gleichzeitiger Inaktivierung des p16-Gens auf.

Korrelation Genotyp-Histotyp

Mittlerweile wurden mehrere CGH-Studien an Lungentumoren, insbesondere an Kleinzellern, durchgeführt (Levin et al, 1994; Ried et al, 1994; Petersen et al, 1997), die neue Kandidatenregionen für Onkogene und Tumorsuppressorgene lieferten.


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Die Deletionen auf den Chromosomen 4q, 8p, 11q, und 21q sowie die Überrepräsentationen der Chromosomen 1p, 11q13, 19 und 22q wurden ebenfalls in schlecht-differenzierten Plattenepithelkarzinomen der HNO-Region gefunden (Bockmühl et al, 1996). Mehrere dieser Regionen wurden noch nicht in Lungentumoren beschrieben. Generell zeigen Kopf/Hals-Karzinome ein sehr ähnliches Muster chromosomaler Veränderungen wie Plattenepithel-Karzinome der Lunge, was für eine gute Korrelation zwischen Geno- und Histotyp spricht. Demgegenüber konnten wir zeigen, daß Adenokarzinome eine etwas andere Verteilung der chromosomalen Imbalanzen aufweisen (Petersen et al, 1997b; beigefügt).

Auch Überrepräsentationen auf Chromosom 20q waren häufig. Amplifikationen diese Chromosomenarmes wurden insbesondere in invasiven Adenokarzinomen der Brust beschrieben (Tanner et al, 1994). Das Gen BTAK zeigt in diesen Tumoren gehäuft Amplifikationen und Überexpressionen. Es stellt ebenfalls ein wichtiges Kandidatengen in Lungentumoren dar (siehe unten).

Weiterhin finden sich häufig Verluste von Chromosomenarmen in Kombination mit der Überrepräsentierung des anderen Chromosomenarmes, was der Bildung von Isochromosomen entspricht und insbesondere für die Chromosomen 3, 5 und 8 in Plattenepithelkarzinomen und Kleinzellern beschrieben wurde (Mertens et al, 1994; eigene unpublizierte Ergebnisse).

Im Gegensatz zu publizierten LOH-Untersuchungen, zeigten die CGH-Ergebnisse für einzelne Regionen Überrepräsentationen statt Deletionen. So wurden beispielsweise Allelverluste auf den Chromosomenarmen 1q, 8q und 22q beschrieben (Shiseki et al, 1996; Sato et al, 1994). Diese Daten unterstützen die Bedeutung der komparativen Hybridisierung als Methode zur Vorcharakterisierung von Kandidatenregionen. Zur näheren Einengung von potentiellen Tumorsuppressor-Regionen ist der Einsatz von


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LOH-Studien sinnvoll. Dabei sollte aber stets bedacht werden, daß man einen semi-quantitativen Vergleich unterschiedlicher Allele durchführt. Dabei kann eine Imbalanz der Allele einerseits durch den Verlust andererseits aber auch durch den Zugewinn eines Allels verursacht werden. Es ist daher anzunehmen, daß einzelne Regionen, von denen über Allelotypisierungsstudien Deletionen beschrieben wurden, in Wirklichkeit Überrepräsentationen oder Amplifikationen entsprechen.

Mit der Einführung der Histogrammdarstellung konnten erstmals statistische Untersuchungen des generierten Datenmengen durchgeführt werden, was die Korrelation genetischer Veränderungen mit dem Phänotyp ausgewählter Tumorsubgruppen ermöglicht (Petersen et al, 1997b, Bockmühl et al, 1997; Arbeiten sind beigefügt).

Chromosomale Veränderungen metastasierter Karzinome

Allgemein läßt sich feststellen, daß metastasierende Tumoren wesentlich mehr genetische Veränderungen zeigten, als die nicht-metastasierenden. Dies spricht für eine Akkumulation zusätzlicher genetischer Aberrationen im Laufe der Progression durch die ein Tumor bzw. einzelne Zellpopulationen die Fähigkeit zur Dissemination erlangen.

Der statistische Vergleich der metastasierten und nicht-metastasierten Plattenepithelkarzinome der Lunge ergab die signifikante Assoziation des Phänotyps Metastasierung mit Imbalanzen der Chromosomenabschnitte 3p12, 4p16, 6p22-p24, 6q24-q27, 8p23, 10q21-q24, 10q26 und 21q22. Einige dieser Regionen wurden bereits in anderen Neoplasien als progressions-assoziierte Ereignisse beschrieben, was die Hypothese unterstützt, daß es sich bei der Metastasierung nicht um einen gewebe-spezifischen Vorgang handelt und daß die dafür verantwortliche Gene auch in anderen Tumorentitäten eine Rolle spielen.


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Deletionen der chromosomalen Bande 4p16 wurden in einer CGH-Studie wesentlich häufiger in Metastasen von Kolorektal-Karzinomen als in den Primärtumoren beobachtet (Paredes-Zaglul et al, 1998). Für die Chromosomen 6q, 8p und 10q gibt es mehrfache Hinweise auf deren Beteiligung an der Metastasierung. Chromosomentransfer-Experimente belegen, daß rekonstituierte menschliche wie auch Hamster-Tumorzellen ein deutlich reduziertes Metastasierungspotential aufweisen (Welch et al, 1994; Ichikawa et al, 1996).

Bezüglich Deletionen auf Chromosom 21q existiert erst eine Studie, in der der Verlust dieses Chromosomenarms statistisch signifikant häufiger in Hirnmetastasen als in primären nichtkleinzelligen Lungentumoren auftrat (Kohno et al, 1998).

Wie bereits erwähnt wurden Deletionen einiger Regionen auf Chromosom 3p insbesondere in frühen Tumorstadien gefunden (Hung et al, 1995). Interessanterweise treten offensichtlich aber auch einige DNA-Verluste erst in fortgeschrittenen Tumoren auf. So ist gerade der Verlust des gesamten Chromosomenarmes 3p einschließlich der Bande 3p12 eine typische Veränderung des kleinzelligen Bronchialkarzinoms, dem Lungentumor mit dem bekanntermaßen höchsten Potential zur Metastasierung.

Auch einige DNA-Überrepräsentationen zeigten statistische Signifikanz in Assoziation mit dem metastatischen Phänotyp, insbesondere 1q21-q25, 8q, 9q34, 11q13 und 15q11-q13. Überrepräsentationen auf Chromosom 1q wurden bereits für metastasierende Nierenzell-Karzinome beschrieben (Gronwald et al, 1997). Chromosom 8q-Überrepräsentationen und im besonderen Amplifikationen des myc-Onkogens auf 8q24 sind genetische Marker für die Tumorprogression (Brison, 1993). Kürzlich wurden 8q-Überrepräsentationen zusammen mit 8p-Verlusten in Knochenmetastasen von Prostatakarzinomen gefunden (Alers et al, 1997). 11q13-Überrepräsentationen bzw. \|-\|Amplifikationen treten insbesondere in nichtkleinzelligen


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Lungentumoren auf und sind mit einer schlechten Prognose assoziiert (Betticher et al, 1996). Für die Regionen 9q34 und 15q11-q13 wurden bisher keine genetischen Veränderungen im Zusammenhang mit der Progression publiziert.

Der Vergleich der CGH-Daten mit den Allelotypisierungsdaten auf Chromosom 10q, welche an einem ähnlichen Tumorkollektiv durchgeführt wurden, zeigte sowohl eine Übereinstimmung bezüglich der minimal deletierten Regionen, der Gesamt-Inzidenz als auch der statistischen Assoziation mit der Progression bzw. Metastasierung. Diese gute Korrelation unterstreicht die Bedeutung der weiteren gefundenen Regionen. Trotz der Limitation im Auflösungsvermögen der CGH, scheint die Anwendung dieser statistischen Verfahren wichtige Hinweise auf weitere involvierte Regionen zu liefern.

Klonalität

Der Vergleich von Primärtumoren und den korrespondierenden Metastasen zeigte in allen Fällen einen klonalen Zusammenhang der Tumoren. Dies war auch bei einer früheren Studie an kleinzelligen Bronchialkarzinomen und mehreren synchronen Metastasen der Fall (Schwendel et al, 1997). Interessanterweise wird bereits in frühen Stadien der Lungentumorigenese von einer klonalen Streuung ausgegangen, da man dieselben Allelverluste, die zunächst in präneoplastischen Epithelien findet auch später in Primärtumoren detektieren konnte, obwohl diese örtlich und morphologisch distinkt waren (Hung et al, 1995).

Im Gegensatz dazu zeigen einzelne CGH-Studien anderer Arbeitsgruppen, daß zumindest in einem Teil der Fälle kein klonaler Zusammenhang von Primärtumoren und Metastasen besteht (Kuukasjarvi et al, 1997). Eine mögliche Erklärung könnte die starke Heterogenität der Tumoren sein, die insbesondere bei längeren Latenzperioden zwischen der Resektion des Primärtumors und der Metastasierung


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die Aufstellung einer genetischen Verwandtschaft erschwert. Es könnte jedoch auch technisch bedingt sein, da diese Untersuchungen vornehmlich an Paraffinmaterial durchgeführt wurden.

Chromosomale Aberrationen in der Tumorprogression

Der Vergleich der Primärtumoren mit den korrespondierenden Metastasen bestätigte die Relevanz der statistisch signifikanten Regionen. Generell waren die gleichen genetischen Veränderungen häufig in den unterschiedlichen Tumoren eines Patienten auffindbar, jedoch in den Metastasen oft stärker ausgeprägt. Diese Beobachtung kann dadurch erklärt werden, daß aus dem heterogenen Primärtumor insbesondere die Zellen mit einem Wachstumsvorteil herausselektiert und dann in den Metastasen angereichert werden.

Während Primärtumoren häufig Überrepräsentationen von ganzen Chromosomenarmen zeigten, wiesen Metastasen oft Amplifikationen kleinerer chromosomaler Abschnitte auf. Das ist passend zu der Beschreibung, daß Amplifikationen typischerweise in fortgeschrittenen Tumoren auftreten (Brison, 1993). Kleinere interstitielle Deletionen wurden im Laufe der Progression zu Metastasen vergrößert, was vermuten läßt, daß diese einen Triggering-Effekt für die Entstehung größerer Deletionen darstellen. So treten analog zu Verlusten auf Chromosom 10q zunächst interstitielle Deletionen auf, während in der Progression Verluste ganzer Chromosomenarme oder Chromosomen nachweisbar sind. Solche ausgedehnten Deletionen insbesondere für die Chromosomen 3p und 10q sind ein typisches Charakteristikum von Kleinzellern. Demgegenüber zeigen Plattenepithelkarzinome eher interstitielle Deletionen (Petersen et al, 1998a; beigefügt). Es ist daher zu vermuten, daß der in einzelnen Fällen zu beobachtende morphologische Übergang von einem Plattenepithelkarzinom zu einem Kleinzeller gerade durch den Verlust


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größerer Chromosomenabschnitte während der Tumorprogression bedingt ist. Ein analoges Verhalten ist beispielsweise bei Hirntumoren bezüglich der Chromosom 10q-Verluste bekannt, wo diese Deletion eindeutig den Übergang von niedriggradigen Astrozytomen zu den maligneren Glioblastomen definiert (Rasheed et al, 1995; Kleihues et al, 1995).

5.2. Genetische Untersuchungen auf Chromosom 10q

Auch in einer Reihe anderer Malignome wurden Allelverluste auf Chromosom 10q als progressions-assoziiert beschrieben, u.a. in Nierenzellkarzinomen (Morita et al, 1991), Non-Hodgkin-Lymphomen (Speaks et al, 1992), Melanomen (Herbst et al, 1994), Prostatakarzinomen (Komiya et al, 1996; Gray et al, 1995) und Blasenkarzinomen (Cappellen et al, 1997).

Die Tatsache, daß in über 94% der Kleinzeller Chromosom 10q-Verluste auftreten, ließ vermuten, daß auch in nichtkleinzelligen Lungenkarzinomen 10q-Deletionen eine Rolle spielen. Die erste Allelotypisierungsstudie mit zunächst 6 Markern zeigte, daß diese aber vornehmlich in Plattenepithelkarzinomen und Kleinzellern auftreten (Petersen et al, 1998a). Das Deletionsmapping ergab drei minimale Regionen für potentielle Tumorsuppressorgene. Die Region I bei 10q22-q23 angrenzend an die Marker D10S541, wurde auch in Prostatakarzinomen beschrieben (Gray et al, 1995; Komiya et al, 1996). Ebenso die zweite Region um den Marker D10S185 (Ittmann, 1996). Die am weitesten telomerisch gelegene Region bei 10q26 zeigte am häufigsten Allelverluste, so in Prostatakarzinomen, Endometriumstumoren und Glioblastomen (Ittmann, 1996; Nagase et al, 1996; Rasheed et al, 1995). Auch in Plattenepithelkarzinomen der Kopf-/Hals-Region konnten Deletionen in diesem Bereich nachgewiesen werden (Bockmühl et al, 1997, beigefügt). In Glioblastomen konnten bereits mittels Chromosomentransfer-Experimenten supprimierende


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Wirkungen nach Induktion von Chromosomenabschnitten 10q24-q26 nachgewiesen werden (Steck et al, 1995). Für Lungentumoren stehen ähnliche Versuche noch aus.

Bislang wurden in unmittelbarer Nähe dieser drei Regionen die Kandidatengene für MXI1, PTEN/MMAC1 und DMBT1 identifiziert.

Das mxi1-Gen konnte mittlerweile als Kandidatengen in Prostata- als auch Lungenkarzinomen ausgeschlossen werden (Gray et al, 1995; Petersen et al, 1998a).

Das PTEN/MMAC1-Gen, in dem Mutationen in Brust-, Prostata-, Nierenkarzinomen und Hirntumoren beschrieben wurden (Steck et al, 1997; Li et al, 1997), scheint ebenfalls von untergeordneter Bedeutung zu sein (Petersen et al, 1998b; Teng et al, 1997). Interessanterweise wurde es insbesondere in hereditären Krebserkrankungen nachgewiesen, u.a. in Brust- und Schilddrüsentumoren (Lynch et al, 1997). Passend dazu wurde gezeigt, daß Mutationen innerhalb diese Gens das Cowden-Syndrom hervorruft, einer vererbbaren Erkrankung, die mit einem erhöhten Risiko einhergeht, Tumoren der Brust, der Schiddrüse und der Haut zu entwickeln (Liaw et al, 1997; Nelen et al, 1997).

Eine Arbeit an einem umfangreichen Kollektiv von Lungentumor-Zellinien konnte eine Mutationsrate von ca. 10% innerhalb des PTEN/MMAC1-Gene zeigen (Forgacs et al, 1998). Diese Rate ist jedoch nicht sehr hoch, was ebenfalls für die untergeordnete Bedeutung dieses Genes bei Lungentumoren spricht.

Aufgrund seiner Lokalisation auf Chromosom 10q25.3-q26.1 ist DMBT1 ein weiteres Kandidatengen für Lungentumoren. Homozygote Deletionen dieses Gene wurden in Glioblastomen und Medulloblastomen beschrieben (Mollenhauer et al, 1997). Mittlerweile wurden auch weitere Arbeiten publiziert, die auf die Bedeutung dieses Gens in Hirntumoren hinweisen (Maier et al, 1998; Lin et al, 1998). Offensichtlich treten allerdings eher homo- bzw. hemizygote Deletionen auf, Mutationen konnten


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bisher nicht nachgewiesen werden. Vielmehr scheint das Gen Polymorphismen zu beherbergen (von Deimling, persönliche Kommunikation), was sich mit unseren Daten bei Lungentumoren deckt.

Zusammenfassend scheinen jedoch alle bislang identifizierten Gene auf Chromosom 10q in Lungentumoren nicht die Hauptbedeutung zu haben. So bleibt die Suche nach dem oder den Tumorsuppressorgenen auf Chromosom 10q, die in Lungenkarzinomen von Bedeutung sind, offen.

5.3. Differentielle Genexpression

Wie bereits erwähnt, stehen der umfangreichen Menge cyto- und molekulargenetischer Daten, die Deletionen oder Überrepräsentationen auf DNA-Ebene beschreiben, nur eine Minderheit an erwiesenen Tumorsuppressor- bzw. Onkogenen entgegen. Klassischerweise wurden sogenannte positional cloning-Projekte durchgeführt, um die betroffenen Gene zu identifizieren. Diese erfordern das Screening umfangreicher Tumorkollektive, um die minimal betroffenen Regionen einzuengen und ein sehr gut sortiertes bzw. kartiertes Kontig an genomischen Klonen, die die zu untersuchende Region überspannen. Diese Projekte sind nach wie vor sehr zeitaufwendig und kompetitiv.

Eine in letzter Zeit immer stärker an Bedeutung gewinnende Methode ist daher die Untersuchung von Expressionsunterschieden in unterschiedlichen zellulären Systemen bzw. Tumoren, und eine Verschiebung der Analyse von DNA zu RNA nach sich ziehen (Sager et al, 1997). Sie werden in großem Stil eingesetzt, u.a. im Cancer Genome Anatomy Project in den USA.

Durch die Erstellung komplexer Transkriptmuster wird einerseits die Identifizierung einzelner Gene wesentlich schneller und effizienter und zweitens, durch die


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simultane Erfassung vieler Informationen, wird die Identifizierung einer Vielzahl von Faktoren ermöglicht, die in die maligne Transformation involviert sind.

Bislang wurden mehrere Methoden zur Erstellung solcher Transkriptionsunterschiede etabliert, die Differential Display-RT-PCR, welche mittlerweile von neueren und schnelleren Verfahren wie der Subtraktiven Suppressions-Hybridisierung (SSH), der seriellen Genexpressions-Analyse/SAGE (Velculescu et al, 1995) und der Untersuchung mittels cDNA-Microarrays (Schena et al, 1995; DeRisi et al, 1996) abgelöst wurde.

Erste Ergebnisse deuten darauf hin, daß die Anzahl unterschiedlich exprimierter Gene einige Hundert erreichen wird. Diese Veränderungen fallen in folgende Kategorien: (1) Veränderungen, die unmittelbar in die Induktion oder Aufrechterhaltung von Neoplasien beteiligt sind, (2) Veränderungen, welche Konsequenzen der Entartung, aber nicht dessen Ursache sind, oder (3) Veränderungen, die vollständig unabhängig von Neoplasien sind und stochastische Veränderungen der Genexpression (interindividuelle Schwankungen) darstellen (Szallasi, 1998).

Im folgenden sollen nur einige wenige der über differentielle Genexpression gefundenen Klone eingegangen werden.

BTAK (breast tumor amplified kinase) ist eine Serin-Threonin-Kinase mit großer Homologie zu den Genen Ipl1 von S. cerevisiae und aurora von Drosophila, denen Bedeutung bei der Chromosomensegregation zukommt (Chan & Botstein et al, 1993; Glover et al, 1995). Dieses Gen wurde kürzlich als das lange gesuchte Onkogen der häufig amplifizierten Region auf Chromosom 20q13 in Brusttumoren identifiziert (Sen et al, 1997). Mittlerweile wurde die Amplifikation und Überexpression auch in anderen Tumoren beschrieben, wie Ovar-, Dickdarm- und Prostatakarzinomen. Es konnte weiterhin gezeigt werden, daß es sich bei dem Gen STK15/BTAK um eine


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Zentrosom-assoziierte Kinase handelt, die beteiligt ist an Verdopplungs- und Verteilungsstörungen (duplication-distribution abnormalities) bei der Zellteilung und somit für Aneuploidien. Die Überexpression sowohl in Maus-NIH 3T3 als auch diploiden humanen Brustepithelzellen führte zum Auftreten abnormer Zentrosomenmengen (Amplifikation), chromosomaler Instabilität und Transformation (Zhou et al, 1998). Die im Vergleich zu normalem Bronchialepithel deutliche Überexpression in den Tumorzellen zusammen mit der Tatsache, daß häufig Überrepräsentationen auf Chromosom 20q auftreten, machen dieses Gen zu einem wichtigen Kandidatengen bei Lungentumoren, die durch eine enorme chromosomale Instabilität gekennzeichnet sind.

Ein weiteres Kandidatengen ist AIM1 auf Chromosom 6q21, einer häufig deletierten Region in Lungentumoren. Es wurde in revertierten malignen Melanom-Zellen gefunden, welche nach Chromosom 6-Transfer die Fähigkeit von anker-unabhängigem Wachstum und die Tumorigenität in der Nacktmaus verloren hatten (Ray et al, 1996). Die Charakterisierung dieses Genes zeigte es der Familie der beta-gamma-Kristallin-Superfamilie zugehörig, welche in der Augenlinse zur Aufrechterhaltung der Struktur verantwortlich sind. Die Verbindung anderer Gene dieser Proteinfamilie bei Streßantwort, Differenzierung und Änderung der Zellmorphologie sprechen für eine Interaktion mit dem Zytoskelett (Ray et al, 1997). Die Tatsache, daß auch gehäuft Deletionen in diesem Chromosomenabschnitt in Lungenkarzinomen zu finden sind, und daß es in allen untersuchten Zellinien deutlich vermindert bzw. überhaupt nicht exprimiert wurde, spricht für seine Bedeutung in der Tumorigenität von Lungentumoren. Es befindet sich zusätzlich in einer chromosomalen Region, die signifikant mit dem metastatischen Phänotyp assoziiert war.

Grb14 wurde als neues Mitglied der GRB7-Familie identifiziert und stellt eine PDGF-regulierte Serin-Kinase dar (Daly et al, 1996). Die chromosomale Lokalisation wurde


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bislang noch nicht ermittelt. Die fehlende Expression dieses Gens in normalem Lungengewebe und Überexpression in den untersuchten Lungentumorzellen macht es zu einem weiteren interessanten Kandidatengen.

HMG (high mobility group)-Proteine gehören zu Nicht-Histon-Proteinen, die in drei Klassen unterteilt werden. Die HMG-1 ist ein konserviertes nukleäres Protein und hat strukturelle Aufgaben der Chromatin-Organization (Falciola et al, 1997). Eine Beteiligung von HMG-1-Proteinen an der Tumorigenese wurde von Xiang et al, 1997 vorgeschlagen. Sie fanden eine deutliche Überexpression in gastrointestinalen Adenokarzinomen im Vergleich zur korrespondierenden normalen Mukosa. Dieses Gen war ebenfalls in der untersuchten Lungenadenokarzinom-Zellinie stark überexprimiert.

Ein weiteres in den Bibliotheken kloniertes Gen, was in allen untersuchten Lungentumorzellinien verlorenen war, ist p51. Es kodiert ein Homologes von p53 und dem später isolierten p73. Fehlende Expression sowie vereinzelte Mutationen wurden in einigen epithelialen Tumoren gefunden (Osada et al, 1998). Die Bedeutung dieses Genes insbesondere im Zusammenhang mit der Expression bzw. Mutation von p53 bleibt noch zu klären.

Veränderte Interaktionen der Tumorzelle mit der extrazellulären Matrix treten in mehreren Stadien der Metastasierung auf. Dies erfordert zelluläre Rezeptoren, insbesondere Integrine, welche an die extrazelluläre Matrix binden, z.B. Fibronektin. Wir fanden Fibronektin und seinen Rezeptor in der untersuchten Tumorzellinie deutlich herabreguliert. Das Glykoprotein Fibronektin spielt eine Schlüsselrolle im adhäsiven und migratorischen Verhalten von Zellen, wie Embryonalentwicklung, Hämostase und Wundheilung sowie onkogener Transformation und Metastasierung (Hynes, 1990).


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Neoplastische Zellen synthetisieren Fibronektin in geringeren Mengen als normale. Sie sind unfähig, Fibronektin für die effiziente Adhäsion auszubilden (Akiyama et al, 1995). Die stabile Transfektion von Fibronektin in die stark-metastasierende Maus-Mamma-Karzinom-Zellinie LMM3 resultierte in reduziertem Metastasierungspotential (Urtreger et al, 1998; Werbajh et al, 1998).

Der Abbau extrazellulärer Matrix durch Matrix-Metalloproteinasen, Serin-Proteasen und Cystein-Aspartyl-Proteasen ist ein weiterer wichtiger Aspekt in der Tumorinvasion und Metastasierung. U-PA (urokinase-type plasminogen activator), ein Mitglied der Serin-Protease-Familie, konvertiert Plasminogen in die aktive Form Plasmin, welches zahlreiche Komponenten der extrazellulären Matrix und der Basalmembran abbaut (Robbins et al, 1967; Liotta et al, 1981; Goldfarb et al, 1986). Die Aktivität von u-PA ist reguliert durch Plasminogen-Aktivator-Inhibitoren, so z.B. die Plasminogen-Aktivator-Inhibitoren 1 und 2. In malignen Tumoren fand sich eine erhöhte Expression von u-PA und PAI-1, welche mit der Invasivität korreliert war (Noguchi-Takino et al, 1996). Reduzierte Expression von PAI-2 wurde in Lungentumoren signifikant mit lymphogener Metastasierung und schlechter Prognose assoziiert (Yoshino et al, 1998). Wir konnten einen Verlust der PAI-2-Expression ebenfalls in unserem Versuchsansatz nachweisen.

Thrombospondin-1 (TSP-1) ist ein Glykoprotein, das nach Thrombin-Stimulation von alpha-Granula der Thrombocyten freigesetzt wird und ebenfalls eine transiente Extrazellulär-Matrix-Komponente in sich entwickelnden und regenerierenden Geweben darstellt. TSP-1 agiert als Zell-Adhäsionsmolekül, moduliert die Zell-Bewegung, das Neuritenwachstum und die Angiogenese (Adams, 1997). TSP-1 wird durch Wildtyp-p53 reguliert. Der Verlust von funktionell-aktivem p53 führt zu reduzierter Expression von TSP-1. Somit beruht eine tumor-supprimierende Aktivität von p53 auf der Stimulation des Angiogenese-Inhibitor TSP-1 (Dameron et al, 1994).


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Thrombospondin 1 gehörte zu den am häufigsten gefundenen Genen in der II. Bibliothek und war in den Tumorzellen deutlich reduziert exprimiert.

Diese Auswahl an Genen, die in den Bibliotheken kloniert wurden, macht deutlich, daß das gewählte Modell durchaus geeignet ist, neue Tumor- bzw. Progressions-assoziierte Gene zu identifizieren. Die Komplexität der Veränderungen während der Tumorigenese, Progression und Metastasierung wird durch die Vielzahl der Gene aus den unterschiedlichen Bereichen deutlich. Sie umfassen Transkriptionsfaktoren, Signaltransduktions-Faktoren, zytoskelettale Proteine, DNA-Reparatur-Enzyme, Angiogenesefaktoren, Zell-Extrazellulär-Matrix-Interaktionen und viele weitere mehr.

Wie gezeigt, korrelieren sie zum Teil mit den häufig alterierten chromosomalen Regionen, was auf die Möglichkeit der Identifizierung von Kandidatengenen für die häufig alterierten Regionen hinweist. Das kann zum einen erfolgen über die Homologie zu bereits kartierten und sequenzierten genomischen Klonen oder über das Kartieren der klonierten cDNA-Fragmente.

Es werden mittels dieser Technik allerdings auch solche Gene erfaßt, welche nicht durch DNA-Mutationen de-reguliert sind, sondern auf Transkriptionsebene reguliert werden. Das kann u.a. über Hypermethylierung der Promotor-Region erfolgen, wie es beim p16-Gen der Fall ist. Über das legigliche Screening von Onko- und Tumorsuppressorgenen auf DNA-Ebene werden diese Gene nicht identifiziert.

Die Tatsache, daß lediglich 40% der klonierten Sequenzen Homologien zu bereits bekannten Genen und vollständigen cDNA-Sequenzen ohne bekannte Funktion zeigen auf die noch zu leistende Arbeit hinsichtlich Identifizierung von Tumor-assoziierten Genen.


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5.4. Gen für das Calcyclin-bindende Protein

Im Rahmen dieser Arbeit konnte bereits ein neues Gen auf Chromosom 1q24-q25 näher charakterisiert werden, welches das Calcyclin-bindende Protein kodiert. Es zeigte Überexpression sowie Rearrangements auf DNA-Ebene in Lungentumor-Zellinien. Da diese Region auch in Primärtumoren häufig alteriert ist, stellt es ein neues Kandidatengen für die Überrepräsentation auf Chromosom 1q24 dar. Bislang gibt es noch keine Arbeiten, die auf die Funktion dieses Genes im Menschen hindeuten. Das Protein ist ursprünglich in der Maus auf der Suche nach Bindungspartnern von Calcyclin kloniert worden (Filipek & Kuznicki, 1998). Obwohl auch die Funktion von Calcyclin noch nicht genau geklärt ist, konnte die Induktion durch Serum, PDGF und EGF nachgewiesen werden (Calabretta et al, 1986a und b). Ebenso konnte die Bindung an Calcium und eine daraus resultierende Konformationsänderung gezeigt werden (Filipek et al, 1990; Potts et al, 1995). Die Menge an Calcyclin-mRNA wurde ebenfalls erhöht durch NGF (nerve growth factor), durch Retinoinsäure und durch ras-Transformation (Leonard et al, 1987; Thompson & Ziff, 1989; Tonini et al, 1991; Guo et al, 1990; Chambers & Tuck 1993). Diese Beobachtungen deuten auf eine mögliche Funktion innerhalb der Signaltransduktionskaskade hin. Interessanterweise zeigt das Calcyclin-bindende Protein mehrere Phosphorylierungsstellen sowie eine Kernlokalisationsdomäne. Die Funktion dieses Gens bzw. Proteins bleibt jedoch noch zu klären.

Die Überexpression von Calcyclin sowie Amplifikationen wurden in einer Reihe epithelialer Tumoren nachgewiesen, u.a in Plattenepithelkarzinomen des Mundes, in Melanomen und Hauttumoren (Berta et al, 1997; Weterman et al, 1993; van Groningen et al, 1995; Brinck et al, 1995).


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5.5. Ausblick

Die bislang vorliegenden CGH-Daten weisen darauf hin, daß sich dem Muster chromosomaler DNA-Imbalanzen von Karzinomen des Respirationstraktes bestimmte Phänotypen zuordnen lassen. In Zukunft bleibt noch zu klären, wie prädiktiv diese Veränderungen sind und welche genetische Zusatzuntersuchungen sich sinnvoll in der Diagnostik einsetzen lassen, doch erscheint eine genetische Klassifikation prinzipiell möglich. Die den chromosomalen Veränderungen zugrundeliegenden und mit ihnen assoziierten genetischen Defekte sind zu einem Großteil noch nicht identifiziert und charakterisiert. Die bislang klonierten Sequenzen sollen unter Berücksichtigung ihrer chromosomalen Lokalisation die Grundlage für die Identifizierung weiterer Kandidatengene in der Tumorigenese von Lungentumoren bilden. Das Fernziel ist die Zusammenstellung eines Musters von Genen, dessen Analyse eine Ausage über das Tumorverhalten erlaubt. Technisch ist dabei die Erstellung von Filtern mit den häufig alterierten Genen vorstellbar, auf die entweder genomische DNA oder cDNA der zu untersuchenden Tumoren hybridisiert werden können. Die Notwendigkeit solcher Zusatzuntersuchungen ist gerade bei der großen Gruppe der nichtkleinzelligen Lungenkarzinomen gegeben, da die konventionellen morphologischen Methoden nur sehr eingeschränkt eine Aussage über Prognose und biologisches Verhalten erlauben.


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