Petersen, Simone: Identifizierung genetischer Läsionen in der Progression und Metastasierung von Bronchialkarzinomen
Identifizierung genetischer Läsionen in der Progression und Metastasierung von Bronchialkarzinomen
Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
d o c t o r r e r u m n a t u r a l i u m
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von Dipl.-Biochemikerin Simone Petersen ,
geb. Bräuer
geb. am 24.01.72 in Cottbus

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin

Prof. Dr. Dr. h.c. H. Meyer

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. J.P. Rabe

Gutachter:
Prof. Saumweber
PD Dr. Scherneck
Prof. Birchmeier

Datum der Verteidigung: 17. 8. 99

Schlagwörter:
Lungenkarzinome, Genetik, Metastasierung, Progression

Keywords:
lung cancer, genetics, metastasis formation, progression

Zusammenfassung

Um chromosomale Veränderungen zu untersuchen, die mit dem metastatischen Phänotyp assoziiert sind, zu identifizieren, wurde die Comparative Genomische Hybridisierung (CGH) an Plattenepithelkarzinomen der Lunge durchgeführt. Der statistische Vergleich zwischen metastasierten und nicht-metastasierten Tumoren legte nahe, daß Deletionen von 3p12, 4p16, 6p22-p24, 6q24-q26, 8p21-p23, 10q und 21q22 sowie DNA-Gewinne bei 1q21-q25, 8q, 9q34, 11q13 und 15q11-q13 signifikant mit der Metastasierung assoziiert waren.

Ausgedehnte Allelotypisierungsstudien konnten 3 minimale Deletionsregionen auf Chromosom 10q nachweisen. Die Untersuchung der Kandidatengene PTEN/MMAC1, MXI1 und DMBT1 in diesen Bereichen war jedoch negativ. Zur Identifizierung neuer Kandidatengene in der Lungenkrebs-Progression zu identifizieren, wurde die Subtraktive Suppressions-Hybridisierung (SSH) eingesetzt. Der Expressionsvergleich einer metastasierten Adenokarzinomzellinie mit einer Primärkultur normaler Lungenepithelzellen resultierte in der Klonierung von 2 cDNA-Bibliotheken mit insgesamt 752 Klonen, welche sequenziert und im Northern Blot auf differentielle Expression untersucht wurden. In weniger als 40% zeigten sich Homologien zu bereits bekannten Genen.

Die weitere Analyse eines unbekannten cDNA-Fragmentes führte zur Klonierung und Charakterisierung eines neuen Genes, welches das humane Calcyclin-bindende Protein kodiert, auf Chromosom 1q24-q25. Die Überexpression dieses Genes in Lungenkarzinomzellinien sowie die Aufdeckung intra- und interchromosomaler Rearrangements mittels Fluoreszenz- in situ-Hybridisierung (FISH) weist auf eine mögliche Bedeutung in der Progression von Lungenkarzinomen hin.

Abstract

To identify chromosomal imbalances associated with the metastatic phenotype Comparative Genomic Hybridization (CGH) was applied to squamous cell carcinomas of the lung. The comparison of metastatic and non-metastatic tumors suggested that deletions of 3p12, 4p16, 6p22-p24, 6q24-q26, 8p21-p23, 10q, and 21q22 as well as DNA gains of 1q21-q25, 8q, 9q34, 11q13, and 15q11-q13 were significant associated with the metastasis formation. Extensive allelotyping studies revealed 3 minimal deleted regions of chromosome 10q. The mutational analysis of the three candidate genes PTEN/MMAC1, MXI1, and DMBT1 located near these regions was negative. To isolate new candidate genes involved in lung cancer progression suppression subtractive hybridization (SSH) was used. The comparison of the expression pattern of a metastatic lung adeno carcinoma cell line with a primary culture of normal airway epithelial cells resulted in the cloning of 752 cDNA fragments which were sequenced and investigated by Northern blot hybridization. The sequence comparison showed homology to known genes in less than 40%.

The further investigation led to the cloning and characterization of a new gene encoding the human Calcyclin-binding protein on chromosome 1q24-q25. The gene was overexpressed in a panel of lung cancer cell lines and showed intra- and interchromosomal reaarangements using fluorescence in situ- hybridization (FISH) suggesting the involvement of this gene in lung cancer progression.


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Inhaltsverzeichnis

TitelseiteIdentifizierung genetischer Läsionen in der Progression und Metastasierung von Bronchialkarzinomen
1 Einleitung
1.1.Epidemiologie von Lungenkarzinomen
1.2.Kanzerogenese und genetische Suszeptibilität
1.3.Genetische Veränderungen in Lungenkarzinomen
1.4.Zeitlicher Ablauf genetischer Veränderungen in der Tumorigenese von Lungentumoren
1.5.Tumorprogression und Metastasierung
2 Material
2.1.Puffer und Lösungen
2.2.Medien
2.3.Zellinien
2.4.Tumormaterial
3 Methoden
3.1.Comparative Genomische Hybridisierung (CGH)
3.1.1.Indirekte Markierung von DNA mittels Nicktranslation
3.1.2.Hybridisierung
3.1.3.Detektion
3.1.4.Bildaufnahme
3.1.5.Statistische Auswertung
3.2.Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung von PAC-Klonen
3.2.1.Metaphasenpräparation von Tumorzellen
3.3.Isolation von genomischer DNA
3.4.Restriktionsverdau
3.5.DNA-Agarose-Gelelektrophorese
3.6.Southern Blotting
3.7.Allelotypisierung
3.8.SSCP-Analyse
3.9.Direkte Sequenzierung von PCR-Produkten
3.10.RNA-Präparation aus Zellen
3.11.RNA-Präparation aus Gewebe mittels QIAGEN-RNeasy Mini Kit
3.12.RNA-Agarose-Gelelektrophorese
3.13.Northern Blotting
3.14.Radioaktive Markierung von Sonden
3.15.Radioaktive Hybridisierung von Northern- und Southern-Blots
3.16.cDNA-Synthese
3.17.Klonierung von PCR-Fragmenten
3.18.Plasmidpräparation
3.19.Automatische Sequenzierung
3.20.PolyA-RNA-Isolierung
3.21.Erstellung von Expressionsbibliotheken
4 Ergebnisse
4.1.Chromosomale Veränderungen in metastasierten und nicht-metastasierten Plattenepithelkarzinomen der Lunge
4.2.Allelverluste auf Chromosom 10q in der Progression und Metastasierung von Lungenkarzinomen
4.3.Mutationsanalyse der Kandidatengene MXI1, PTEN/MMAC1 und DMBT1 auf Chromosom 10
4.4.Differentiell exprimierte Gene in Lungenkarzinomzellinien
4.5.Charakterisierung des Genes für das humane Calcyclin-bindende Protein
5 Diskussion
5.1.CGH-Ergebnisse
5.2.Genetische Untersuchungen auf Chromosom 10q
5.3.Differentielle Genexpression
5.4.Gen für das Calcyclin-bindende Protein
5.5.Ausblick
6 Zusammenfassung
Abkürzungsverzeichnis Abkürzungen
Bibliographie Literaturverzeichnis
Danksagung
Selbständigkeitserklärung
Anhang A Publikationsliste

Tabellenverzeichnis

Tab. 1: Vergleich klinisch-pathologischer Parameter zwischen NSCLC und SCLC
Tab. 2: Vergleich genetischer Parameter zwischen NSCLC und SCLC
Tab. 3: Auflistung der in der Arbeit verwendeten Tumorzellinien
Tab. 4: Auflistung klonierter cDNA-Fragmente und der Northern Blot-Ergebnisse
Tab. 4: (Fortsetzung)
Tab. 4: (Fortsetzung)
Tab. 4: (Fortsetzung)
Tab. 5: Exons und flankierende intronische Sequenzen (fettgedruckt/unterstrichen)

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1 Chromosomale Lokalisation wichtiger Onko- und Tumorsuppressorgene in Lungentumoren. Proto-Onkogene sind rechts, Tumorsuppressorgene sind links neben den Chromosomenideogrammen dargestellt.
Abb. 2 Schematische Darstellung der Bildung eines invasiven Karzinoms mit Metastasierung ausgehend von mehrreihigem Flimmerepithel, über Hyper- und Dysplasie und carcinoma in situ.
Abb. 3 Sequentielle Akkumulation genetischer Veränderungen in der Tumorigenese von nichtkleinzelligen Lungentumoren (nach Sekido et al, 1998)
Abb. 4 Die Komparative Genomische Hybridisierung (CGH)
Abb. 5 Schema zur Erstellung einer cDNA-Bibliothek mittels PCR-Select (aus PCR select, Kit-Vorschrift, CLONTECH)
Abb. 6 Zusammenfassung der chromosomalen Veränderungen in 50 Plattenepithelkarzinomen der Lunge in Form eines Histogramms. Areale auf der linken Seite entsprechen DNA-Verlusten, die auf der rechten Seite DNA-Überrepräsentationen. Die vertikalen Linien geben die Inzidenz der Veränderungen als prozentualen Anteil der Fälle an, welche diese Veränderungen aufweisen. Alterationen mit 99%-iger Signifikanz sind blau und mit 95%-iger Signifikanz grün dargestellt. Die Zentromer-Regionen der Chromosomen 1, 9 und 16 müssen von der Evaluation ausgeschlossen werden.
Abb. 7 Differenzhistogramm von nicht-metastasierten (grün)- und metastasierten (rot) Plattenepithelkarzinomen der Lunge. Regionen mit statistisch signifikanten Veränderungen im Vergleich beider Tumorsubgruppen nach chi2-Test sind als Balken dargestellt. Graue Balken entsprechen dabei den Regionen mit 95%-iger Signifikanz (0.01<p<0.05), schwarze Balken denen mit 99%-iger Signifikanz (p<0.01).
Abb. 8 Vergleich chromosomaler Veränderungen von Primärtumoren und korrespondierenden Metastasen. (A) CGH-Strichdarstellung eines Primärtumors (Striche in der indizierten Position nahe am Chromosomenideogramm) und einer großen und kleinen Lebermetastase (Striche in der mittleren und äußeren Position). (B) Profile von Primärtumor und je einer Metastase für drei Chromosomen mit metastasierungsrelevanten Loci.
Abb. 9 Ergebnisse der Allelotypisierungs-Analyse in den 17 Plattenepithelkarzinomen mit Allelimbalanz. Die Marker sind in der oberen Reihe ohne den Präfix D10S aufgeführt. Kleine Zahlen dazwischen geben die genetische Distanz zwischen den einzelnen Markern in cM an. Schwarze Ellipsen entsprechen LOH, weiße Heterozygotie. Nicht- informative Marker sind grau dargestellt. Die drei minimal deletierten Regionen sind markiert. msi, Mikrosatelliten-Instabilität.
Abb. 10 Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus-Analyse von PCR-Produkten des STS 74k innerhalb der genomischen Sequenz des DMBT1-Gens. T, Tumor-DNA; N, korrespondierende normale Lungengewebs-DNA. Unterschiede im Laufverhalten zwischen einzelnen Patienten sind durch Polymorphismen des Gens verursacht.
Abb. 11 Sequenzierung von PCR-Produkten aus dem DMBT1-Gen. Rechts ist ein Teil der Wildtyp-Sequenz sichtbar, links ein Fragment des Falles 67. Die Sequenz ist ablesbar und ergibt einen Austausch der Basen 3416 bis 3418 von CAC zu AGT.
Abb. 12 Beispiele von Northern Blot-Untersuchungen differentiell exprimierter Gene. N: normales Bronchialepithel (SAEC), T: metastasiertes Adenokarzinom (D51). Die gleichmäßige Beladung der Gele wurde mittels ß-Actin-Kontroll-Hybridisierung bestätigt.
Abb. 13 Northern Blot-Untersuchung des AIM1-Genes in Lungenkarzinom-Zellinien.
Abb. 14 Northern Blot-Untersuchung des Klones II-45 auf Chromosom 1q24-q25 in Lungenkarzinom-Zellinien. Dieselbe Membran wurde anschließend mit einer ß-Actin-Sonde hybridisiert. 1) SAEC, 2) D117, 3) BEN, 4) H82, 5) COLO668, 6) D97, 7) A427, 8) H446, 9) DMS53, 10) CPC-N.
Abb. 15 Gewebespezifische Expression von Klon II-45 auf polyA-RNA-Northern Blots (CLONTECH): 1) Pankreas, 2) Niere, 3) Skelettmuskulatur, 4) Leber, 5) Lunge, 6) Plazenta, 7) Gehirn, 8) Herz, 9) Blutleukozyten, 10) Dickdarm, 11) Dünndarm, 12) Ovarien, 13) Hoden, 14) Prostata, 15) Thymus, 16) Milz.
Abb. 16 Genomische Struktur des humanen Calcyclin-bindenden Proteins. Schwarze Balken entsprechen den Exons. Das Gen überspannt 10,7 kb genomische DNA.
Abb. 17 Promotorregion des Gens für das Calcyclin-bindende Protein. Der transkribierte DNA-Bereich ist fettgedruckt. Es finden sich mehrere SP1-Bindungsstellen GGCGGG sowie eine TATAA-Box, welche unterstrichen sind. Das ATG-Startcodon ist ebenfalls unterstrichen.
Abb. 18 Fluoreszenz-in situ- Hybridisierung einer Tumormetaphase der kleinzelligen Bronchialkarzinomzellinie H209 mit dem PAC HS102G20, der das Gen für das humane Calcyclin-bindende Protein enthält. Links) DAPI-Färbung zur Identifizierung der Chromosomen, rechts) FITC-Signal mit zwei Signalen auf den Chromosomenabschnitten 1q24-q25 und ein drittes Signal auf einem aberranten Chromosom, welches über DAPI-Färbung nicht identifizierbar ist. Die spezifischen Signale sind mit Pfeilen angezeigt.

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