Rohr, Ute: sCD14, TNF, Interleukin-6, sICAM-1 und sE-Selektin im septischen Geschehen



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Kapitel 3. Materialien und Methoden

3.1. Patientengut

3.1.1. Einschlußkriterien

Für die vorliegende prospektive Studie wurden 28 Patienten einer interdisziplinären Intensivstation untersucht. Alle Patienten hatten bei Aufnahme klinische Zeichen eines SIRS. Bei allen Patienten konnte im Laufe des stationären Aufenthaltes ein oder mehrere Infektionserreger, die für die klinisch manifeste Infektion verantwortlich waren, isoliert werden. Bei 19 Patienten entwickelte sich daraus eine schwere Sepsis mit katecholaminpflichtiger Kreislaufinsuffizienz und Organdysfunktionen von denen 10 Patienten im septischen Multiorganversagen verstarben. Die Einteilung in 3 Gruppen erfolgte retrospektiv.

Gruppe 1.:

Patienten mit einer mikrobiellen Infektion, die im Beobachtungszeitraum keine Zeichen einer Sepsis entwickelten. Alle Patienten dieser Gruppe überlebten.

Gruppe 2.:

Patienten mit einer schweren mikrobiellen Infektion, die im Beobachtungszeitraum eine schwere Sepsis mit Organdysfunktion entwickelten und überlebt haben.

Gruppe 3.:

Patienten mit einer schweren mikrobiellen Infektion, die im Beobachtungszeitraum eine schwere Sepsis mit Organdysfunktion entwickelt haben und im septischen Multiorganversagen verstorben sind.

Die Differenzierung zwischen den 3 Gruppen erfolgte nach den klinischen Sepsiskriterien [79]. Der Tag des klinischen Sepsisbeginns wird mit SB = Tag 0 bezeichnet. An diesem Tag waren die Kriterien für eine Sepsis mit Organdysfunktion erstmals erfüllt.

3.1.1.1. Kriterien für Infektion, SIRS und Sepsis

Eine Infektion ist eine entzündliche Gewebereaktion auf Mikroorganismen oder Invasion von Mikroorganismen in normalerweise steriles Gewebe verstanden.

Ein SIRS liegt dann vor, wenn 2 oder mehr der folgenden Symptome erfüllt sind, welche durch ein Trauma oder anderen klinischen Insult verursacht sind [79]:

  1. Körpertemperatur: > 38°C oder < 36 °C
  2. Herzfrequenz: > 90/min
  3. Atemfrequenz: > 20/min oder paCO2 < 32 mm Hg
  4. Leukozyten: > 12000 /mm3 oder < 4000 /mm3, oder > 10% unreife Formen.


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Eine Sepsis liegt dann vor, wenn 2 oder mehr der folgenden Symptome durch eine mikrobielle Infektion bedingt sind:

  1. Körpertemperatur: > 38°C oder < 36 °C
  2. Herzfrequenz: > 90/min
  3. Atemfrequenz: > 20/min oder paCO2 < 32 mm Hg
  4. Leukozyten: > 12000 /mm3 oder < 4000 /mm3, oder > 10% unreife Formen.

Eine schwere Sepsis ist gekennzeichnet durch das Vorliegen der Sepsiskriterien mit zusätzlichen Zeichen der Organdysfunktion, Hypoperfusion oder septisch induzierter Hypotension.

Eine Hypoperfusion wird definiert als Laktat-Erhöhung, Azidose, Oligurie oder eine akute Veränderung der Bewußtseinslage.

Die septische Hypotension wird definiert als systolischer Blutdruck < 90 mmHg oder ein Abfall von > 40 mmHg vom Ausgangswert bei Ausschluß anderer Ursachen.

Als septischer Schock wird eine septische Hypotension bezeichnet, die trotz adäquater Flüssigkeitszufuhr persistiert und mit Zeichen der allgemeinen Hypoperfusion oder Organdysfunktionen einhergeht. [79]

3.1.2. Ausschlußkriterien

Das Vorliegen folgender Kriterien bei der Aufnahme des Patienten auf der Intensivstation galt als Ausschlußkriterium:

3.1.3. Kriterien des Multiorganversagens (MOV)

Zur Diagnose des Organversagens wurde der Multiple-Organ-Failure-Score (MOF-Score) von GORIS et al. [48] benutzt. Er erlaubt eine schnelle und klinisch einfache Beurteilung der Organfunktion in 3 Abstufungen. Er besteht aus einem Punktesystem von maximal 14 Punkten. Innerhalb der 7 betrachteten Organsysteme erfolgt eine Bewertung des Schweregrades der Funktionsstörung.

Ein MOF-Score > 4 wird als Multiorganversagen bezeichnet [95]. Ein Rückgang der Werte um 2 Punkte innerhalb von 24 h wird als eine Verbesserung der Organfunktion interpretiert [95,100].

Die Erfassung des physiologischen Ausgangsstatus erfolgte anhand des APACHE-II-Score [65].


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3.1.4. Intensivtherapie bei Sepsis

Die Therapie war in allen 3 Gruppen gleich und basiert auf den Richtlinien der Gesellschaft für Intensivmedizin (SCCM) [115]. Sie beinhaltet eine kalkulierte bzw. gezielte Antibiotikatherapie, Gerinnungsoptimierung, mögliche Sanierung des Sepsisherdes, Beatmungstherapie, Volumen- und Katecholamintherapie sowie frühzeitiger Einsatz der kontinuierlichen veno-venösen Hämofiltration (CVVH).

Bei allen Patienten wurde ein invasives hämodynamisches Monitoring durchgeführt. Dieses beinhaltete einen zentralen Venenkatheter, eine arterielle Blutdrucküberwachung, einen Blasenkatheter und einen Rechtsherzkatheter (Swan-Ganz-Katheter). Zielgrößen der Behandlung waren:

arterielle Mitteldruck (MAD):

> 70 mmHg

zentraler Venendruck (ZVD):

10-12 mmHg

pulmonalkapillärer Verschlußdruck (PAWP):

12-14 mmHg

systemischer Gefäßwiderstand (SVR):

800-1300 dyn x cm -5 x sec

Urinausscheidung:

1 ml /kg/h

Hämatokrit (Hk):

34 - 38 Vol %

Gerinnungsoptimierung:

AT III ge 100 % der Norm

Optimierung der SvO2:

60 - 70%

3.1.5. Blutabnahmeschema

Von allen Patienten wurden vom Aufnahmetag an, an 11 aufeinanderfolgenden Tagen morgens 7.00 Uhr 10 ml Blut mittels EDTA - Monovetten abgenommen. Bei den Patienten der Gruppen 2 und 3 wurden nach dem klinischen Sepsisbeginn die Blutentnahmen noch 7 Tage fortgesetzt.

Das Blut wurde sofort bei 3000 U/min kühlzentrifugiert, das gewonnene Plasma aliquotisiert und bis zur Bearbeitung bei < -35 °C eingefroren.


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3.2. Methoden

3.2.1. Der Enzymimmunoassay

Die Bestimmung von sCD14, der Mediatoren TNFalpha und Interleukin-6 sowie der löslichen Adhäsionsmoleküle sE-Selekin und sICAM-1 erfolgte mittels Enzymimmunoassay.

Abb. 7: Prinzip des Enzymimmunossays

Die im Kit enthaltene Mikrotiterplatte ist mit einem monoklonalen Antikörper gegen die zu untersuchende Substanz beschichtet (1.Antikörper).

Zuerst werden die Standards oder Proben in die entsprechenden Vertiefungen pipettiert und reagieren mit dem 1. Antikörper. Nach Abschluß der Reaktion werden überschüssige Bestandteile der Proben durch Waschen entfernt.

Nach Zugabe von Meerrettich-Peroxydase (HRP) markiertem polyklonalen Antikörpern (2.Antikörper) kann sich in einer anschließenden Inkubation ein Sandwich-Komplex aus dem 1. Antikörper, der zu untersuchenden Substanz in der Probe und dem enzymmarkierten Antikörper (2. Antikörper) bilden. Überschüssiger enzymmarkierter Antikörper wird durch Waschen entfernt.

Mit Zugabe der chromogenen Lösung (Tetramethylbenzidin=TMB) beginnt die Bildung eines farbigen Endproduktes, wobei die Farbintensität der Menge der zu untersuchenden Substanz in der Probe oder im Standard proportional ist.

Diese Reaktion wird durch Zugabe einer Säurelösung beendet. Anschließend wird die Absorption des farbigen Endproduktes bei 450 nm gemessen und ausgewertet.


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3.2.2. Die Bestimmung von TNFalpha im Plasma

Die Bestimmung von TNFalpha im Plasma wurde mit dem MILENIA®-Testkit der DPC-Biermann GmbH Deutschland durchgeführt.

Durchführungsvorschrift

100 µl Probe oder Standard in die mit dem 1. Antikörper beschichtete Mikrotiterplatte pipettieren



darr


+ 150µl Probenpuffer



darr

2 h bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubieren

4x mit je 300 µl Pufferlösung waschen



darr


+ 200 µl Anti-TNFalpha - HRP Konjugat



darr

2 h bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubieren

4x mit je 300 µl Pufferlösung waschen



darr


+200 µl Substratlösung (TMB)



darr

30 min bei Raumtemperatur abgedunkelt inkubieren

+ 50 µl Stopplösung



darr

schütteln

Messung der Extinktion bei 450 nm innerhalb von 15 min und Auswertung der Ergebnisse


Referenzwerte:

Der laborinterne Referenzbereich liegt von 0-40 pg/ml (n = 45 gesunde Probanden). Die Empfindlichkeit des Tests wird mit 6 pg/ml angegeben.


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3.2.3. Die Bestimmung von IL-6 im Plasma

Die Bestimmung von IL-6 im Plasma erfolgte mittels des Enzymimmunoassays (MILENIA®-Testkit) der DPC-Biermann GmbH Deutschland.

Durchführungsvorschrift

100 µl Probe oder Standard in die mit dem 1. Antikörper beschichtete Mikrotiterplatte pipettieren



darr


+ 150µl Probenpuffer



darr

2 h bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubieren

4x mit je 300 µl Pufferlösung waschen



darr


+ 200 µl Anti-IL-6 - HRP Konjugat



darr

2 h bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubieren

4x mit je 300 µl Pufferlösung waschen



darr


+200 µl Substratlösung (TMB)



darr

30 min bei Raumtemperatur abgedunkelt inkubieren

+ 50 µl Stopplösung



darr

schütteln

Messung der Extinktion bei 450 nm innerhalb von 15 min und Auswertung der Ergebnisse


Referenzwerte:

Der laborinterne Referenzbereich liegt bei 0 - 48 pg/ml (n = 56 gesunde Probanden). Die Nachweisgrenze dieses Testsystems liegt bei 4,0 pg/ml.


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3.2.4. Die Bestimmung von sCD14 im Plasma

Die Bestimmung des löslichen LPS-Rezeptors sCD14 im Plasma erfolgte nach der ELISA-Technik mittels eines Testsystems der IBL-Hamburg. Das in der Probe enthaltene sCD14 wird spezifisch an die Antikörper gebunden, die an die Mikrotiterplatte immobilisiert sind. Im gleichen Schritt bindet der zweite, mit Biotin kunjugierte, monoklonale Antikörper an ein weiteres Epitop des sCD14-Moleküls. Ein Streptavidin-Peroxidase-Konjugat bindet sich an den Komplex. Nach Zugabe der Substratlösung entsteht eine Färbung, die der Konzentration an sCD14 proportional ist. Die Farbreaktion wird durch Zugabe der Stopplösung beendet und die optische Dichte bei 450 nm gemessen und ausgewertet. Vor Testbeginn müssen die Proben je nach sCD14-Gehalt mit gebrauchsfertigem Puffer verdünnt werden.

Durchführungsvorschrift:

5 µl Plasma auf 1000 µl Verdünnungspuffer



darr


50 µl Probe in die entsprechenden Vertiefungen pipettieren


+ 50 µl Anti-sCD 14



darr

2 h bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubieren

3x mit Pufferlösung waschen



darr


+ 150 µl Anti-sCD14-Peroydase Konjugat



darr

1 h bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubieren

3x mit Pufferlösung waschen



darr


+ 200 µl Substratlösung



darr

20 min bei Raumtemperatur abgedunkelt inkubieren

+ 100 µl Stopplösung


Messung der optischen Dichte bei 450 nm innerhalb von 15 min und computergestützte Auswertung



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Referenzbereich:

Der laborinterne Referenzbereich für sCD14 im Plasma reicht von 1,4 - 4,4 µg/ml (n = 48 gesunde Probanden). Die untere Nachweisgrenze für diesen Test beträgt < 1,0 ng/ml.

3.2.5. Die Bestimmung von sICAM-1 im Plasma

Die Bestimmung des löslichen ICAM-1 im Plasma erfolgte mittels des sICAM-1-Parameter®-Testkits der R & D Systems, Minneapolis, MN USA.

Durchführungsvorschrift:

100 µl Anti-sICAM-HRP Konjugat in die entsprechenden Vertiefungen der Mikrotiterplatte geben



darr


+ 100 µl Probe oder Standard



darr

1,5 h bei Raumtemperatur inkubieren

6x mit Pufferlösung waschen



darr


+100 µl Substratlösung (TMB)



darr

30 min bei Raumtemperatur inkubieren

+ 100 µl Stopplösung



darr


Messung der Extinktion bei 450 nm innerhalb von 15 min und Auswertung der Ergebnisse


Referenzbereich:

Die Referenzwerte für die sICAM-1-Spiegel im Plasma werden mit 229,0 - 410,0 ng/ml angegeben. [45]. Die Empfindlichkeit des Tests liegt bei < 0,35 ng/ml.


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3.2.6. Die Bestimmung von sE-Selektin im Plasma

Die Bestimmung des löslichen E-Selektins im Plasma erfolgte mittels des sE-Selektin-Parameter®-Testkits der Firma R & D Systems, Minneapolis, MN USA. Der Test ist ein Enzymimmunoassay, wie er unter 3.2.1. beschrieben wurde.

Durchführungsvorschrift:

100 µl Anti-sE-Selektin-HRP Kunjugat in die entsprechenden Vertiefungen der Mikrotiterplatte geben



darr


+ 100 µl Probe oder Standard



darr

1,5 h bei Raumtemperatur inkubieren

6x mit je 300 µl Pufferlösung waschen



darr


+100 µl Substratlösung (Tetramethylbenzidin = TMB)



darr

30 min bei Raumtemperatur inkubieren

+ 100 µl Stopplösung



darr


Messung der Extinktion bei 450 nm innerhalb von 15 min und Auswertung der Ergebnisse


Referenzwerte:

Die Referenzwerte für sE-Selektin-Spiegel im Plasma werden mit 9,0 - 42,0 ng/ml angegeben. [45]

Die Empfindlichkeit des Tests beträgt < 0,1 ng/ml.


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3.3. Statistik

Die statistische Auswertung der Ergebnisse erfolgte mit dem Statistikprogramm SigmaStat Version 1.0 (1992 - 1994) der Jandel Corporation.

Die Ergebnisse werden innerhalb der tabellarischen Darstellung als Mittelwerte ± Standardabweichung (x ± SD) und innerhalb graphischer Darstellungen als Mittelwerte ± Standardfehler (x ± SEM) angegeben.

Zur Auswertung der Ergebnisse wurde eine Varianzanalyse nach Friedman (ANOVA) durchgeführt. Für den Vergleich verschiedener Daten innerhalb von Gruppen wurde der Student-Newman-Keuls-Test angewendet.

Bei signifikanten Differenzen zwischen den Gruppen wurden Multiple-Range-Teste vorgenommen. Die Korrelation wurde mit dem Sperman´schen-Rankkorrelationskoeffizient berechnet. Eine Signifikanz wurde bei einem p < 0,05 angenommen.


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