Schroeter, Matthias: Das antioxidative System der Blut-Hirn-Schranke - Einfluß von Astrozyten sowie Hypoxie/Reoxygenierung

Aus der Neurologischen Klinik des Universitätsklinikums Charité der Humboldt-Universität zu Berlin Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. K. M. Einhäupl


DISSERTATION
Das antioxidative System der Blut-Hirn-Schranke - Einfluß von Astrozyten sowie Hypoxie/Reoxygenierung

Zur Erlangung des akademischen Grades doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité, der Humboldt-Universität zu Berlin

von Matthias Schroeter ,
geb. am 22. Oktober 1965 in Döbeln

Dekan: Universitätsprofessor Dr. med. Dietel

Gutachter:
Prof. Dr. U. Heinemann
PD Dr. U. Dirnagl
PD DR. J.E. Blasig

eingereicht: April 1998

Datum der Promotion: 26. 10. 1998


Seiten: [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58]

Inhaltsverzeichnis

TitelseiteDas antioxidative System der Blut-Hirn-Schranke - Einfluß von Astrozyten sowie Hypoxie/Reoxygenierung
Abkürzungsverzeichnis Verzeichnis verwendeter Abkürzungen und chemischer Formeln
1 Einleitung
1.1.Struktur und Funktion der Blut-Hirn-Schranke
1.1.1.Einfluß von Astrozyten auf die Funktion der Blut-Hirn-Schranke
1.2.Zerebrale Ischämie - Generierung und Abbau freier Radikale
1.2.1.Bildung von reaktiven Sauerstoff-Spezies
1.2.2.Abbau von reaktiven Sauerstoff-Spezies
1.2.3.Signaltransduktion und freie Radikale - der nukleäre Faktor-kB
1.3.Funktion der Blut-Hirn-Schranke während Ischämie/Reperfusion
1.4.Fragestellung der Arbeit
2 Material und Methoden
2.1.Präparation und Kultivierung der Zellen
2.2.Hypoxie/Reoxygenierung
2.3.Biochemische Methoden
2.3.1.Aktivität antioxidativer Enzyme
2.3.2.Glutathion-Gehalt
2.3.3.Lipidperoxidation
2.4.Molekularbiologische Methoden
2.4.1.Gehalt an mRNA der Mangan-Superoxiddismutase
2.4.2.Bindungsaktivität des nukleären Faktors-kB
2.5.Immunozytochemische Methoden
2.5.1.Verwendete Antikörper
2.5.2.Färbeprotokoll
2.5.3.Fluoreszenz- und konfokale Laser-Scan-Mikroskopie
2.6.Permeationsmessung
2.7.Statistische Auswertung
3 Ergebnisse
3.1.Vergleich von primären und immortalisierten Gehirnkapillarendothelzellen
3.2.Antioxidative Enzyme und Substanzen in Monokultur
3.3.Antioxidative Enzyme und Substanzen in Kokultur
3.3.1.Signaltransduktion in Kokultur - Zytokine und Wachstumsfaktoren
3.4.Antioxidatives Potential während Hypoxie/Reoxygenierung in Monokultur
3.4.1.Signaltransduktion während Hypoxie/Reoxygenierung
3.4.1.1.Nukleärer Faktor-kB
3.4.1.2.Zytokine
3.5.Antioxidatives Potential während Hypoxie/Reoxygenierung in Kokultur
3.6.Lipidperoxidation während Hypoxie/Reoxygenierung in Monokultur
3.7.Lipidperoxidation während Hypoxie/Reoxygenierung in Kokultur
3.8.GFAP-Immunoreaktivität von Astrozyten in Mono- und Kokultur
3.9.Parazelluläre Permeabilität nach Hypoxie/Reoxygenierung - Einfluß von Superoxiddismutase
3.10.Aktivität antioxidativer Enzyme und Lipidperoxidation in vivo
4 Diskussion
4.1.Relevanz von Untersuchungen in vitro für Vorgänge in vivo
4.2.Astrozyten besitzen in Monokultur ein höheres antioxidatives Potential als Gehirnkapillarendothelzellen
4.3.Gehirnkapillarendothelzellen in Monokultur sind empfindlicher gegenüber Hypoxie/Reoxygenierung als Astrozyten
4.4.Kokultivierung von Gehirnkapillarendothelzellen und Astrozyten führt zur Erhöhung des antioxidativen Potentials
4.5.Kokultivierung von Gehirnkapillarendothelzellen und Astrozyten führt zu geringerer Sensitivtät gegenüber Hypoxie/Reoxygenierung
4.6.Konsequenzen für die Funktion der Blut-Hirn-Schranke
4.7.Bedeutung der in vitro-Untersuchungen für Vorgänge in vivo
5 Zusammenfassung
Anhang A Anhang
Bibliographie Literaturverzeichnis
Danksagung
Lebenslauf
Selbständigkeitserklärung

Tabellenverzeichnis

Tab. 1.1 Einfluß von AZ auf typische Eigenschaften von GKEZ.
Tab. 1.2 Erkrankungen des ZNS mit gestörtem Radikal-Metabolismus.
Tab. 1.3 Klinisch untersuchte Pharmaka zur Behandlung der zerebralen Ischämie.
Tab. 2.1 Methoden zur Bestimmung der Enzymaktivität von CuZnSOD, MnSOD, Cat und GPx.
Tab. 2.2 Antikörper, die bei den immunozytochemischen Untersuchungen verwendet wurden.
Tab. 3.1 Aktivität von CuZnSOD, MnSOD, Cat, GPx sowie Gehalt an GSH bzw. GSSG im Vergleich zwischen RBE4 und primären GKEZ. MW±SD. Anzahl der Proben in Klammern. *p<0,05; ***p<0,001 im Vergleich zu primären GKEZ (Mann-Whitney Rangsummentest).
Tab. 3.2 Aktivitäten von MnSOD, CuZnSOD und GPx in Prozent der Kontrolle (=100%) nach Inkubation von AZ mit IL-1ß/TNF-a (2 ng/ml bzw. 1,7 ng/ml). MW+SD.
Tab. 3.3 Aktivitäten von MnSOD, CuZnSOD und GPx in Prozent der Kontrolle (=100%) nach Inkubation von GKEZ und AZ mit bFGF/ECGF (10 ng/ml bzw. 20 mg/ml). MW+SD. *p<0,05 im Vergleich zur Kontrolle; One Way ANOVA gefolgt von Student-Newman-Keuls Test.
Tab. 3.4 MnSOD-Aktivität in GKEZ und AZ nach Inkubation mit IL-1ß/TNF-a (2 ng/ml bzw. 1,7 ng/ml). Angabe in Prozent der Kontrolle (=100%). MW+SD. *p<0,05 im Vergleich zur Kontrolle; Student-t-Test.

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1.2 Bildung und Abbau von freien Radikalen, wie z. B. während Ischämie/Reper-fusion (bzw. Hypoxie/Reoxygenierung) in GKEZ.
Abb. 1.3 Wirkung von NF-kB auf die Transkription verschiedener Gene. Vaskuläres Zell-Adhäsions-Molekül-1 (VCAM-1), Epitheliales Leukozyten-Adhäsions-Molekül (ELAM), Interzelluläres Adhäsions-Molekül-1 (ICAM-1), Cyclooxygenase-2 (COX-2), induzierbare NOS (iNOS) (Morishita et al., 1997; O’Neill und Kaltschmidt, 1997).
Abb. 2.1 Kokultur-Modelle aus Gehirnkapillarendothelzellen (GKEZ) und Astrozyten (AZ) ohne (Modell I) bzw. mit morphologischem Kontakt (Modell II).
Abb. 2.2 Faktor VIII-Immunoreaktivität in RBE4 in (A) Monokultur und (B) Kokultur mit AZ (Kokultur ohne morphologischen Kontakt). Cy3; Vergrößerung 400 x.
Abb. 2.3 Sauerstoff-Partialdruck (pO2) während 2 h Hypoxie gefolgt von 1 h Reoxygenierung. Messung erfolgte in begaster PBS. Vor Beginn der Begasung in 6-Well-Platten wurde die PBS für 30 min mit Nelson-Gas durchströmt (-30 bis 0 min). An der mit Pfeil markierten Stelle wurde der Begasungsdruck kurzzeitig verringert.
Abb. 2.4 Abhängigkeit der im Assay gemessenen Aktivität von Cat bzw. GPx von der eingesetzten Konzentration gereinigten Enzyms (c). MW+SD; n=5 (Cat), n=4 (GPx).
Abb. 2.5 Standardkurve zur Messung der Aktivität von CuZn- und MnSOD. Die prozentuale Hemmung der Reaktion von .O2- mit INT durch SOD (als Maß für deren Aktivität) wurde gegen den dekadischen Logarithmus der eingesetzten Konzentration der Standard-SOD aufgetragen. MW von 6 Messungen je SOD-Konzentration.
Abb. 2.6 Primer für MnSOD entsprechend der von Ho et al. (1991) angegebenen Gensequenz.
Abb. 3.1 Aktivität von CuZnSOD, MnSOD und Cat in GKEZ (EZ) und AZ in Monokultur (leere Balken) und Kokultur ohne morphologischen Kontakt (EZc, AZc; schraffierte Balken). MW+SD. CuZnSOD/MnSOD n=10; Cat n=6. ***p<0,001, **p<0,01 im Vergleich zu EZ; ### p<0,001 im Vergleich zu AZ (Mann-Whitney Rangsummentest).
Abb. 3.2 Gehalt an GSH und GSSG sowie Aktivität von GPx in GKEZ (EZ) und AZ in Monokultur (leere Balken) und Kokultur ohne morphologischen Kontakt (EZc, AZc; schraffierte Balken). MW+SD. GSH/GPx n=10; GSSG n=6. ***p<0,001, **p<0,01 im Vergleich zu EZ; ### p<0,001 im Vergleich zu AZ (Mann-Whitney Rangsummentest). ‘nd’ bedeutet ‘nicht detektierbar’.
Abb. 3.4 MnSOD-Immunoreaktivität in GKEZ und AZ in Mono- und Kokultur (Markierung mit Cy3; konfokale Laser-Scan-Mikroskopie). GKEZ in (A) transversaler Ebene, (B) sagittaler Ebene. (C) AZ in sagittaler Ebene. (1) Monokultur von GKEZ bzw. AZ. (2) und (3) Kokultur von GKEZ mit AZ; in (2) ohne, in (3) mit morphologischem Kontakt. (F) Filter zwischen GKEZ und AZ. (Co) Kontrolle.
Abb. 3.5 Gehalt an MnSOD-mRNA in GKEZ (EZ) und AZ in Monokultur bzw. Kokultur (EZc, AZc). ß-Actin als endogener, externer Standard. Repräsentatives Beispiel von jeweils 4 unabhängigen Experimenten.
Abb. 3.6 Aktivitäten von CuZnSOD, MnSOD, Cat und GPx nach 2 h Hypoxie (Hy) gefolgt von 0,5 h Reoxygenierung (Re) im Vergleich zur normoxischen Kontrolle (Co; =100%). GKEZ in Monokultur. MW+SD. n=8. *p<0,05 (Kruskal-Wallis One Way ANOVA on Ranks gefolgt von Student-Newman-Keuls Test).
Abb. 3.7 Aktivitäten von CuZnSOD, MnSOD, Cat und GPx nach 2 h Hypoxie (Hy) gefolgt von 0,5 h Reoxygenierung (Re) im Vergleich zur normoxischen Kontrolle (Co; =100%). AZ in Monokultur. MW+SD. n=8 außer CuZnSOD, Hyp n=6, GPx, Hyp n=4. *p<0,05 (Kruskal-Wallis One Way ANOVA on Ranks mit Student-Newman-Keuls Test).
Abb. 3.8 Bindungsaktivität von NF-kB in GKEZ nach 2 h Hypoxie gefolgt von 0,5 h Reoxygenierung. Inkubation mit IL-1ß als Positivkontrolle.
Abb. 3.9 Bindungsaktivität von NF-kB in AZ nach 2 h Hypoxie gefolgt von 0,5 h Reoxygenierung.
Abb. 3.10 Bindungsaktivität von NF-kB in monokultivierten GKEZ und AZ nach 2 h Hypoxie (Hyp) gefolgt von 0,5 bzw. 1 h Reoxygenierung (Re) im Vergleich zur entsprechenden normoxischen Kontrolle (=100%; Co). n=2; bis auf GKEZ 2 h Co n=4, 2 h Hyp n=3; AZ 2,5 h Co und +0,5 h Re n=1.
Abb. 3.11 Aktivitäten von CuZnSOD, MnSOD, Cat und GPx nach 2 h Hypoxie (Hy) gefolgt von 0,5 h Reoxygenierung (Re) im Vergleich zur normoxischen Kontrolle (Co; =100%). GKEZ, in Kokultur mit AZ ohne morphologischen Kontakt. MW+SD. n=8. *p<0,05 (Kruskal-Wallis One Way ANOVA on Ranks gefolgt von Student-Newman-Keuls Test).
Abb. 3.12 Aktivitäten von CuZnSOD, MnSOD, Cat und GPx nach 2 h Hypoxie (Hy) gefolgt von 0,5 h Reoxygenierung (Re) im Vergleich zur normoxischen Kontrolle (Co; =100%). AZ, in Kokultur mit GKEZ ohne morphologischen Kontakt. MW+SD. n=8. *p<0,05 (Kruskal-Wallis One Way ANOVA on Ranks gefolgt von Student-Newman-Keuls Test).
Abb. 3.13 Gehalt an Malondialdehyd (MDA) in GKEZ und AZ nach 2 h Hypoxie gefolgt von 1 h Reoxygenierung im Vergleich zur normoxischen Kontrolle. Monokultur und Kokultur (ohne morphologischen Kontakt). MW+SD. n=6. **p<0,01 im Vergleich zur Kontrolle, Monokultur; # p<0,05 im Vergleich zur Kontrolle, Kokultur (Mann-Whitney Rangsummentest).
Abb. 3.14 GFAP-Immunoreaktivität in AZ im Vergleich zwischen (A) Monokultur und (B) Kokultur mit GKEZ (AZ und GKEZ auf gegenüberliegenden Seiten des Filters). Markierung mit Cy2. Konfokale Laser-Scan-Mikroskopie. Monokultur: 16 Aufnahmen alle 3,75 mm (56,25 mm erfaßt). Kokultur: 25 Aufnahmen alle 1,6 mm (38,4 mm erfaßt).
Abb. 3.15 Fluoreszein-Permeabilität durch GKEZ nach 1 h Hypoxie mit Reoxygenierung von 0,5 h (Hyp/Reox) im Vergleich zur normoxischen Behandlung (Normoxie), jeweils ohne bzw. mit SOD. Angaben im Vergleich zur Kontrolle (=100%). MW+SD. n=5 für Normoxie+SOD; n=8 für Hyp/Reox; n=6 für Hyp/Reox+SOD. **p<0,01 im Vergleich zu Normoxie; ## p<0,01 im Vergleich zu Hyp/Reox (Mann-Whitney Rangsummentest).
Abb. 1.1 GFAP-Immunoreaktivität in Gewebeschnitten aus Gehirnen adulter Ratten (Cortex). Darstellung der an die Gefäße grenzenden Endfüße der Astrozyten. Konfokale Laser-Scan-Mikroskopie; Cy2. Falschfarbendarstellung (Tiefenkodierung).
Abb. 3.3 GFAP- und MnSOD-Immunoreaktivität in Kokultur aus Gehirnendothelzellen und Astrozyten (mit morphologischem Kontakt). (1) GFAP, Cy2; (2) MnSOD, Cy3; jeweils sagittale Ebene. (EZ) Endothelzellen. (F) Filter. (AZ) Astrozyten. (3) Doppelmarkierung von GFAP (Cy2, grün) und MnSOD (Cy3, rot) auf Ebene der Endothelzellen, transversale Ebene.

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Tue Mar 9 14:45:42 1999