1

Kapitel 1. Einleitung

Die vorliegende Arbeit ist damit befaßt, den Einfluß von Astrozyten (AZ) auf die antioxidativen Schutzmechanismen von Gehirnkapillarendothelzellen (GKEZ) und mithin der Blut-Hirn-Schranke (BHS) zu klären. Als pathologische Prozesse wurden Hypoxie und Reoxygenierung in ihrer Wirkung auf das antioxidative Potential untersucht (Modell einer zerebralen Ischämie). Die Experimente wurden im wesentlichen an einem in vitro-Modell der BHS durchgeführt. Im folgenden sollen die Grundlagen der Untersuchungen dargestellt werden. Nach Ausführungen über die Struktur und Funktion der BHS (1.1.), die durch AZ beeinflußt werden (1.1.1.), wird auf die Prozesse bei Ischämie/Reperfusion im zentralen Nervensystem (ZNS) eingegangen (1.2.). Hierbei sind reaktive Sauerstoff-Spezies (ROS) von zentraler Bedeutung (1.2.1.-1.2.3.). ROS vermögen die BHS während Ischämie/Reperfusion bzw. Hypoxie/ Reoxygenierung zu öffnen (1.3.). Im letzten Kapitel der Einleitung wird, ausgehend vom bisherigen Kenntnisstand, die Fragestellung der Arbeit entwickelt (1.4.).

1.1. Struktur und Funktion der Blut-Hirn-Schranke

Bereits Ehrlich (1902) und Goldmann (1913) beschrieben eine Schranke, die Blut- und Gehirnkompartiment voneinander separiert. In die Blutbahn injizierte Farbstoffe, z. B. Trypanblau, führten zu keiner Färbung des Gehirns, im Gegensatz zu anderen Geweben (Betz et al., 1994). Diese BHS gewährleistet die normale nervale Funktion, indem sie homöostatische Verhältnisse in bezug auf Elektrolyte (z.B. Ca²⁺- und K⁺-Konzentration geringer extravasal als intravasal), Aminosäuren, Hormone und Neurotransmitter herstellt. GKEZ, welche die BHS bilden, unterscheiden sich in vivo von Endothelzellen anderer Organe. Zum Einen vermeiden kontinuierliche zonulae occludentes (tight junctions) die parazelluläre Bewegung polarer Moleküle. Zum Zweiten wird nichtregulierter transzellulärer Transport verhindert, indem keine Fenestrationen oder transendothelialen Kanäle ausgebildet werden und die Anzahl plasmalemmaler bzw. intrazellulärer Vesikel gering ist. Auf Grund dieser morphologischen Merkmale vermögen GKEZ Blut- und Gehirnkompartiment voneinander abzugrenzen. In vivo werden GKEZ von einer Kollagen enthaltenden extrazellulären Matrix umgeben, in welche Perizyten eingebettet sind. Daran schließen sich die Endfüße von AZ-Ausläufern an, welche 90% der Oberfläche der vaskulären Zylinder bedecken (Abb. 1.1; Anhang) und nur 0,4 nm von der Membran der GKEZ entfernt sind (Pardridge, 1991). Diese morphologische Nähe von GKEZ

2

1.1.1. Einfluß von Astrozyten auf die Funktion der Blut-Hirn-Schranke

Tabelle 1.1 gibt einen Überblick über die beschriebenen funktionellen Einflüsse von AZ auf GKEZ. Dabei wurde bei verschiedenen Effekten auch die Spezifität der Interaktion von GKEZ und AZ untersucht. Fibroblasten und Muskelzellen waren dabei ohne Einfluß auf GKEZ; teilweise waren nur GKEZ und keine anderen Endothelzellen von AZ beeinflußbar (Cancilla et al.,1993).

Tab. 1.1 Einfluß von AZ auf typische Eigenschaften von GKEZ.

Induktion von	Effektor	Referenz
verminderter Permeabilität	kokultivierte C6-Glioma-Zellen/AZ	Raub, 1996; Mertsch et al., 1997
erhöhtem transendothelialen elektrischen Widerstand	kokultivierte AZ/C6-Glioma-Zellen	Cancilla et al., 1993; Giese et al., 1995
tight junctions	AZ-konditioniertes Medium, kokultivierte AZ	Cancilla et al., 1993
g-Glutamyl-Transpeptidase	AZ/C6-Glioma-Zellen-konditioniertes Medium, kokultivierte AZ
Transportsystem für neutrale Aminosäuren (A-, Alanin-System; abluminale Membran)	kokultivierte AZ
Transportsystem für Glukose (carrier-vermittelt oder erleichterte Diffusion)	AZ/C6-Glioma-Zellen-konditioniertes Medium
gehirnspezifischem Glukosetransporter GLUT-1	kokultivierte AZ	Hayashi et al., 1997
Transferrin-Rezeptor	kokultivierte AZ (mit morphologischem Kontakt)
P-Glykoprotein (luminale Membran)	kokultivierte AZ (mit morphologischem Kontakt)
Na-K-Cl-Kotransporter	Interleukin-6 aus kokultivierten C6-Glioma-Zellen, C6-Glioma-Zellen-konditioniertem Medium	Sun et al., 1997
Na+-K+-ATPase (abluminale Membran)	kokultivierte C6-Glioma-Zellen	Cancilla et al., 1993
alkalischer Phosphatase	AZ-konditioniertes Medium, kokultivierte AZ, Interleukin-6 aus Glioma-Zellen-konditioniertem Medium	Cancilla et al., 1993 Takemoto et al., 1994
Mitochondrien	kokultivierte AZ (mit morphologischem Kontakt)	Hayashi et al., 1997
Vaskularisierung	kokultivierte AZ VEGF aus AZ (in vivo)	Cancilla et al., 1993 Laterra et al.,1993 Stone et al., 1995

(VEGF = vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor; vascular endothelial growth factor)

3

1.2. Zerebrale Ischämie - Generierung und Abbau freier Radikale

Im folgenden sollen pathologische Prozesse im ZNS (im besonderen zerebrale Ischämie/Reperfusion) dargestellt werden, welche mit Störungen der Homöostase zwischen Bildung und Abbau von ROS als einem wesentlichen Aspekt der multifaktoriellen Genese verbunden sind. Tabelle 1.2 gibt einen Überblick über diese Erkrankungen (Jesberger und Richardson, 1991; Cadet et al., 1996; Löschmann und Schulz, 1997; Knight, 1997; Mattson, 1997).

Tab. 1.2 Erkrankungen des ZNS mit gestörtem Radikal-Metabolismus.

Krankheit	Mechanismus
Amyotrophe Lateralsklerose	familiärer Typ: Mutationen im CuZnSOD-Gen führen zu reduzierter Aktivität
Demenz vom Alzheimer-Typ	unklar; erhöhter oxidativer Streß: vermindertes antioxidatives Potential, ß-Amyloid führt zur Bildung von ROS, bei familiärer Demenz vom Alzheimer-Typ Gendefekt auf Chromosom 21 (CuZnSOD beteiligt?), mis-sense-Mutation in mitochondrialer DNA mit reduzierter Cytochrom-c-Oxidase Aktivität (verstärkte Generierung ROS?)
Down-Syndrom	durch Trisomie 21 Überexpression CuZnSOD
Mitochondriale Enzephalopathie	unklar; Mutationen in mitochondrialer DNA durch ROS?
Multiple Sklerose	unklar (LPO des Myelins?); LPO erhöht, Fe-Chelatoren vermindern Progression der Krankheit
Morbus Parkinson	unklar; erhöhte LPO, erniedrigte Aktivität von GPx, Cat, SOD, verminderter GSH-Gehalt in substantia nigra, Monoaminooxidase bildet H2O2
Morbus Huntington	unklar; Reduktion der Atmungskettenfunktion, oxidative DNA-Schädigung, therapeutische Erfolge mit Antioxidantien
Ischämie/Reperfusion (sowie vaskuläre Demenz)	siehe im Text
Schädel-Hirn-Trauma-induzierte Epilepsie	unklar; LPO von Membranen?
Schizophrenie	unklar; im Katecholamin-Metabolismus erzeugte ROS stören Neurotransmission an dopaminergen Synapsen?
Spätdyskinesie (tardive dyskinesia)	durch Neuroleptika induzierte LPO führt zu Schädigung von Neuronen
Methamphetamin-Mißbrauch	.O2--vermittelte Neurotoxizität (transgene Mäuse, die CuZnSOD überexprimieren, zeigen geringere Empfindlichkeit)

(LPO = Lipidperoxidation; weitere Abkürzungen siehe 1.2.2.)

4

Die zerebrale Ischämie, eine prototypische Erkrankung des ZNS, hat von den erwähnten Erkrankungen neben der Demenz vom Alzheimer-Typ die größte epidemiologische Bedeutung. Der Schlaganfall (von dem 85% auf Ischämien, der Rest auf Hämorrhagien zurückzuführen ist) steht nach Herzkrankheiten und malignen Tumoren an dritter Stelle der Todesursachen in den zivilisierten Ländern. 10% der über 50 Jahre alten Deutschen sterben an einem Gefäßinsult (Poeck, 1990). Jedes Jahr werden in den USA 400.000 Patienten nach einem Schlaganfall aus dem Krankenhaus entlassen (Kistler et al., 1991). Die besondere Vulnerabilität des zerebralen Gewebes gegenüber Ischämie ist durch fehlende Sauerstoff- und Glukosevorräte sowie einen respiratorischen Quotienten von nahezu 1 bedingt. Der Energiebedarf des Gehirns wird fast ausschließlich durch oxidative Phosphorylierung gedeckt. Demzufolge kommt es bei Ischämie zu einem raschen Funktionsausfall von Neuronen. Nach 30 bis 40 s sistiert die Aktivität im Elektroenzephalogramm bei globaler Ischämie. Nach 4 bis 5 min treten die ersten Nekrosen an Ganglienzellen auf (Poeck, 1990; Dirnagl und Meisel, 1998).

1.2.1. Bildung von reaktiven Sauerstoff-Spezies

Die durch Ischämie hervorgerufenen metabolischen Veränderungen laufen in den Zelltypen des ZNS ähnlich ab. Hier soll im wesentlichen auf die Zellen der BHS, GKEZ und AZ, eingegangen werden. Der Energiemangel führt zu einer Abnahme des Gehaltes an Adenosintriphosphat (ATP) sowie einem intrazellulären Anstieg von Ca²⁺, welches wiederum Enzymsysteme aktiviert (Proteinkinase C, Proteasen, Endonukleasen, NO-Synthase [NOS], Phospholipasen). Daraus resultieren Proteolyse, Proteinphosphorylierung, DNA-Fragmentierung und Membranabbau. Glutamat wird freigesetzt (Exzitotoxizität) und verstäkt die Schadenskaskade im Sinne eines circulus vitiosus (Mertsch et al., 1995; Dirnagl und Meisel, 1998).

5

Abb. 1.2 Bildung und Abbau von freien Radikalen, wie z. B. während Ischämie/Reper-fusion (bzw. Hypoxie/Reoxygenierung) in GKEZ.

In diesem Prozeß werden ROS gebildet (Abb. 1.2), wobei dies im wesentlichen in der Reperfusionsphase stattfindet (oxidative burst). Eine Hauptquelle von ^.O₂^- ist unter diesen Bedingungen in makrovaskulären Endothelzellen die Xanthin-Oxidase (Zweier et al., 1994), welche bereits unter physiologischen Bedingungen eine 20 bis 25fach höhere Aktivität in GKEZ als in Hirnhomogenat besitzt (Terada et al., 1991). Xanthin-Oxidase wird in GKEZ während der Ischämie zusätzlich durch Proteolyse (Protease Calpain) bzw. Oxidierung einer Sulfhydrylgruppe aus Xanthin-Dehydrogenase gebildet. Ebenso wird mit dem Arachidonsäure-Metabolismus die Cyclooxygenase 2 aktiviert (Schmedtje et al., 1997). Neben diesen beiden Enzymen generieren auch die in den Mitochondrien lokalisierte NADH-Dehydrogenase und der Ubiquinon-Komplex des Cytochrom b sowie das mikrosomale Cytochrom-P-450-System ^.O₂^- (Matsuyama, 1996). Monoaminooxidase, ein Segment der ‘enzymatischen BHS’, ist zur Bildung von H₂O₂ in der Lage.

H₂O₂ kann mit ^.O₂^- (Haber-Weiss-Reaktion) bzw. in Anwesenheit von Metallen (Fenton-Reaktion) weiter zu ^.OH reagieren. NO^. und ^.O₂^- reagieren zu ONOO^-. Die Haber-Weiss- und Fenton-Reaktion werden durch einen geringen Transferrin- und Coeruloplasmin-Gehalt in der extrazellulären Flüssigkeit des Hirngewebes begünstigt (Betz, 1993). GKEZ besitzen im Unterschied zu Endothelzellen anderer Gewebe eine große Anzahl von Transferrin-Rezeptoren als

6

Für Endothelzellen wurde die Produktion von ROS wie ^.O₂^-, H₂O₂ und ^.OH während Hypoxie/Reoxygenierung nachgewiesen (Michiels et al., 1992; Kondo et al., 1996b; Kumar et al., 1996; Terada, 1996; Mertsch et al., 1997). AZ generieren ROS ebenfalls nach Hypoxie (Hori et al., 1994) jedoch später als GKEZ (Kondo et al., 1996b). Eine zusätzliche Quelle freier Radikale stellen Neutrophile dar, welche nach Aktivierung durch Ischämie ^.O₂^- mittels Nikotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat- (NADPH-) Oxidase bilden (respiratory burst). Neutrophile durchdringen im Rahmen inflammatorischer Prozesse bei Ischämie die BHS und können diese zusätzlich schädigen (Betz, 1993).

1.2.2. Abbau von reaktiven Sauerstoff-Spezies

Da bereits unter physiologischen Zuständen ca. 5% des metabolisierten O₂ zu ^.O₂^- konvertiert werden, müssen biologische Systeme mit wirksamen antioxidativen Systemen ausgestattet sein, die den Abbau von ROS ermöglichen (Betz, 1993; Abb. 1.2). Dieses antioxidative System besteht aus den folgenden Enzymen/antioxidativen Substanzen:

1. Superoxiddismutasen (SOD; EC 1.15.1.1) disproportionieren ^.O₂^- und kommen in Eukaryonten in drei verschiedenen Isoformen vor (SOD1, zytosolische CuZnSOD; SOD2, mitochondriale MnSOD [Matrix]; SOD3, extrazelluläre ezSOD). Während die CuZnSOD und MnSOD sowohl in GKEZ als auch in AZ exprimiert werden, wurde die Sekretion von ezSOD nur für AZ, jedoch nicht Endothelzellen gezeigt (Marklund, 1990). Die CuZnSOD hat mit einer Halbwertszeit von 6-10 Minuten eine deutlich kürzere Lebensdauer als die MnSOD mit 5-6 Stunden (Gorecki et al., 1991). MnSOD ist teilweise auch zytosolisch nachweisbar, was durch eine fehlende Mitochondrieneintrittssequenz bei Überexpression bedingt sein könnte (Nishida et al., 1993; Kühl, 1996).

   ---

   7

2. Catalase (Cat; EC 1.11.1.6) metabolisiert H₂O₂ und ist in den Peroxisomen lokalisiert. Cat ist an der BHS in den die Gefäße bedeckenden Endfüßen der AZ konzentriert, in GKEZ dagegen immunohistochemisch nicht nachweisbar (Moreno et al., 1995).
3. Glutathion-Peroxidase (GPx; EC 1.11.1.9) baut H₂O₂ sowie Peroxide ab und benötigt dabei reduziertes Glutathion als Ko-Substrat. Vier Isoformen der GPx sind bekannt (Ursini et al., 1995). Die zytosolisch (c) sowie mitochondrial in der Matrix lokalisierte cGPx metabolisiert Hydroperoxide außer Hydroperoxiden komplexer Lipide (Flohé, 1989; Panfili et al., 1991). Die Phospholipid-Hydroperoxid-GPx (PHGPx) baut neben Hydroperoxiden geringen Molekulargewichts ebenfalls Hydroperoxide komplexer Lipide und von Cholesterol ab (Thomas et al., 1990). Weiterhin wurden eine extrazelluläre oder Plasma-GPx (Yamamoto und Takahashi, 1993) sowie die gastrointestinale GPx (Chu et al., 1993) beschrieben. Von diesen Isoformen scheinen nur die cGPx und die PHGPx in den Zellen der BHS vorzukommen. Während Damier et al. (1993) eine Beschränkung der GPx-Immunoreaktivität im Gehirn auf AZ berichteten, konnten Jornot und Junod (1995) cGPx in Endothelzellen in vitro nachweisen.
4. Weiterhin zählen zum antioxidativen System unspezifische antioxidative Substanzen wie Ascorbinsäure, a-Tocopherol, Glukose und Glutathion.

Shukla et al. (1995) konnten zeigen, daß isolierte zerebrale mikrovaskuläre Gefäße der Ratte im Vergleich mit Hirnhomogenat eine höhere Aktivität antioxidativer Enzyme aufweisen (Cat war 3,5fach, GPx und Glutathion-Reduktase 2fach höher; SOD war vergleichbar). Dieser Befund verdeutlicht die Bedeutung der antioxidativen Systeme für die BHS. Obwohl GKEZ und AZ in ihrem antioxidativen Potential bisher nicht verglichen wurden, ist ein relativ hohes antioxidatives Potential von AZ im Vergleich zu Neuronen/Oligodendroglia bekannt (Copin et al., 1992; Dringen und Hamprecht, 1997; Juurlink, 1997). Demgemäß konnten Desagher et al. (1996) sowie Lucius und Sievers (1996) beobachten, daß AZ Neurone vor oxidativem Streß schützen können.

Während Ischämie/Reperfusion bzw. Hypoxie/Reoxygenierung kommt es in der Regel zu einer Abnahme des antioxidativen Potentials (Plateel et al., 1995; Rabin et al., 1996). Eine mögliche Ursache sind vermehrt gebildete ROS. So kann ^.O₂^- die Enzyme Cat und GPx inaktivieren (Kono und Fridovich, 1982; Kühl, 1996). H₂O₂ und ^.O₂^- können CuZnSOD inaktivieren, jedoch nicht MnSOD (Sinet und Garber, 1981).

Eine Sonderstellung nimmt die MnSOD ein. Diese ist auf vielfältige Weise induzierbar (ionisierende Strahlung, ^.O₂^-, H₂O₂, Zytokine, z. B. Tumor-Nekrose-Faktor [TNF], Interleukin [IL]-1, Interferon-g; Wong, 1995; Kühl, 1996; Pinteaux et al., 1996). Im Falle der amyotrophen Lateralsklerose (Blaauwgeers et al., 1996) bzw. des Menkes-Syndrom (Menkes’ kinky

8

1.2.3. Signaltransduktion und freie Radikale - der nukleäre Faktor-kB

Bisher wurde nur die destruktive Wirkung von ROS dargestellt. ROS sind andererseits an der Signaltransduktion bei vielfältigen Prozessen beteiligt: Wirkung und Sekretion von Zytokinen, Wachstumsfaktoren und Hormonen; Apoptose und Transkription. ROS können ebenso den Ionen-Transport durch Kanäle beeinflussen (Lander, 1997). Hier soll nur ein Beispiel für die regulatorische Funktion von ROS auf transkriptionaler Ebene dargestellt werden, die Regulation der Bindungsaktivität des nukleären Faktors-kB (NF-kB).

Das Aktivator-Protein-1 (AP-1) und NF-kB sind Transkriptionsfaktoren, die in Abhängigkeit vom Redoxpotential der Zellen reguliert werden. Dabei hat NF-kB in GKEZ und AZ die größere Bedeutung. NF-kB spielt eine zentrale Rolle bei der Aktivierung von GKEZ, wie sie z. B. im Rahmen eines Reperfusionsschadens stattfindet (Ferran et al., 1995). Die Aktivierung von AZ (wie bei Gliosis) scheint, im Gegensatz zu der von Neuronen oder Mikroglia, ebenfalls über eine Erhöhung der Bindungsaktivität dieses Transkriptionsfaktors vermittelt zu sein (Pennypacker, 1997).

NF-kB ist ein als Heterodimer (meist p50/p65, RelA) vorliegender Transkriptionsfaktor, der im Zytoplasma an das spezifische inhibitorische Protein IkB gebunden vorliegt. Wird IkB durch Kinasen phosphoryliert, gelangt NF-kB in den Nukleus und bindet an cis-Elemente derjenigen Gene, die eine Bindungsregion für NF-kB enthalten. Da keine Neusynthese erforderlich

9

Abb. 1.3 Wirkung von NF-kB auf die Transkription verschiedener Gene. Vaskuläres Zell-Adhäsions-Molekül-1 (VCAM-1), Epitheliales Leukozyten-Adhäsions-Molekül (ELAM), Interzelluläres Adhäsions-Molekül-1 (ICAM-1), Cyclooxygenase-2 (COX-2), induzierbare NOS (iNOS) (Morishita et al., 1997; O’Neill und Kaltschmidt, 1997).

Die Wirkung von NF-kB im Rahmen eines ischämischen Insultes wird kontrovers diskutiert. Einerseits soll NF-kB neuroprotektiv wirken, konnten doch Bruce et al. (1996) in einer TNF-Rezeptor (p55/p75)-knock-out Maus eine Verstärkung der Folgen einer zerebralen Ischämie zeigen. Andererseits deuten Experimente, welche die Folgen einer Hemmung von NF-kB bei einer myokardialen Ischämie untersuchten, eine eher destruktive Wirkung dieses Transkriptionsfaktors an. Morishita et al. (1997) konnten mit NF-kB-decoy (-’Köder’), die NF-kB binden und inaktivieren, eine Reduktion des Infarktgebietes erreichen. Dieses Ergebnis könnte auch für den Reperfusionsschaden im ZNS relevant sein, da NF-kB die Adhäsion von Leukozyten und Makrophagen an GKEZ vermittelt. Auf eine neurodestruktive Wirkung von NF-kB deuten weiterhin Befunde, die durch eine Inaktivierung von NF-kB mit Azetylsalizylsäure eine Neuroprotektion in einem Glutamat-Exzitotoxizitätsmodell erreichten (O’Neill und

10

1.3. Funktion der Blut-Hirn-Schranke während Ischämie/Reperfusion

In Abbildung 1.2 sind die mit ROS in Zusammenhang gebrachten Schädigungen der BHS summarisch zusammengefaßt. Neben diesen kurzfristigen Schädigungen kommt es ebenfalls zu verzögerten Schäden durch Apoptose (Bonfoco et al., 1995; Plateel et al., 1995; Du et al., 1996).

Ein wesentliches Kriterium der BHS-Funktion ist die Dichtheit der BHS. Diese kann in vitro mittels transendothelialem elektrischen Widerstand sowie in vitro und in vivo mittels Permeabilität (z. B. für Evan’s Blau, markiertes Albumin, Fluoreszein, Harnstoff, Na⁺) gemessen werden (Zuckerman et al., 1994; Giese et al., 1995; Inoue et al., 1996b). In vivo soll eine Öffnung der BHS und die Störung der mikrovaskulären Funktion eher im Falle der lokalen als der globalen Ischämie (mit Ausnahme des Gerbil) eine Rolle spielen (Siesjö et al., 1995).

Während Ischämie/Reperfusion in vivo wurde eine zweiphasige Öffnung der BHS berichtet (Baethmann et al., 1991), die zur Ausbildung eines vasogenen Ödems führt. Das in der frühen Ischämie (nach Sekunden bis Minuten) auftretende, zytotoxische Ödem steht dagegen nicht mit einer Schädigung der BHS in Zusammenhang. Dieses frühe Ödem ist intrazellulär lokalisiert, reversibel und durch Elektrolyt-Verschiebungen (ATP-Mangel) bedingt. Bei kurzer Ischämie kommt es erst in der frühen Reperfusionsphase, mit der postischämischen Hyperperfusion, zur ersten Öffnung der BHS. Die zweite Erhöhung der Schrankenpermeabilität folgt nach vielen Stunden. Mit der Öffnung der BHS wird die Entstehung des vasogenen, extrazellulären Ödems eingeleitet. Bei länger anhaltender Ischämie tritt die Schädigung der BHS bereits in der Ischämie auf. Prinzipiell hat das Ödem nach arteriellem Verschluß seinen Höhepunkt nach 2 bis 3 Tagen erreicht und bildet sich dann wieder zurück (Baethmann et al., 1991). Ursache des vasogenen Ödems ist die Extravasation von Proteinen (z.B. Albumin), Plasma-Filtrat und anderen Molekülen in das extrazellulär-extravasale Kompartiment (Farooqui et al., 1994). Durch Steigerung des intrakraniellen Druckes kann es zur vaskulären Kompression und Herniation von Hirngewebe kommen, was die häufigste Ursache der Frühmortalität bei zerebraler Ischämie darstellt (Baethmann et al., 1991).

Martz et al. (1989) untersuchten den Einfluß von ROS auf die Permeabilität der BHS nach fokaler Ischämie/Reperfusion bei der Ratte. Die Applikation von Allopurinol, einem Hemmer der Xanthin-Oxidase, führte zu einer Verkleinerung des Hirnödems und des ischämi

11

Entsprechende Resultate wurden auch in vitro erhalten. Nach Hypoxie/Reoxygenierung nahm die Permeabilität von Monolayern aus pulmonalen Endothelzellen für Albumin zu, was durch CuZnSOD und Cat verhindert werden konnte (Lum et al., 1992). Ähnliches wurde auch für ein in vitro-Kokultur-Modell der BHS aus GKEZ und AZ gezeigt. Das Lazaroid U83836E konnte die Dichtheit während Hypoxie/Reoxygenierung aufrechterhalten (Giese et al., 1995; Mertsch et al., 1997), was die durch ROS induzierte Membran-Lipidperoxidation als Ursache für die Schädigung der BHS wahrscheinlich macht.

Einerseits wird aus diesen Ergebnissen deutlich, daß ROS die BHS während Ischämie/Reperfusion bzw. Hypoxie/Reoxygenierung zu öffnen vermögen. Andererseits stellen sich Möglichkeiten zur pharmakologischen Intervention während oder nach einer zerebralen Ischämie dar. Momentan werden große Anstrengungen zur Erforschung therapeutischer Möglichkeiten bei dieser Erkrankung unternommen. Dabei sind die bisherigen Bemühungen im wesentlichen auf den Schutz der Neurone gerichtet. Die Zellen der BHS werden weitgehend vernachlässigt.

Die Benennung des Schlaganfalls als ‘brain attack’ im angloamerikanischen Raum macht einen Paradigmenwechsel (Kuhn, 1988) deutlich. Patienten mit zerebraler Ischämie werden ähnlich Patienten mit Myokard-Infarkt (heart attack) als therapierbarer Notfall betrachtet, während bis vor einigen Jahren die Auffassung einer sehr beschränkten Therapierbarkeit vorherrschte. Durch Information der Bevölkerung erreichen Patienten zeitiger spezialisierte Einrichtungen (stroke units). Die Möglichkeiten rationaler pharmakologischer Behandlung sind jedoch noch beschränkt. Bisher existiert für Patienten mit zerebraler Ischämie keine allgemein akzeptierte Standardtherapie. Tabelle 1.3 gibt einen Überblick über die bisher klinisch untersuchten Substanzen.

12

Tab. 1.3 Klinisch untersuchte Pharmaka zur Behandlung der zerebralen Ischämie.

Substanz	Bemerkungen	Referenz
Antikoagulation/Thrombolyse		NINDS-Studie (1995), Koroshetz und Moskowitz (1996), Gass (1997), Ryan et al. (1997)
Heparinoide Antikoagulantien	erfolgreich
tPA	erfolgreich innerhalb 3 h
Streptokinase	Nebenwirkungen (Hämorrhagien)
Prourokinase	Nebenwirkungen (Hämorrhagien)
Urokinase	Nebenwirkungen (Hämorrhagien)
Glutamat-Rezeptor-Antagonisten
NMDA-Antagonisten	hohe Nebenwirkungsrate (Psycho-se, neuronale Vakuolisierung)
AMPA-Antagonisten	noch kein Ergebnis
Radikalfänger wie
Tirilazad (U74006F, 21-Aminosteroid=Lazaroid)	noch kein Ergebnis
Pergorgotein (Polyethylenglykol-SOD)	erfolgreich bei Schädel-Hirn-Trauma
Blocker der Adhäsion von Leukozyten an GKEZ	noch kein Ergebnis
Enlimomab (Anti ICAM-1 Antikörper)
Anti CD-11 Antikörper
Blocker spannungsgesteuerter Kanäle	noch kein Ergebnis bzw. ohne positiven Effekt (Nimodipin)
Na+-Kanal-Blocker
Ca++-Kanal-Blocker
Neurotrophine bFGF-Agonist	noch kein Ergebnis
GABA-Rezeptor-Agonisten Chloromethiazol	noch kein Ergebnis
Membranstabilisatoren Phospholipid-Präkursor Citicholin	noch kein Ergebnis

(AMPA = a-Amino-3-Hydroxy-5-Methyl-4-Isoxazolpropionat; bFGF = basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor, basic fibroblast growth factor; GABA = g-Aminobuttersäure, g-aminobutyrate; NMDA = N-Methyl-D-Aspartat; tPA = Gewebe-Plasminogen-Aktivator, tissue plasminogen activator)

Die therapeutischen Ansätze richten sich im besonderen auf den Schutz des funktionell, aber nicht strukturell geschädigten Gewebes (Penumbra) in der Randzone des Infarktes. Zwei therapeutische Strategien werden verfolgt: Einerseits die Wiederherstellung einer physiologischen Durchblutungssituation und andererseits zytoprotektive Maßnahmen. Bisher wurde nur Gewebe-Plasminogen-Aktivator (tissue plasminogen activator; tPA) in den USA zum klinischen Einsatz bei akutem ischämischen Schlaganfall innerhalb von 3 h zugelassen.

Prinzipiell ist die Therapie mit Antikoagulantien/Thrombolytika mit der Gefahr von zerebralen Hämorrhagien als Nebenwirkung verbunden. In einer Studie des Nationalen Institutes für neurologische Erkrankungen und Schlaganfall (USA) wurde ein signifikanter Anstieg von symptomatischen intrazerebralen Blutungen in den ersten 36 h berichtet (NINDS, 1995). Die klinischen Versuche mit anderen Thrombolytika mußten auf Grund dieser Nebenwirkungen abgebrochen werden. Hier erscheint eine Kombination mit Pharmaka möglich, die in der Reperfusion die BHS zu schützen vermögen und mithin intrazerebrale Blutungen verringern bzw. vermeiden könnten. Bisher wurden Kombinationstherapien jedoch nur sehr selten klinisch

13

Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß klinisch-therapeutische Ansätze zum Teil auf die Erhaltung der Integrität der BHS gerichtet sind. Die an in vitro-Modellen der BHS erhaltenen Ergebnisse während Hypoxie/Reoxygenierung korrelieren mit den in vivo-Daten gut. Dies läßt weitere Untersuchungen in Zellkultur-Modellen der BHS sinnvoll erscheinen.

1.4. Fragestellung der Arbeit

Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, (1) das antioxidative Potential von GKEZ und AZ zu vergleichen und (2) mögliche Einflüsse von AZ auf das antioxidative Potential von GKEZ zu untersuchen. Dies erschien aus verschiedenen Gründen sinnvoll. Das hohe antioxidative Potential von mikrovaskulären Gefässen des Gehirns scheint für die Aufrechterhaltung der BHS-Funktion von eminenter Bedeutung zu sein. Außerdem muß die BHS die Aufgaben einer antioxidativen Barriere zwischen Blut- (Radikalgenerierung) und Gehirnkompartiment (geringe Menge an Antioxidantien) erfüllen. Trotzdem wurde das antioxidative Potential von GKEZ und AZ bisher nicht systematisch verglichen. Weiterhin ist bekannt, daß AZ verschiedene Eigenschaften der BHS in GKEZ unterstützen bzw. induzieren. Aus diesen Gründen wurde von der Annahme ausgegangen, daß AZ das antioxidative Potential der BHS zu erhöhen vermögen. Zur experimentellen Untersuchung dieser Fragestellung mußte ein in vitro-System gewählt werden, da nur mit diesem methodischen Ansatz Effekte der Kokultivierung von GKEZ und AZ beobachtet werden konnten.

Neben der Wechselwirkung zwischen GKEZ und AZ wurde das Verhalten des antioxidativen Potentials während Hypoxie/Reoxygenierung (als Modell einer zerebralen Ischämie/Reperfusion) untersucht, bei dem ROS zu einer Öffnung der BHS führen. Auch hier war ein Vergleich von GKEZ in Monokultur mit GKEZ in Kokultur mit AZ notwendig, weil AZ

14

Um sowohl das antioxidative Potential der Zellen als auch die Radikalgenerierung zu erfassen, wurden die antioxidativen Enzyme CuZnSOD, MnSOD, Cat und GPx auf verschiedenen Ebenen (Aktivität, 2.3.1., Enzymprotein, 2.5.; mRNA, 2.4.1.), der Gehalt an Glutathion (2.3.2.) sowie die Membran-Lipidperoxidation (2.3.3.) bestimmt. Untersuchungen zur Signaltransduktion in Kokultur sowie bei Hypoxie/Reoxygenierung schlossen Messungen der Bindungsaktivität von NF-kB (2.4.2.) sowie des Einflusses von Zytokinen auf die Aktivitäten antioxidativer Enzyme ein. Als Parameter für die Funktion der BHS diente die Fluoreszein-Permeabilität (2.6.).

© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.