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Kapitel 2. Material und Methoden

2.1. Präparation und Kultivierung der Zellen

RBE4-Zellen (rat brain capillary endothelial cells) entstammten einem immortalisierten Zell-Klon, der mit einem das E1A-Adenovirus-Gen enthaltenden Plasmid transfiziert worden war (zur Verfügung gestellt von Prof. Couraud, Paris, Frankreich; Roux et al., 1994). Die Kultivierung in der 43. bis 55. Passage erfolgte in HAM’s F10/a-Medium (1:1) mit 10% fetalem Kälberserum, 2 mM L-Glutamin, 10 ng/ml basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (basic fibroblast growth factor, bFGF), 300 mg/ml Geneticin (Boehringer Mannheim) und 2,5 mg/ml Amphotericin B (Biochrom). Konfluente RBE4-Zellen boten eine polygonale Morphologie (‘Pflasterstein-Muster’).

Primäre GKEZ wurden aus Wistar-Ratten isoliert, die 3 Wochen alt waren und durch Dekapitation getötet wurden. Das Kulturmedium bestand aus Dulbecco’s MEM mit 1,2 mM L-Glutamin, 100 I.E./ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin, 2,5 mg/ml Amphotericin B (Biochrom), 100 mg/ml Heparin, 110 mg/ml Na-Pyruvat (Sigma), 10 mg/ml endothelialem Wachstumsfaktor (endothelial cell growth factor, ECGF; Boehringer Mannheim) und 20% fetalem Kälberserum. Konfluente primäre GKEZ besaßen lichtmikroskopisch eine spindelförmige Gestalt.

Primäre AZ wurden aus den Cortices neonataler Wistar-Ratten isoliert. Die Tötung der Tiere erfolgte mittels zervikaler Dislokation am 3. Tag post natum. Die Kultivierung erfolgte in Dulbecco’s MEM mit 2 mM L-Glutamin, 10% fetalem Kälberserum, 100 I.E./ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin, 2,5 mg/ml Amphotericin B. Über 95% der Zellen besaßen den für AZ typischen Marker gliales fibrilläres saures Protein (glial fibrillary acidic protein, GFAP). Vereinzelt waren Oligodendrozyten und Mikroglia-Zellen nachweisbar (Immunozytochemie siehe 2.5.). Die Mikroglia lag meist in einem aktivierten Zustand vor (amöboid, gerundet, auf der AZ-Schicht aufliegend).

Monokulturen von RBE4 bzw. primären GKEZ wurden für biochemische Analysen in mit Rattenschwanz-Kollagen Typ I (Sigma) beschichteten 6-Well-Platten (Falcon) angelegt. Für immunozytochemische Untersuchungen und Bestimmungen des mRNA-Gehaltes wurden RBE4 auf mit Rattenschwanz-Kollagen Typ I beschichteten Filtern monokultiviert. Die Kokultivierung von RBE4 mit AZ wurde in zwei unterschiedlichen Modellen durchgeführt (Abb. 2.1).

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Abb. 2.1 Kokultur-Modelle aus Gehirnkapillarendothelzellen (GKEZ) und Astrozyten (AZ) ohne (Modell I) bzw. mit morphologischem Kontakt (Modell II).

Im Kokultur-Modell I wurden RBE4 auf Filtereinsätzen kultiviert (0,45 mm Porengröße, 1,6x10⁶ Poren/cm², Falcon, beschichtet mit Rattenschwanz-Kollagen Typ I). AZ wuchsen auf dem Boden der 6-Well-Platten, welche die Filter enthielten. Im Kokultur-Modell II wurden die AZ auf der gegenüberliegenden Seite des Filters kultiviert. Während im Modell II morphologische Kontakte zwischen RBE4 und AZ bestanden, war im Modell I nur eine humorale Interaktion zwischen beiden Zelltypen möglich. In der Kokultivierung wurde dem Medium für die RBE4 kein bFGF zugesetzt; Geneticin wurde gegen 100 I.E./ml Penicillin sowie 100 mg/ml Streptomycin ausgetauscht. Damit sollten artifizielle Einflüsse auf die AZ ausgeschlossen werden. bFGF erhöht in Endothelzellen das antioxidative Potential (Yang und de Bono, 1997). Dies könnte auch für AZ zutreffen. Geneticin wirkt konzentrationsabhängig auf Zellen ohne Resistenzgen, wie z. B. AZ, toxisch.

Beide Typen von GKEZ besaßen allgemeine Endothelzell-Marker wie Faktor VIII, Angiotensin-konvertierendes Enzym sowie GKEZ-Marker wie alkalische Phosphatase und g-Glutamyl-Transpeptidase. RBE4 exprimierten außerdem die GKEZ-Marker Transferrin-Rezeptor und das zonula-occludens-Protein ZO-1, welche primäre GKEZ bekanntermaßen besitzen. Faktor VIII, alkalische Phosphatase und g-Glutamyl-Transpeptidase wurden in der Kokultur stärker als in der Monokultur exprimiert (Immunozytochemie siehe 2.5.). Abbildung 2.2 zeigt die verstärkte Expression von Faktor VIII in RBE4 in Kokultur mit AZ im Vergleich mit der Monokultur.

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Abb. 2.2 Faktor VIII-Immunoreaktivität in RBE4 in (A) Monokultur und (B) Kokultur mit AZ (Kokultur ohne morphologischen Kontakt). Cy3; Vergrößerung 400 x.

RBE4 besitzen folglich typische Eigenschaften von GKEZ und sind als Modell für Untersuchungen von GKEZ geeignet.

2.2. Hypoxie/Reoxygenierung

Vor der Hypoxie/Reoxygenierung wurden die konfluenten Monolayer von RBE4 bzw. AZ zweimal mit Phosphat-gepufferter Lösung (phosphate buffered saline; PBS mit Ca²⁺, Mg²⁺, Glukose-frei, pH 7,2; Biochrom) gewaschen. Anschließend wurde zu jedem Well 1 ml PBS gegeben, wobei die PBS zuvor mit Nelson-Gas (95% N₂/5% CO₂) gesättigt worden war. Die Hypoxie von 2 h wurde durch weitere Begasung mit Nelson-Gas im Wasserbad bei 37 °C hergestellt (erzielter pO₂ in der Inkubationslösung ca. 20 mmHg, 3% O₂). In der nachfolgenden Reoxygenierung wurden die Zellkulturen mit Carbogen (95% O₂/5% CO₂) über 0,5 oder 1 h begast. Im Inkubator plazierte Zellen dienten als Kontrolle. Die Begasung erfolgte in 6-Well-Platten, bei denen jedes Well separat über den Deckel begast wurde. Abbildung 2.3 zeigt den mit einem Oxymeter (Oxi 538/CellOx 325; WTW Weilheim) gemessenen pO₂ während 2 h Hypoxie gefolgt von 1 h Reoxygenierung in der begasten PBS. Zur Messung der Fluoreszein-Permeabilität wurde die Hypoxie auf 1 h verkürzt.

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Abb. 2.3 Sauerstoff-Partialdruck (pO₂) während 2 h Hypoxie gefolgt von 1 h Reoxygenierung. Messung erfolgte in begaster PBS. Vor Beginn der Begasung in 6-Well-Platten wurde die PBS für 30 min mit Nelson-Gas durchströmt (-30 bis 0 min). An der mit Pfeil markierten Stelle wurde der Begasungsdruck kurzzeitig verringert.

2.3. Biochemische Methoden

2.3.1. Aktivität antioxidativer Enzyme

Vor Messung der Enzymaktivitäten wurden die Zellen in aqua dest aufgenommen (200 ml pro Well einer 6-Well-Platte) und mittels Frieren/Tauen (flüssiger N₂) sowie nachfolgender Ultraschall-Behandlung (3 x 5 s, 0-2 °C) lysiert. Die Messungen erfolgten photometrisch (Beckman-Spektrophotometer DU 640) indem Substratabbau (Cat) bzw. die Metabolisierung anderer Substanzen (gekoppelte Tests für CuZnSOD, MnSOD und GPx) zeitabhängig verfolgt wurden (Tab. 2.1). Die Enzymaktivitäten wurden auf den Proteingehalt, der mit einer modifizierten Lowry-Methode (Sigma) bestimmt wurde, bezogen.

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Tab. 2.1 Methoden zur Bestimmung der Enzymaktivität von CuZnSOD, MnSOD, Cat und GPx.

Enzym	Prinzip	Einheit	? (nm), Substanz	T (°C)	Herstel-ler, Referenz
CuZnSOD (SOD1)	Xanthin/Xanthin Oxidase generieren .O2-, das mit INT zu einem roten Formazan-Farbstoff reagiert. SOD konkurriert mit INT um .O2-. SOD-Aktivität=Grad der Hemmung der Reaktion von .O2- mit INT. Kalibrierung mit Standardkurve.	U.mg-1	505, INT	37	Randox (SD 125), Suttle (1986)
MnSOD (SOD2)	Assay wie CuZnSOD, Zugabe von 1 mM KCN zur spezifischen Hemmung von CuZnSOD.
Cat	Abbau von H2O2 (Substrat der Cat) wurde verfolgt.	k in mg-1 .min-1	240, H2O2	30	Aebi (1987)
GPx	Die Reduktion von Cumen-Hydroperoxid durch GPx führt zur Oxidation von NADPH via GSH (gekoppeltes Assay mit Glutathion-Reduktase). Messung der Gesamt-GPx-Aktivität.	U.g-1	340, NADP+	37	Randox (RS 506), Paglia und Valentine (1967)

(INT = 2-[4-Iodophenyl]-3-[4-Nitrophenol]-5-Phenyltetrazolium Chlorid; GSH = reduziertes Glutathion)

Zur Validierung der Methodik wurden für Cat sowie GPx Messungen mit gereinigtem Enzym (Sigma) durchgeführt. Die Standardkurven zeigten einen nahezu linearen Verlauf (Abb. 2.4). Vor jeder Messung der SOD-Aktivität in Proben wurde eine Standardkurve durch Vermessung gereinigten Enzyms angefertigt (Abb. 2.5). Die Aktivitätsbestimmung in den Proben erfolgte nach Möglichkeit im Bereich des stärksten Anstieges der sigmoiden Standardkurve.

2.3.2. Glutathion-Gehalt

Der Glutathion-Gehalt wurde nach Griffith (1990) bestimmt. Die Zellen wurden in 5% Sulfosalicyl-Säure aufgenommen (200 ml pro Well einer 6-Well-Platte). Anschließend wurde zentrifugiert (1000 g, 10 min; T62). Reduziertes Glutathion (GSH) reagierte mit Ellman’s-Reagenz (5,5’-Dithio-bis[2-Nitrobenzosäure], DTNB) zu oxidiertem Glutathion (GSSG) und 2-Nitro-5-Thiobenzosäure (TNB). Die Bildung von TNB wurde photometrisch verfolgt (412 nm, Raumtemperatur; Uvikon 931). Der Ansatz enthielt folgende Substanzen (Endkonzentration): Phosphatpuffer 100 mM (pH 7,5); Ethylendiaminteraessigsäure (ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA) 5 mM; NADPH 0,2 mM; DTNB 0,6 mM; Gluta-

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Abb. 2.4 Abhängigkeit der im Assay gemessenen Aktivität von Cat bzw. GPx von der eingesetzten Konzentration gereinigten Enzyms (c). MW+SD; n=5 (Cat), n=4 (GPx).

Abb. 2.5 Standardkurve zur Messung der Aktivität von CuZn- und MnSOD. Die prozentuale Hemmung der Reaktion von ^.O₂^- mit INT durch SOD (als Maß für deren Aktivität) wurde gegen den dekadischen Logarithmus der eingesetzten Konzentration der Standard-SOD aufgetragen. MW von 6 Messungen je SOD-Konzentration.

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thion-Reduktase 1 kU/l (für Bestimmung von GSSG 4 kU/l). GSH und GSSG wurden separat bestimmt in Abwesenheit (Gesamt-Glutathion) oder nach Inkubation mit 8% 2-Vinylpyridin für 1 h (GSSG) unter Nutzung von Standards zur Kalibrierung. Der jeweilige Gehalt an Glutathion wurde auf den Proteingehalt (Bradford, 1976) bezogen und in nmol^.mg^-1 angegeben.

2.3.3. Lipidperoxidation

Die Zellen wurden in aqua dest aufgenommen (400 ml pro Well einer 6-Well-Platte). Die Zellsuspension wurde anschließend für 1 h in 1,5 ml Endvolumen (75 mM H₃PO₄, 10 mM Thiobarbitur-Säure) gekocht. Die Reaktion wurde durch Kühlung auf Eis gestoppt. Unmittelbar vor der Hochperformanz-Flüssigkeitschromatographie (high performance liquid chromatography, HPLC; Wong et al., 1987) wurde 1,5 ml 100 mM NaOH in Methanol (90%) dazugegeben (Eluent: 50 mM K-Phosphat-Puffer, pH 6,8, 40% Methanol). Mit der HPLC wurde der Gehalt an Malondialdehyd bestimmt (Shimadzu LC-10A Chromatograph mit RF-10A Fluoreszenz-Detektor; Säule Supelcosil 150 x 4 mm LC-18-S). Dabei wurde an Thiobarbitur-Säure gebundenes Malondialdehyd bei 525 nm detektiert und mittels Standard-Eichkurven (Malondialdehydbis-[diethylacetal]; Merck) quantifiziert. Der Gehalt an Malondialdehyd wurde in nmol^.mg^-1 Protein (Lowry, Sigma) angegeben.

2.4. Molekularbiologische Methoden

2.4.1. Gehalt an mRNA der Mangan-Superoxiddismutase

Der Gehalt an MnSOD-mRNA wurde mittels reverse Transkriptase-Polymerase-Ketten-Reaktion (RT-PCR) bestimmt. Die zelluläre Gesamt-RNA wurde mit TRIzol-Reagenz (Gibco-BRL; Chomczynski und Sacchi, 1987) entsprechend den Angaben des Herstellers isoliert (Aufnahme der Zellen von 3 Wells einer 6-Well-Platte in 1 ml TRIzol). Die Integrität der isolierten RNA wurde mit Agarose Gel-Elektrophorese kontrolliert. Nach der Bestimmung der Konzentration der totalen RNA bei 260 nm wurden 2 mg der Gesamt-RNA für die reverse Transkription (RT) zur Herstellung von first-strand cDNA eingesetzt (200 U M-MLV Reverse Transkriptase [Gibco-BRL], 33 U RNAsin [Promega], jeweils per mg RNA; 5 mM Random-Hexamere, 1 mM Desoxynucleosidtriphosphate [dNTPs], 10 mM Dithiothreitol [DTT]).

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Abb. 2.6 Primer für MnSOD entsprechend der von Ho et al. (1991) angegebenen Gensequenz.

Die amplifizierte Sequenz reichte von Exon 3 bis Exon 5 (und überspannte folglich Intron 3 und 4). Die Spezifität des erhaltenen Amplikons wurde durch Sequenzierung des PCR-Produktes (364 bp Länge) überprüft. Kontroll-Assays wurden mit den für ß-Actin der Ratte spezifischen Primern durchgeführt (Raff et al., 1997). Das erhaltene Fragment von 630 bp diente als externer, endogener Standard zur Kontrolle der Effizienz der RT sowie zur Kontrolle des cDNA-Gehaltes.

Phage fX 174 RF DNA nach Behandlung mit Hae III diente als Molekulargewicht-Standard (New England Biolabs). 0,25 ml (ß-Aktin) bzw. 2,5 ml (MnSOD) der in der RT erhaltenen cDNA wurden für die PCR eingesetzt (in Endvolumen von 25 ml). Die Amplifikation erfolgte in 27-28 Zyklen (ß-Aktin bei 95 °C für 30 s, 60 °C für 1 min, 72 °C für 30 s; MnSOD bei 95 °C für 30 s, 52 °C für 1 min, 72 °C für 30 s; entsprechend Schmelz-, Annealing- und Extensionstemperatur). Die Zyklenzahl wurde so gewählt, daß die Amplifikation im exponentiellen Bereich stattfand. Die für die PCR erforderlichen Substanzen wurden in folgenden Konzentrationen eingesetzt: MgCl₂ 2 mM (ß-Aktin) bzw. 1,5 mM (MnSOD), dNTP’s 0,1 mM, Primer 0,2 mM (ß-Actin) bzw. 0,8 mM (MnSOD), Taq-Polymerase (Gibco-BRL) 28 U/ml.

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2.4.2. Bindungsaktivität des nukleären Faktors-kB

Die Bestimmung der Bindungsaktivität von NF-kB erfolgte nach Schreiber et al. (1989) sowie Suzuki und Packer (1993) mittels Gel-Elektromobilitätsshift-Assay (gel electrophoretic mobility shift assay, EMSA).

Zur Extraktion der nukleären Proteine wurden die Zellen (pro Probe zwei 75 cm² Flaschen konfluenter Kulturen; ca. 10⁷ Zellen) in eiskalter PBS (ohne Ca²⁺, Mg²⁺, Glukose) aufgenommen und zentrifugiert (Hermle Z 360 K; 7500 g, 5200 rpm, 30 s). Anschließend wurde die Zellmembran lysiert (700 µl Puffer aus 0,3% Brij 97 [Sigma]; 50 mM NaCl; 50 mM Tris pH 7,4), gefolgt von erneuter Zentrifugation (Hermle Z 360 K; 7500 g, 5200 rpm, 30 s). Die im Sediment enthaltenen Zellkerne wurden mit 50 µl 20 mM Hepes pH 7,9; 400 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1 mM Ethylen-Glycol-bis[ß-Aminoethylether]N,N,N’,N’-Tetraessigsäure; 1 mM DTT; 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid lysiert. Nach Zentrifugation (Biofuge 13; 13800 g, 13000 rpm, 5 min) wurde der Überstand, der die extrahierten nukleären Proteine enthielt, entnommen und bei -80 °C gelagert.

Vor Durchführung des EMSA wurde der Protein-Gehalt bestimmt (Bradford, 1976). NF-kB-bindende Oligonukleotide wurden mit [g³²P]-ATP (Amersham) durch eine T4-Polynukleotidkinase (Pharmacia) radioaktiv markiert und mit Hilfe einer Säule (G-50 Sephadex, Pharmacia) vom verbliebenen [g³²P]-ATP gereinigt. 5 µg des Extraktes nukleärer Proteine wurden über 30 min mit [g³²P]-markierten, 1 µl NF-kB-bindenden Doppelstrang-Oligonukleotiden (65.000 counts/µl) und 3 µg poly(dI/dC) (Pharmacia) inkubiert, um die Bindung von NF-kB an die markierten Oligonukleotide zu ermöglichen. Die DNA-Protein-Komplexe wurden mit Mobilitätsshift elektrophoretisch (Sigma PS 500-2; 100-200 V; ca. 15 mA) in einem 4% igen Polyacrylamid-Gel mit 12,5 mM Trisborat, 0,25 mM EDTA (pH 8,0) aufgetrennt. Anschließend erfolgte Autoradiographie und densitometrische Auswertung der Autoradiogramme (EASY-Win 32). Zur Kontrolle der Spezifität wurden einzelne Proben mit AP-1- bzw. NF-kB-bindenden Oligonukleotiden, die nicht radioaktiv markiert waren, vor der Gel-Elektrophorese inkubiert.

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2.5. Immunozytochemische Methoden

2.5.1. Verwendete Antikörper

Die in den Experimenten eingesetzten Antikörper sind in Tabelle 2.2 aufgeführt. Für Doppelimmunofluoreszenz wurden jeweils ein Zelltyp-spezifischer Marker (z. B. GFAP für Astroglia) und ein zusätzliches Antigen (z. B. MnSOD) kombiniert.

Tab. 2.2 Antikörper, die bei den immunozytochemischen Untersuchungen verwendet wurden.

Antigen	Zelltyp	Hersteller
GFAP (gliales fibrilläres saures Protein, glial fibrillary acidic protein)	Astroglia	DAKO
O4	Oligodendroglia
ILB-4 (Lectin von Bandeiraea Simplicifolia BS-I Isolectin B4, markiert mit FITC)	Mikroglia	Sigma
Factor VIII (von-Willebrand-Faktor)	Endothel	DAKO
OX26 (Transferrin-Rezeptor)	GKEZ	Dianova
ZO-1 (zonula-occludens-Protein)		Chemicon
MnSOD		Asayama und Burr, 1985
Maus-Immunglobulin (markiert mit Cy2, Cy3, DTAF)		Dianova
Kaninchen-Immunglobulin (markiert mit Cy3)		Dianova
Ratten-Immunglobulin (markiert mit Rhodamin)		Chemicon

(Cy2 = Carbocyanin; Cy3 = Indocarbocyanin; DTAF = Dichlorotriazinyl-Fluorescein; FITC = Fluorescein-Isothiocyanat)

2.5.2. Färbeprotokoll

Nach dreimaligem Spülen (PBS ohne Ca²⁺, Mg²⁺, Glukose) wurden die Zellen mit 4% Paraformaldehyd fixiert (15 min), erneut gewaschen, mit 10% Ziegenserum inkubiert (10 min) und in 0,5% Triton-X 100 lysiert. Anschließend wurden die Proben mit dem primären Antikörper sowie nach nochmaligem Waschen mit dem sekundären Antikörper inkubiert (je 1 h, 37 °C). Nach Waschen und Trocknen wurden die Proben in Immu-Mount (Shandon) auf Objektträgern fixiert. Als Kontrolle dienten Proben ohne primären Antikörper.

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2.5.3. Fluoreszenz- und konfokale Laser-Scan-Mikroskopie

Zur Auswertung der Immunofluoreszenz wurden ein Fluoreszenz-Mikroskop (BH2-RFCA; Olympus) und ein konfokales Laser-Scan-Mikroskop (LSM 410 invert; Zeiss-Jena GmbH, Germany) eingesetzt. Angeregt wurde mit einem Argon-Krypton-Laser (Emission 488 nm; Cy2) bzw. mit einem Helium-Neon-Laser (Emission 543 nm; Cy3). Detektiert wurde mit Bandpaß 515-565 nm (Cy2) bzw. Langpaß 570 nm (Cy3).

2.6. Permeationsmessung

Die Bestimmung der Permeabilität von GKEZ-Monolayern, die bis zur Messung mit AZ kokultiviert worden waren (Kokultur-Modell 1), erfolgte durch Zugabe von 2 ml 50 µM Na-Fluoreszein (Molecular Probes) auf die Oberseite des Filters. Nach 10 min Inkubation wurde die Fluoreszein-Konzentration sowohl ober- als auch unterhalb des Filters fluorimetrisch gemessen (Exzitation 488 nm; Emission 512 nm; Perkin Elmer). Der Fluoreszein-Permeationskoeffizient wurde gemäß Dehouck et al. (1995) berechnet. Alle Daten wurden auf den Permeationskoeffizienten der Kontrolle vor Beginn der Hypoxie/Reoxygenierung (=100%) bezogen. Die Messungen wurden von D. Utepbergenov durchgeführt.

2.7. Statistische Auswertung

Die Ergebnisse wurden als Mittelwert+Standardabweichung (MW+SD) angegeben. Da a priori nicht von einer Normalverteilung ausgegangen werden konnte, wurde der Signifikanzgrad mit Hilfe des Mann-Whitney Rangsummentests (bei Vergleich zweier Gruppen) bzw. des Kruskal-Wallis One Way ANOVA on Ranks (bei Vergleich mehrerer Gruppen) ermittelt. An den Kruskal-Wallis One Way ANOVA on Ranks (der eine Aussage darüber trifft, ob sich mehrere Gruppen überhaupt signifikant voneinander unterscheiden) wurde ein Student-Newman-Keuls Test angeschlossen, um Aussagen über das Signifikanzniveau der Unterschiede zwischen einzelnen Gruppen zu erhalten. Im Falle der Experimente zur Untersuchung des antioxidativen Potentials während Hypoxie/Reoxygenierung wurden sämtliche Werte in Prozent der normoxischen Kontrolle (=100%) ausgedrückt. Regressionsanalysen (curve fitting) wurden mit dem Programm Sigma Plot, Scientific Graph System, Version 1.02 (Jandel Scientific) durchgeführt.

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