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Kapitel 3. Ergebnisse

3.1. Vergleich von primären und immortalisierten Gehirnkapillarendothelzellen

Da der Zellklon RBE4 für die Experimente benutzt wurde, wurden seine Eigenschaften mit denjenigen von primären GKEZ unter Kontrollbedingungen verglichen. RBE4 besaßen ein primären GKEZ ähnliches Muster antioxidativer Schutzsysteme (Tab. 3.1). Die Aktivitäten von Cat, GPx, sowie der Gehalt an GSH und GSSG unterschieden sich nicht signifikant, im Gegensatz zur Aktivität von CuZnSOD und MnSOD. In RBE4 betrug die Aktivität von CuZnSOD 184+13%, von MnSOD 23+7% der Aktivität in primären GKEZ (=100%; p<0,001 für CuZnSOD; p<0,05 für MnSOD). Eine ausreichende Gesamt-SOD-Aktivität ist in RBE4 vorhanden. RBE4 sind folglich für Untersuchungen der antioxidativen Systeme bzw. des Radikalmetabolismus von GKEZ geeignet und wurden für alle weiteren Experimente verwendet.

Die Unterschiede in der Aktivität von CuZnSOD und MnSOD könnten auf die Einflüsse anderer Zelltypen, z.B. AZ, auf primäre GKEZ im Gehirn vor der Zellisolierung zurückgeführt werden. Da MnSOD spezifisch durch TNF-a und IL-1 induziert wird (Wong und Goeddel, 1988), könnte die reduzierte MnSOD-Aktivität in RBE4 durch das Fehlen dieser Faktoren in vitro verursacht sein. CuZnSOD wird möglicherweise zur Kompensation der erniedrigten MnSOD-Aktivität in RBE4 induziert, um eine ausreichende Gesamtaktivität der SOD zu erreichen. Hierbei sind freie Radikale bzw. Oxidantien mögliche Mediatoren (Kong und Fanburg, 1992).

Tab. 3.1 Aktivität von CuZnSOD, MnSOD, Cat, GPx sowie Gehalt an GSH bzw. GSSG im Vergleich zwischen RBE4 und primären GKEZ. MW±SD. Anzahl der Proben in Klammern. *p<0,05; ***p<0,001 im Vergleich zu primären GKEZ (Mann-Whitney Rangsummentest).

	Aktivität von				Gehalt an
	CuZnSOD (U . mg-1)	MnSOD (U . mg-1)	Cat (min-1 . mg-1)	GPx (U . g-1)	GSH (nmol . mg-1)	GSSG (nmol . mg-1)
RBE4	3,19+0,22*** (10)	0,016+0,005* (10)	2,69+0,25 (6)	27,17+8,54 (10)	76,61+10,43 (10)	0,35+0,17 (6)
primäre GKEZ	1,73+0,58 (6)	0,07+0,04 (3)	2,61+0,77 (5)	28.22+16.4 (7)	89.45+21.1 (8)	1,91+2,62 (6)

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3.2. Antioxidative Enzyme und Substanzen in Monokultur

In Monokultur zeigten AZ ein höheres antioxidatives Potential als GKEZ (Abb. 3.1, 3.2 und 3.5). Die Aktivitäten von MnSOD, Cat und GPx erreichten in AZ 229+68%, 164+40% bzw. 449+89% der Aktivität in GKEZ (=100%), wobei alle Differenzen signifikant waren (p<0,003). Die Aktivität von CuZnSOD sowie der Gehalt an GSH unterschieden sich in AZ und GKEZ nicht signifikant. GSSG war nur in GKEZ in geringen Mengen (0,35+0,17 nmol^.mg^-1) nachweisbar.

Abb. 3.1 Aktivität von CuZnSOD, MnSOD und Cat in GKEZ (EZ) und AZ in Monokultur (leere Balken) und Kokultur ohne morphologischen Kontakt (EZc, AZc; schraffierte Balken). MW+SD. CuZnSOD/MnSOD n=10; Cat n=6. ***p<0,001, **p<0,01 im Vergleich zu EZ; ### p<0,001 im Vergleich zu AZ (Mann-Whitney Rangsummentest).

Um den spezifischen Gehalt von GKEZ sowie der verschiedenen Glia-Zelltypen an MnSOD-Enzymprotein zu bestimmen, wurden Kulturen aus GKEZ bzw. primären AZ immunozytochemisch untersucht (Kolokalisation von MnSOD mit jeweiligen Zellmarkern ILB4, Mikroglia; GFAP, Astroglia; O4, Oligodendroglia; Daten nicht gezeigt). Die MnSOD-Immunoreaktivität war am stärksten in Mikroglia, gefolgt von Astroglia, ausgeprägt. In Oligodendrozyten wurde nur eine geringe Signalintensität beobachtet. Im Zytoplasma der AZ waren gleichmäßig verteilte, ca. 1,6 mm große elliptiforme Strukturen sichtbar, die in Lokalisation und Größe höchstwahrscheinlich MnSOD-positive Mitochondrien darstellten (Abb. 3.4; 1C). In monokultivierten GKEZ wurde ein schwaches Signal erhalten; Mitochondrien waren nicht

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3.3. Antioxidative Enzyme und Substanzen in Kokultur

Wenn GKEZ und AZ kokultiviert wurden (Kokultur ohne morphologischen Kontakt), kam es zu einer signifikanten Aktivitätserhöhung der antioxidativ wirkenden Enzyme, verglichen mit den entsprechenden Monokulturen (Abb. 3.1 und 3.2). Eine Ausnahme bildete Cat in AZ, die in ihrer Aktivität nicht signifikant verändert war (nur leichte Erhöhung in kokultivierten AZ auf 128+28% der Aktivität in monokultivierten AZ). In AZ waren die Aktivitäten von CuZnSOD und GPx auf 203+9% und 231+22%, in GKEZ die Aktivitäten von CuZnSOD, Cat und GPx auf 128+10%, 219+90% bzw. 199+40% im Vergleich zur entsprechenden Monokultur gestiegen. Für MnSOD wurden die größten Aktivitätserhöhungen gefunden: In AZ ein Anstieg auf 698+193%, in GKEZ auf 993+196% der Aktivität der Monokultur.

Abb. 3.2 Gehalt an GSH und GSSG sowie Aktivität von GPx in GKEZ (EZ) und AZ in Monokultur (leere Balken) und Kokultur ohne morphologischen Kontakt (EZc, AZc; schraffierte Balken). MW+SD. GSH/GPx n=10; GSSG n=6. ***p<0,001, **p<0,01 im Vergleich zu EZ; ### p<0,001 im Vergleich zu AZ (Mann-Whitney Rangsummentest). ‘nd’ bedeutet ‘nicht detektierbar’.

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Die Kokultivierung führte zu einer Zunahme der MnSOD-Immunoreaktivität sowohl in GKEZ als auch in AZ (Abb. 3.4). Hierbei konnte neben der Kokultur mit ausschließlich humoralem Kontakt (2A und 2B) auch jene Kokultur untersucht werden, bei der GKEZ und AZ in direktem morphologischen Kontakt standen (3A bis C). Die Immunoreaktivität nahm in GKEZ deutlich unter Kokultivierung zu, wobei die Kokultur mit morphologischem Kontakt die stärkste Signalintensität zeigte (3A und 3B). In der Kokultur mit ausschließlich humoralem Kontakt variierte die Immunoreaktivität zwischen den einzelnen GKEZ; in ca. jeder zehnten Zelle waren zahlreiche mitochondrienartige Strukturen sichtbar (2A und 2B). Auch in AZ kam es zu einer Zunahme der MnSOD-Immunoreaktivität durch Kokultivierung (1C und 3C). Unspezifische Hintergundfärbung durch den sekundären, Cy3-markierten Antikörper war nicht vorhanden. Kolokalisationsuntersuchungen von MnSOD mit GFAP (Abb. 3.3; Anhang) zeigten, daß in der Kokultur mit morphologischem Kontakt ein Teil der MnSOD-Immunoreaktivität auf der Seite der GKEZ mit GFAP koinzidierte und, folglich, auf die die Filter permeierenden AZ-Endfüsse zurückzuführen sein könnte.

In beiden Kokultur-Modellen wurde auch der Gehalt von MnSOD-mRNA im Vergleich mit den entsprechenden Monokulturen mittels RT-PCR untersucht (Abb. 3.5). Kokultivierung mit AZ führte bei GKEZ zu einer deutlichen, für MnSOD-mRNA spezifischen Bande. In AZ kam es zu keiner wesentlichen Veränderung im Gehalt an MnSOD-mRNA durch Kokultivierung mit GKEZ.

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Abb. 3.4 MnSOD-Immunoreaktivität in GKEZ und AZ in Mono- und Kokultur (Markierung mit Cy3; konfokale Laser-Scan-Mikroskopie). GKEZ in (A) transversaler Ebene, (B) sagittaler Ebene. (C) AZ in sagittaler Ebene. (1) Monokultur von GKEZ bzw. AZ. (2) und (3) Kokultur von GKEZ mit AZ; in (2) ohne, in (3) mit morphologischem Kontakt. (F) Filter zwischen GKEZ und AZ. (Co) Kontrolle.

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Abb. 3.5 Gehalt an MnSOD-mRNA in GKEZ (EZ) und AZ in Monokultur bzw. Kokultur (EZc, AZc). ß-Actin als endogener, externer Standard. Repräsentatives Beispiel von jeweils 4 unabhängigen Experimenten.

3.3.1. Signaltransduktion in Kokultur - Zytokine und Wachstumsfaktoren

Die Erhöhung des antioxidativen Potentials in kokultivierten GKEZ und AZ könnte durch Zytokine und Wachstumsfaktoren als Mediatoren vermittelt sein. Deshalb wurden beide Zelltypen mit IL-1ß/TNF-a (Tab. 3.2) sowie bFGF/ECGF (Tab. 3.3) über mehrere Tage inkubiert und die Aktivitäten von MnSOD, CuZnSOD und GPx bestimmt. IL-1ß und TNF-a veränderten in AZ die Aktivität von GPx kaum. Dasselbe traf für die MnSOD-Aktivität nach Inkubation mit IL-1ß zu. Die CuZnSOD-Aktivität wurde unter IL-1ß und TNF-a etwas vermindert (auf 95% bzw. 80%). Eine starke Erhöhung der MnSOD-Aktivität auf 195% der Kontrolle wurde nach der Inkubation mit TNF-a gefunden.

Tab. 3.2 Aktivitäten von MnSOD, CuZnSOD und GPx in Prozent der Kontrolle (=100%) nach Inkubation von AZ mit IL-1ß/TNF-a (2 ng/ml bzw. 1,7 ng/ml). MW+SD.

Zelltyp	t	n	Enzym	Kontrolle	IL-1ß	TNF-a
AZ	2 d	2	MnSOD	100%	113%	195%
			CuZnSOD	100%	95%	80%
			GPx	100%	97%	102%

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Tab. 3.3 Aktivitäten von MnSOD, CuZnSOD und GPx in Prozent der Kontrolle (=100%) nach Inkubation von GKEZ und AZ mit bFGF/ECGF (10 ng/ml bzw. 20 mg/ml). MW+SD. *p<0,05 im Vergleich zur Kontrolle; One Way ANOVA gefolgt von Student-Newman-Keuls Test.

Zelltyp	t	n	Enzym	Kontrolle	bFGF	ECGF
GKEZ	3 d	4	MnSOD	100+14% (n=3)	112+8%	97+16%
			CuZnSOD	100+7%	76+9% *	80+3% *
AZ		2	MnSOD	100%	109%	120%
			CuZnSOD	100%	120%	104%
			GPx	100%	101%	87%

Wie aus Tabelle 3.3 zu entnehmen ist, beeinflußten bFGF und ECGF die Aktivität von GPx sowie CuZnSOD in AZ sowie diejenige von MnSOD in GKEZ kaum. Für MnSOD wurde eine leichte Erhöhung der Aktivität nach Inkubation mit ECGF in AZ gesehen. Die Aktivität von CuZnSOD fiel in GKEZ sowohl nach Inkubation mit bFGF als auch ECGF signifikant ab (auf 76+9 bzw. 80+3% der Kontrolle).

3.4. Antioxidatives Potential während Hypoxie/Reoxygenierung in Monokultur

Zur Einschätzung der antioxidativen Kapazität unter pathologischen Bedingungen wurden GKEZ und AZ nach einer zweistündigen Hypoxie mit Reoxygenierung von 0,5 h bzw. 1 h untersucht und mit normoxischen Inkubatorkontrollen verglichen. Dies erfolgte sowohl mit monokultivierten (Abb. 3.6 und 3.7) als auch mit kokultivierten Zellen (Abb. 3.11 und 3.12). In monokultivierten GKEZ (Abb. 3.6) kam es zu einem Abfall der Aktivitäten von CuZnSOD, Cat, und GPx nach der Hypoxie auf 78+10%, 78+19% bzw. 73+15% der normoxischen Kontrolle (p<0,05 für CuZnSOD und GPx), währenddessen die MnSOD-Aktivität auf 122+21% der Kontrolle anstieg (p<0,05). Nach 0,5 h Reoxygenierung waren die Aktivitäten von CuZnSOD und Cat wieder auf 101+19% bzw. 92+29% der normoxischen Inkubatorkontrolle angestiegen, von der sie sich nicht mehr signifikant unterschieden. Auch die Aktivität der GPx stieg wieder auf 88+13% der Kontrolle an, unterschied sich von der Kontrolle aber noch signifikant (p<0,05). Die MnSOD-Aktivität kehrte nach 0,5 h Reoxygenierung auf das Niveau der Kontrolle zurück (99+7% der Kontrolle). Nach 1 h Reoxygenierung (nicht gezeigt) hatte auch die GPx-Aktivität die Werte der Kontrolle wieder erreicht.

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Abb. 3.6 Aktivitäten von CuZnSOD, MnSOD, Cat und GPx nach 2 h Hypoxie (Hy) gefolgt von 0,5 h Reoxygenierung (Re) im Vergleich zur normoxischen Kontrolle (Co; =100%). GKEZ in Monokultur. MW+SD. n=8. *p<0,05 (Kruskal-Wallis One Way ANOVA on Ranks gefolgt von Student-Newman-Keuls Test).

Abb. 3.7 Aktivitäten von CuZnSOD, MnSOD, Cat und GPx nach 2 h Hypoxie (Hy) gefolgt von 0,5 h Reoxygenierung (Re) im Vergleich zur normoxischen Kontrolle (Co; =100%). AZ in Monokultur. MW+SD. n=8 außer CuZnSOD, Hyp n=6, GPx, Hyp n=4. *p<0,05 (Kruskal-Wallis One Way ANOVA on Ranks mit Student-Newman-Keuls Test).

AZ zeigten sich in Monokultur resistenter gegenüber Hypoxie als GKEZ bezogen auf die Aktivitäten antioxidativer Enzyme (Abb. 3.7). Einzig die Cat-Aktivität war nach Hypoxie auf 79+9% der normoxischen Kontrolle signifikant erniedrigt (p<0,05); CuZnSOD und GPx unterschieden sich in ihrer Aktivität im Vergleich zur Kontrolle nicht signifikant (96+28% bzw.

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3.4.1. Signaltransduktion während Hypoxie/Reoxygenierung

3.4.1.1. Nukleärer Faktor-kB

Da die Promoter-Bindungsregion für MnSOD vier potentielle Bindungsorte für NF-kB enthält (Ergebnis einer Genbankrecherche mit Programm der Genetics Computer Group, GCG, 1996; MnSOD-DNA-Sequenz nach Ho et al., 1991) und NF-kB in seiner Bindungsaktivität durch den Redoxzustand reguliert wird (Müller et al., 1997), wurde die Bindungsaktivität von NF-kB während Hypoxie/Reoxygenierung in GKEZ und AZ untersucht. Dies erbrachte für GKEZ und AZ unterschiedliche Ergebnisse.

Abb. 3.8 Bindungsaktivität von NF-kB in GKEZ nach 2 h Hypoxie gefolgt von 0,5 h Reoxygenierung. Inkubation mit IL-1ß als Positivkontrolle.

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Abb. 3.9 Bindungsaktivität von NF-kB in AZ nach 2 h Hypoxie gefolgt von 0,5 h Reoxygenierung.

In AZ (Abb. 3.9) kam es in der hypoxischen Probe nach 2 h zu einer Abnahme der Bindungsaktivität im Vergleich zur normoxischen Kontrolle (Bahn 2 und 1). Nach 0,5 h Reoxygenierung hatte die Bindungsaktivität wieder das Niveau der normoxischen Kontrolle erreicht und leicht überschritten (Bahn 4 und 3). Die Kontrollen unter Zugabe von spezifisch NF-kB-

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Die densitometrische Auswertung der in bezug auf die Bindungsaktivität von NF-kB während Hypoxie/Reoxygenierung durchgeführten Experimente ist in Abbildung 3.10 dargestellt. GKEZ und AZ verhielten sich in Hypoxie bzw. Reoxygenierung unterschiedlich. In GKEZ kam es zu einem starken Anstieg der Bindungsaktivität von NF-kB nach 0,5 h Reoxygenierung auf 576% der entsprechenden normoxischen Kontrolle (=100%). Nach 2 h Hypoxie bzw. Hypoxie mit 1 h Reoxygenierung war keine auffällige Differenz zwischen Kontrolle und Probe beobachtbar. Bei AZ kam es zu einem Abfall der Bindungsaktivität von NF-kB nach 2 h Hypoxie auf 59% der entsprechenden normoxischen Kontrolle (=100%). Nach 2 h Hypoxie mit 0,5 h Reoxygenierung unterschieden sich Probe und Kontrolle nicht.

Zur Überprüfung der Frage, ob NF-kB die Erhöhung der MnSOD-Aktivität während der Hypoxie vermittelt, wurde Pyrrolidin-Dithiocarbamat, ein Inhibitor der Aktivierung von NF-kB (Ferran et al., 1995), eingesetzt. Pyrrolidin-Dithiocarbamat hatte keinen signifikanten Einfluß auf den Anstieg der Aktivität von MnSOD in der Hypoxie, weder in GKEZ noch AZ.

Abb. 3.10 Bindungsaktivität von NF-kB in monokultivierten GKEZ und AZ nach 2 h Hypoxie (Hyp) gefolgt von 0,5 bzw. 1 h Reoxygenierung (Re) im Vergleich zur entsprechenden normoxischen Kontrolle (=100%; Co). n=2; bis auf GKEZ 2 h Co n=4, 2 h Hyp n=3; AZ 2,5 h Co und +0,5 h Re n=1.

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3.4.1.2. Zytokine

Da die MnSOD-Aktivität auf Grund autokriner Regulation durch die Zellen nach Hypoxie erhöht worden sein könnte, wurden GKEZ und AZ mit IL-1ß sowie TNF-a, bekannten Aktivatoren der MnSOD (Wong und Goeddel, 1988), über 2 bis 6 h inkubiert und die Aktivität der MnSOD gemessen. In Tabelle 3.4 sind die Ergebnisse dieser Experimente dargestellt. Bereits nach 2 h zeichnete sich eine Erhöhung der MnSOD-Aktivität in beiden Zelltypen ab, die jedoch in den GKEZ (auf 149+31%) stärker als in den AZ (auf 124%; jeweils in bezug auf Kontrolle) ausgeprägt war. Der Anstieg der MnSOD-Aktivität hielt in den GKEZ nach 6 h an (auf 173+52%), während sich in den AZ die MnSOD-Aktivität stabilisierte (auf 121%). Im Resultat sind die Zytokine IL-1ß und TNF-a in GKEZ und AZ in der Lage, die Aktivität von MnSOD innerhalb von 2 bis 6 h zu erhöhen.

Tab. 3.4 MnSOD-Aktivität in GKEZ und AZ nach Inkubation mit IL-1ß/TNF-a (2 ng/ml bzw. 1,7 ng/ml). Angabe in Prozent der Kontrolle (=100%). MW+SD. *p<0,05 im Vergleich zur Kontrolle; Student-t-Test.

Zelltyp	t	n	Enzym	Kontrolle	IL-1ß+TNF-a
GKEZ	2 h	4	MnSOD	100+28%	149+31%
	6 h				173+52% *
AZ	2 h	2	MnSOD	100%	124%
	6 h				121%

3.5. Antioxidatives Potential während Hypoxie/Reoxygenierung in Kokultur

Die antioxidative Kapazität wurde neben Monokulturen ebenso in Kokulturen (ohne morphologischen Kontakt zwischen GKEZ und AZ) während Hypoxie/Reoxygenierung untersucht (Abb. 3.11 und 3.12). Hierbei zeigte sich, daß sich die Aktivitäten antioxidativ wirksamer Enzyme nach 2 h Hypoxie in Kokultur im Vergleich zu den jeweiligen Monokulturen weniger veränderten. Wie aus Abbildung 3.11 hervorgeht, kam es in kokultivierten GKEZ im Gegensatz zu den Ergebnissen in der Monokultur zu keiner signifikanten Abnahme der Enzymaktivitäten nach 2 h Hypoxie. Die Aktivitäten von CuZnSOD, Cat und GPx betrugen 102+6%, 90+23% bzw. 99+20% der Werte in der normoxischen Kontrolle. Der bei monokultivierten GKEZ gefundene Anstieg der MnSOD-Aktivität nach 2 h Hypoxie (Abb. 3.6) wurde

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Abb. 3.11 Aktivitäten von CuZnSOD, MnSOD, Cat und GPx nach 2 h Hypoxie (Hy) gefolgt von 0,5 h Reoxygenierung (Re) im Vergleich zur normoxischen Kontrolle (Co; =100%). GKEZ, in Kokultur mit AZ ohne morphologischen Kontakt. MW+SD. n=8. *p<0,05 (Kruskal-Wallis One Way ANOVA on Ranks gefolgt von Student-Newman-Keuls Test).

in Kokultur nicht beobachtet; nach Hypoxie unterschied sich die MnSOD-Aktivität nicht signifikant von der normoxischen Kontrolle (95+13% der Kontrolle). Nach 0,5 h Reoxygenierung waren die Enzymaktivitäten im Vergleich mit der jeweiligen Kontrolle erniedrigt (CuZnSOD auf 92+3%, MnSOD auf 87+13%, Cat auf 71+25%, GPx auf 81+9%), was jedoch nur im Falle der CuZnSOD signifikant war (p<0,05).

In kokultivierten AZ (Abb. 3.12) wurde nach 2 h Hypoxie ein Abfall der Aktivitäten von CuZnSOD und MnSOD auf 90+6% bzw. 79+10% der normoxischen Kontrollen beobachtet (p<0,05 in beiden Fällen). Die Aktivitäten von Cat und GPx veränderten sich in kokultivierten AZ nach Hypoxie nicht signifikant (104+20% und 99+3% im Vergleich zur Kontrolle). Der in monokultivierten hypoxischen AZ gefundene Anstieg der MnSOD-Aktivität (Abb. 3.7) war demnach, wie bereits in GKEZ beobachtet, in AZ in Kokultur nicht zu finden. Nach 0,5 h Reoxygenierung waren die Aktivitäten von CuZnSOD, MnSOD und Cat auf 92+4%, 70+15% bzw. 62+13% der Kontrolle erniedrigt (p<0,05 für alle drei Enzyme). GPx unterschied sich in der Aktivität von der Kontrolle nicht signifikant (95+6% der Kontrolle).

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Abb. 3.12 Aktivitäten von CuZnSOD, MnSOD, Cat und GPx nach 2 h Hypoxie (Hy) gefolgt von 0,5 h Reoxygenierung (Re) im Vergleich zur normoxischen Kontrolle (Co; =100%). AZ, in Kokultur mit GKEZ ohne morphologischen Kontakt. MW+SD. n=8. *p<0,05 (Kruskal-Wallis One Way ANOVA on Ranks gefolgt von Student-Newman-Keuls Test).

3.6. Lipidperoxidation während Hypoxie/Reoxygenierung in Monokultur

Um ein Maß für die Generierung freier Radikale sowie die daraus folgenden Membranschäden zu erhalten, wurde die radikalinduzierte Lipidperoxidation während Hypoxie und Reoxygenierung als Gehalt an Malondialdehyd erfaßt. Diese ist im Vergleich zwischen GKEZ und AZ, sowohl in Mono- als auch in Kokultur mit ausschließlich humoralem Kontakt in Abbildung 3.13 dargestellt.

In monokultivierten AZ war der Malondialdehyd-Gehalt signifikant höher als in monokultivierten GKEZ (in AZ 354+48% des Gehaltes von GKEZ; p=0,002 im Mann-Whitney Rangsummentest), jeweils unter Kontrollbedingungen. Nach 2 h Hypoxie mit 1 h Reoxygenierung stieg der Malondialdehyd-Gehalt in GKEZ auf 218+82% der normoxischen Kontrolle an (p<0,01), währenddessen in AZ unter diesen Bedingungen nur ein leichter Anstieg auf 135+10% der Kontrolle zu verzeichnen war (p<0,01). Die Werte nach alleiniger Hypoxie bzw. Hypoxie mit 0,5 h Reoxygenierung sind nicht dargestellt, da hier keine signifikante Erhöhung im Vergleich zur normoxischen Kontrolle vorhanden war. Folglich nahmen der Gehalt an Malondialdehyd und mithin die Lipidperoxidation im besonderen in der Reoxygenierungsperiode zwischen 0,5 und 1 h nach der Hypoxie zu.

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Abb. 3.13 Gehalt an Malondialdehyd (MDA) in GKEZ und AZ nach 2 h Hypoxie gefolgt von 1 h Reoxygenierung im Vergleich zur normoxischen Kontrolle. Monokultur und Kokultur (ohne morphologischen Kontakt). MW+SD. n=6. **p<0,01 im Vergleich zur Kontrolle, Monokultur; # p<0,05 im Vergleich zur Kontrolle, Kokultur (Mann-Whitney Rangsummentest).

3.7. Lipidperoxidation während Hypoxie/Reoxygenierung in Kokultur

In Kokultur war ein höherer Gehalt an Malondialdehyd sowohl in GKEZ als auch in AZ im Vergleich zur jeweiligen Monokultur beobachtbar: In GKEZ kam es zu einer Erhöhung auf 243+81% der Monokultur (p<0,01); in AZ war die Zunahme im Malondialdehyd-Gehalt geringer (auf 165+25% der Werte in Monokultur, p<0,01). Dabei unterschied sich der Malondialdehyd-Gehalt in kokultivierten GKEZ und AZ signifikant (p=0,002 im Mann-Whitney Rangsummentest) und betrug in AZ 240+37% der Menge in GKEZ (=100%). Hypoxie mit Reoxygenierung von 1 h führte in kokultivierten Zellen zu einem leichten Anstieg des Malondialdehyd-Gehaltes in GKEZ und AZ (auf 121+13% bzw. 118+7% der entsprechenden normoxischen Kontrolle; p<0,05 im Falle der AZ, nicht signifikant für GKEZ). Wie bereits in der Monokultur beobachtet, veränderten sich die Malondialdehyd-Werte nach isolierter Hypoxie bzw. Hypoxie mit 0,5 h Reoxygenierung nicht signifikant (Werte nicht gezeigt).

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3.8. GFAP-Immunoreaktivität von Astrozyten in Mono- und Kokultur

Mit Hilfe indirekter Immunozytochemie wurde die Immunoreaktivität von GFAP (spezifischer Marker für AZ) in mono- bzw. kokultivierten AZ untersucht (Abb. 3.14). Hierbei sollte die Frage geklärt werden, ob Ausläufer der AZ die Filter bis zur Seite der GKEZ durchdringen können, wenn die AZ auf der unteren Seite des Filters kultiviert werden.

Abb. 3.14 GFAP-Immunoreaktivität in AZ im Vergleich zwischen (A) Monokultur und (B) Kokultur mit GKEZ (AZ und GKEZ auf gegenüberliegenden Seiten des Filters). Markierung mit Cy2. Konfokale Laser-Scan-Mikroskopie. Monokultur: 16 Aufnahmen alle 3,75 mm (56,25 mm erfaßt). Kokultur: 25 Aufnahmen alle 1,6 mm (38,4 mm erfaßt).

Bereits bei auf Filtern monokultivierten AZ (Abb. 3.14A) war GFAP-Immunoreaktivität nicht nur auf der Seite der ursprünglichen Aussaat (Schnittiefe 15 mm) sondern ebenso auf der entgegengesetzten Seite des Filters nachweisbar (Schnittiefe 26,25-30 mm). Folglich muß davon ausgegangen werden, daß Ausläufer der AZ durch die Filter (Porengröße 0,4 mm) hindurchgewachsen waren. In Kokultur (Abb. 3.14B) konnte dasselbe Phänomen beobachtet werden; sowohl auf der Seite der AZ (Schnittiefe 16-22,4 mm) als auch auf derjenigen der GKEZ (Schnittiefe 4,8-6,4 mm) war GFAP-Immunoreaktivität nachweisbar. In Kokultur besaßen die

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3.9. Parazelluläre Permeabilität nach Hypoxie/Reoxygenierung - Einfluß von Superoxiddismutase

Die Fluoreszein-Permeabilität wurde nach Hypoxie/Reoxygenierung bestimmt und mit der normoxischen Inkubator-Kontrolle verglichen (Abb. 3.15). Um den Einfluß von ROS auf die Permeabilität zu überprüfen, wurde SOD während der Hypoxie/Reoxygenierung in die Inkubationslösung gegeben (beidseits des Filters; Aktivitätskonzentration = 50 U/ml). GKEZ wurden vor Beginn der Inkubation in PBS mit AZ kokultiviert (Kokultur ohne morphologischen Kontakt). Der Permeabilitätskoeffizient von Fluoreszein betrug vor jeglicher Behandlung 0,8-2^.10^-3 cm^.min^-1 (=100%). Nach 1 h Hypoxie mit 0,5 h Reoxygenierung kam es zu einer starken Erhöhung der Permeabilität (auf 511+201%). Die Permeabilität unterschied sich dabei von der normoxischen Kontrolle signifikant (p=0,002). In der normoxischen Kontrolle (1,5 h in PBS) war die Permeabilität im Vergleich zu den Werten vor jeglicher Behandlung leicht erhöht (auf 132+20%); die Zugabe von SOD führte zu keiner signifikanten Veränderung der Permeabilität (123+23%). Die Zugabe von SOD während der Hypoxie/Reoxygenierung hatte einen protektiven Effekt auf die GKEZ: Der nach Hypoxie/Reoxygenierung beobachtete Anstieg der Permeabilität wurde signifikant reduziert (auf 184+49%, p=0,005). Diese Wirkung von SOD läßt auf eine Beteiligung von ^.O₂^- an der Erhöhung der Permeabilität nach Hypoxie/Reoxygenierung schließen.

3.10. Aktivität antioxidativer Enzyme und Lipidperoxidation in vivo

Um einen Anhalt für das antioxidative Potential in vivo zu erhalten, wurden im Gehirnhomogenat von Ratten die Aktivitäten antioxidativer Enzyme sowie die Lipidperoxidation be

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Abb. 3.15 Fluoreszein-Permeabilität durch GKEZ nach 1 h Hypoxie mit Reoxygenierung von 0,5 h (Hyp/Reox) im Vergleich zur normoxischen Behandlung (Normoxie), jeweils ohne bzw. mit SOD. Angaben im Vergleich zur Kontrolle (=100%). MW+SD. n=5 für Normoxie+SOD; n=8 für Hyp/Reox; n=6 für Hyp/Reox+SOD. **p<0,01 im Vergleich zu Normoxie; ## p<0,01 im Vergleich zu Hyp/Reox (Mann-Whitney Rangsummentest).

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