Identifikation des Glykosylphosphatidylinositol-verankerten Heparan Sulfat Proteoglykans Glypikan als Toxizitäts-vermittelndem Rezeptor für -Amyloid der Alzheimer’schen Krankheit in der neuronalen PC12 Zellinie

zur Erlangung des akademischen Grades doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Humboldt-Universität zu Berlin

von Herrn Joachim Günther Schulz ,
geboren am 12. Mai 1968 in Neckarsulm

Dekan: Prof. Dr. med. M. Dietel

Gutachter:
1. Prof. Dr. K. M. Einhäupl
2. Prof. Dr. Dr. F. A. Henn
3. Prof. Dr. Dr. h.c. K. Beyreuther

eingereicht: Oktober 1997

Datum der Promotion: 2. April 1998

Man soll jedoch nicht nur den Körper stärken, sondern

noch viel mehr die Denkkraft, den Geist. Denn auch

die Geisteskräfte schwinden im hohen Alter, falls man

nicht, wie bei einer Lampe, Öl nachträufelt. Körperlich

wird man durch laufende Überanstrengung

schwerfällig, der Geist aber wird nur dadurch frisch

erhalten, daß man ihn betätigt.

Cicero, Cato der Ältere über das Alter

Schlagwörter:
Alzheimer, Glypikan, PC12, , Amyloid

Keywords:
Alzheimer, Glypican, PC12,, -amyloid

Zusammenfassung

In der vorliegenden Arbeit konnte mit der PC12 Zellinie und dem MTT Viabilitätsassay Glypikan, ein Glykosylphosphatidylinositol-verankertes Heparan Sulfat, als Rezeptor identifiziert werden, der die toxischen Effekte von -Amyloid vermittelt. Kompetitive Substanzen im Medium, enzymatische Behandlung der Zelloberfläche und Block spezifischer zellulärer Synthesewege wurden eingesetzt.

-Amyloid wird eine zentrale Rolle in der Pathogenese der Alzheimer’schen Krankheit zugeschrieben. Eine Intervention auf Ebene der -Amyloid-Rezeptor Interaktion könnte einen Therapieansatz für die Alzheimer’sche Krankheit darstellen. Weitere Experimente sind notwendig, um die Rolle von Glypikan bei der Vermittlung der -Amyloid Toxizität im Alzheimer-Gehirn zu untersuchen, z.B. in der Primärkultur von Neuronen und Mikroglia oder im lebenden Hirnschnitt.

Eine ähnliche anatomische Verteilung der Glypikanexpression im Rattenhirn und der neurofibrillären Bündel im Alzheimergehirn wurde gefunden. Eine mögliche Rolle für Glypikan bei der Entstehung der neurofibrillären Bündel muß im Autopsiegehirn von Alzheimerpatienten überprüft werden.

Abstract

-amyloid is thought to play a major role in the pathogenesis of Alzheimer’s disease. In PC12 cell culture, competitive substances in cell culture medium, enzymatic cell surface treatment und block of specific cell synthesis pathways were used to identify glypican, a GPI- anchored heparan sulfate proteoglycan, as a receptor that mediates the toxic effects of -amyloid.

Inhaltsverzeichnis
Titelseite	Identifikation des Glykosylphosphatidylinositol-verankerten Heparan Sulfat Proteoglykans Glypikan als Toxizitäts-vermittelndem Rezeptor für -Amyloid der Alzheimer’schen Krankheit in der neuronalen PC12 Zellinie
Widmung
Danksagung
Selbständigkeitserklärung
Abkürzungsverzeichnis	Abkürzungen
1	Einleitung
1.1.	Alzheimer’sche Krankheit
1.1.1.	-Amyloid Vorläufer Protein und -Peptid
1.1.2.	-Amyloid Toxizität
1.2.	Biologie von Heparan Sulfat bei der AK
1.3.	Biologie der Glykosylphosphatidylinositol-verankerten Proteine
2	Herleitung einer Aufgabenstellung
3	Material und Methoden
3.1.	Material
3.2.	Zellkultur
3.3.	Meßprinzip
3.4.	-Amyloid Behandlung
3.5.	Kompetitionstudien
3.6.	Vorbehandlung der Zelloberfläche
3.7.	Manipulation spezischer Zellsynthesewege
3.8.	Statistik
4	Ergebnisse
4.1.	Evaluierung des Systems
4.2.	Kompetition zwischen PC12 Zellen und zellulären Membranen um A
4.3.	Kompetition um -Amyloid zwischen PC12 Zellen und Kohlenhydraten im Medium
4.4.	Sulfatierung der PC12 Zelle und -Amyloid Toxizität
4.5.	Kohlenhydrate der PC12 Zelle und -Amyloid Toxizität
4.6.	Membranverankerung des PC12 Rezeptors für -Amyloid
5	Diskussion
5.1.	Relevanz der Entdeckung
5.2.	Einordnung in die Biologie verschiedener Heparan Sulfate
5.3.	Einordnung in die Pathologie der Alzheimer’schen Krankheit
5.4.	Einordnung in Daten der in vitro -Amyloid Toxizität
5.5.	Modell der Pathogenese der Alzheimer’schen Krankheit
6	Zusammenfassung und Ausblick
Bibliographie A	7. Literatur
Anhang A	Publikationsliste
Lebenslauf

Tabellenverzeichnis
Tabelle 1:	Übersicht der Substanzen, die ins Medium gegeben wurden, um A zu binden. Angegeben sind die Dosen, die ungefähr einen halbmaximalen Block von 20 Stunden 100nM A Toxizität erzielten. Der Schwefelanteil bezieht sich auf die Angaben des Herstellers.
Tabelle 2:	Übersicht der verankernden Monosaccharide der verschiedenen Glykosylierungsformen.
Tabelle 3:	Vergleich der Expression von Glypikan im ZNS der Ratte mit der Lokalisation von NFB im Alzheimer-Gehirn. (Modifiziert, nach Litwack et al., 1994
Tabelle 4:	Übersicht der Studien über eine Lokalisation von GAG im Alzheimer-Gehirn. DS, Dermatan Sulfat; CS, Chondroitin Sulfat; KS, Keratan Sulfat; HS, Heparan Sulfat; HSPG, Heparan Sulfat Proteoglykan; n.u., nicht untersucht; N, Neuron; O, Oligodendrozyt; G, Glia; PK, Perlekan; Ak, Antikörper.

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1:	Schema von AVP mit möglichen Bindungsstellen. Gezeigt ist die Maximalvariante mit 19 Exonen und 770 Aminosäuren. Das Anheften der Chondroitin Sulfat Seitenkette kommt nur bei Fehlen von Exon 15 zustande
Abb. 2:	Schema der -Peptid Region von AVP mit dominant vererbten Alzheimer Mutationen und Enzymschnittstellen.
Abb. 3:	Schema des repetitiven Disaccharidaufbaus der fünf GAG (modifiziert, nach Hardingham und Fosang, 1992
Abb. 4:	Schema des Grundgerüsts eines GPI-verankerten Proteins. FS, Fettsäure; Ino, Inositol.
Abb. 4:	PC12 Zellen in Kultur
Abb. 5:	Reduktion von MTT zu Formazan.
Abb. 6:	Elektronenmikroskopischer Nachweis derA Fibrillen. 350µM A wurde mit 2% Uranylazetat für 15 Minuten negativ kontrastiert, getrocknet und im Transmissionselektronenmikroskop 60000-fach vergrößert (Balken entspricht 100nm).
Abb. 7:	Abhängigkeit der Reduktion von 0,5mg/ml MTT von der Zelldichte. Die Daten stammen von einem einzelnen Experiment in Vierfachbestimmung.
Abb. 8:	Zeitverlauf der Reduktion von 0,5mg/ml MTT durch 100 PC12 Zellen/µl. Die Daten stammen von einem einzelnen Experiment in Vierfachbestimmung.
Abb. 9:	A Dosisabhängigkeit von 4 Stunden MTT Reduktion durch 100 PC12 Zellen/µl. Die Zellen wurden 20 Stunden mit A vorinkubiert. Für alle Datenpunkte wurden mindestens drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt (* für p<0,05; ** für p<0,01: gepaarter t-Test).
Abb. 10:	Effekt von 20h Vorinkubation mit 10µM A oderP auf die MTT Reduktion von 100 PC12 Zellen/µl. Für A wurden zwei, für P drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt (* für p<0,05: gepaarter t-Test).
Abb. 11	a: 40-fache Vergrößerung von PC12 nach 20 Stunden Vorinkubation ohne A und danch anderthalbstündiger Stunde MTT-Reduktion.
Abb.11	b: 40-fache Vergrößerung von PC12 Zellen nach 20 Stunden Vorinkubation mit 1µM A und danach anderthalbstündiger MTT-Reduktion.
Abb. 12:	Abhängigkeit der Toxizität von 100nM A von der Zelldichte. Für alle Datenpunkte wurden mindestens drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt.
Abb. 13:	Zeitverlauf der Toxizität von 1µM A. Die Datenpunkte beziehen sich auf ein Experiment mit Vierfachbestimmungen und entsprechen dem prozentualen Anteil an der 24 Stunden Toxizität.
Abb. 14:	H2O2-Dosisabhängigkeit von 4 Stunden MTT Reduktion durch 100 PC12 Zellen/µl. Die Zellen wurden 20 Stunden mit H2O2 vorinkubiert. Für alle Datenpunkte wurden mindestens drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt (* für p<0,05; ** für p<0,01: gepaarter t-Test).
Abb. 15:	Dosisabhängiger Block der Toxizität von A durch vorherige Zugabe von Rattenhirnsynaptosomen ins Medium von 100 PC12 Zellen/µl. Für alle Datenpunkte wurden mindestens drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt (* für p<0,05; ** für p<0,01: gepaarter t-Test).
Abb. 16:	Block der Toxizität von A durch vorherige Zugabe der nach Folch preparierten Protein- (Prot) bzw. Lipidbestandteile (NLip=Glykolipide mit vier Sacchariden, Phospholipide und neutrale Lipide; CLip=Neutrale Lipide mit vier und mehr Sacchariden und Ganglioside) von Rattenhirnsynaptosomen (Syn; 600ng/µl) ins Medium. Für alle Datenpunkte wurden mindestens drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt (* für p<0,05; ** für p<0,01: gepaarter t-Test).
Abb. 17:	Block der Toxizität von A durch vorherige Zugabe der nach Folch preparierten Protein-(Prot) bzw. Lipidbestandteile (Lip) von PC12 Zellmembranen (PCMem; 3300 Zellen/µl) ins Medium. Für alle Datenpunkte wurden mindestens drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt (* für p<0,05; ** für p<0,01: gepaarter t-Test).
Abb. 18:	Beständigkeit der A-Bindungsfähigkeit von Synaptomen (Syn) gegen Hitze (Syn+Hitze; 90oC, 10 Minuten) oder Hitze und Proteolyse (Syn+PK; 1mg/ml Proteinase K). Nach der Behandlung der Synaptosomen wurde Proteinase K inaktiviert, die Synaptosomen ins Medium gegeben und die A Toxizität bestimmt. Für alle Datenpunkte wurden mindestens drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt (* für p<0,05; ** für p<0,01: gepaarter t-Test).
Abb. 19:	Freisetzung löslicher A-bindender Bestandteile aus Synaptosomen durch Proteolyse. Synaptosomen wurden mit Proteinase K (1mg/ml) inkubiert, die Proteinase inaktiviert, die Synaptosomenbestandteile durch Zentrifugation getrennt, ins Medium gegeben, und die A Toxizität bestimmt. Pe, zentrifugierbare Synaptosomenbestandteile nach 0 Stunden Inkubation mit Proteinase K; PK-Pe, zentrifugierbare Synaptosomenbestandteile nach 4 Stunden Inkubation mit Proteinase K; Sol, lösliche Synaptosomenbestandteile nach 0 Stunden Inkubation mit Proteinase K; PK-Sol, lösliche Synaptosomenbestandteile nach 4 Stunden Inkubation mit Proteinase K. Für alle Datenpunkte wurden mindestens drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt (* für p<0,05; ** für p<0,01 bezüglich der jeweils unbehandelten Fraktion: gepaarter t-Test).
Abb. 20:	Dosis-Wirkungskurve von Liposomen (36% Phosphatidylcholin, 36% Phosphatidylethanolamine, 10% Phosphatidylserin und 18% Cholesterin) auf die PC12 Zellviabilität ohne (geschlossener Kreis) oder mit (offener Kreis) 100nM A. Die Datenpunkte entsprechen Werten aus Vierfachbestimmungen in einem einzelnen Experiment.
Abb. 21:	Dosis-Wirkungskurve von Heparin im Medium auf die PC12 Toxizität vonA. Für alle Datenpunkte wurden mindestens drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt (* für p<0,05; ** für p<0,01: gepaarter t-Test).
Abb. 22:	Dosis-Wirkungskurve von Heparan Sulfat im Medium auf die PC12 Toxizität von A. Für alle Datenpunkte wurden mindestens drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt (* für p<0,05; ** für p<0,01: gepaarter t-Test).
Abb. 23:	Dosis-Wirkungskurve von Chondroitin Sulfat im Medium auf die PC12 Toxizität von A. Für alle Datenpunkte wurden mindestens drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt (* für p<0,05; ** für p<0,01: gepaarter t-Test).
Abb. 24:	Dosis-Wirkungskurve von Keratan Sulfat im Medium auf die PC12 Toxizität von A. Für alle Datenpunkte wurden mindestens drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt (* für p<0,05; ** für p<0,01: gepaarter t-Test).
Abb. 25:	Dosis-Wirkungskurve von Hyaluronsäure im Medium auf die PC12 Toxizität von A. Für alle Datenpunkte wurden mindestens drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt (* für p<0,05; ** für p<0,01: gepaarter t-Test).
Abb. 26:	Dosis-Wirkungskurve von Polysialinsäure im Medium auf die PC12 Toxizität von A. Für alle Datenpunkte wurden mindestens drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt (* für p<0,05; ** für p<0,01: gepaarter t-Test).
Abb. 27:	Dosis-Wirkungskurve von Protamin im Medium auf die PC12 Toxizität von A. Für alle Datenpunkte wurden mindestens drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt (* für p<0,05; ** für p<0,01: gepaarter t-Test).
Abb. 28:	Wirkung von 10mM Sialinsäure (NANA), Natiumsulfat (SO4), l-Arginin (l-Arg) oder Glukosamin-6-Sulfat (Gln-6-S) im Medium auf die PC12 Toxizität von A. Für alle Datenpunkte wurden mindestens drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt (* für p<0,05: ** für p<0,01; gepaarter t-Test).
Abb. 29:	Wirkung der Hemmung der zellulären Sulfatierung durch Vorinkubation der PC12 Zellen mit Natriumchlorat fur 20 Stunden in den angegebenen Dosen auf die A Toxizität. Für alle Datenpunkte wurden mindestens drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt (* für p<0,05; ** für p<0,01: gepaarter t-Test).
Abb. 30:	Dosis-Wirkungskurve derHemmung der A Toxizität durch Desulfatierung der PC12 Zelloberfläche. Nach Inkubation der PC12 Zellen (1000 Zellen/µl) mit Sulfatase in den angegebenen Dosen wurden die Zellen 1:10 in Medium verdünnt und die A Toxizität gemessen. Für alle Datenpunkte wurden mindestens drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt (* für p<0,05; ** für p<0,01: gepaarter t-Test).
Abb. 31:	Dosis-Wirkungskurve der Hemmung der Toxizität von A durch Hemmung der zellulären Glykosaminoglykan-Glykosylierung durch para-Nitro--D-Xylopyranosid (pNP--Xyl). pNP--Xyl wurde in den angegebenen Dosen für 20 Stunden ins Medium der PC12 Zellen gegeben. Dann wurde die A Toxizität gemessen. Für alle Datenpunkte wurden mindestens drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt (* für p<0,05; ** für p<0,01: gepaarter t-Test).
Abb. 32:	Einfluß verschiedener pNP-Monosaccharide auf die A Toxizität. pNP-Monosaccharide wurden in einer Konzentration von 4mM für 4 Stunden ins Medium der PC12 Zellen gegeben. Dann wurde die A Toxizität gemessen. Für alle Datenpunkte wurden mindestens drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt (* für p<0,05; ** für p<0,01: gepaarter t-Test).
Abb. 33:	Effekt auf die A Toxizität durch: pNP--Xyl Vorinkubation der PC12 Zellen ohne Mediumtausch (Zell+Med), Zellkulturmedium von pNP--Xyl vorinkubierten Zellen auf unbehandelten PC12 Zellen (Med), und Zellkulturmedium von unbehandelten PC12 Zellen auf pNP--Xyl vorinkubierten PC12 Zellen (Zell). pNP--Xyl wurde in einer Konzentration von 4mM für 20 Stunden zu den PC12 Zellen ins Medium gegeben. Dann wurde die entsprechenden Medien ausgetauscht und die A-Toxizität gemessen. Für alle Datenpunkte wurden mindestens drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt (* für p<0,05; ** für p<0,01: gepaarter t-Test).
Abb. 34:	Effekt enzymatischer Abspaltung verschiedener Glykosaminoglykane von der PC12 Zelloberfläche auf die A Toxizität. Nach Inkubation der PC12 Zellen (1000 Zellen/µl) mit Chondroitinase/Dermatanase (C'ase/D'ase, 666mIU/ml), Heparinase (H'ase, 133mIU/ml), oder Keratanase (K'ase, 75mIU/ml) wurden die Zellen 1:10 in Medium verdünnt, und die A Toxizität gemessen. Für alle Datenpunkte wurden mindestens drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt (* für p<0,05; ** für p<0,01: gepaarter t-Test).
Abb. 35:	Effekt der Hemmung der zellulären N-Glykosylierung durch Tunikamyzin (Tun, 1µg/ml) oder enzymatischer Abspaltung N-glykosylierter Kohlenhydrate durch N-Glykanase (N-Gly'ase, 333mIU/ml) von der PC12 Zelloberfläche auf die A Toxizität. Nach Inkubation der PC12 Zellen (100 Zellen/µl) mit Tunikamyzin, oder nach Inkubation der PC12 Zellen (1000 Zellen/µl) mit N-Glykanase und 1:10 Verdünnung in Medium, wurde die A Toxizität gemessen. Für alle Datenpunkte wurden mindestens drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt (* für p<0,05; ** für p<0,01: gepaarter t-Test).
Abb. 36:	Effekt unspezifischer enzymatischer Abspaltung von Protein durch Trypsin (Trp; 60IU/ml, 3000 Zellen/µl) oder spezifischer enzymatischer Abspaltung
Abb. 37:	ApoE mit Bindungsstellen für -Amyloid (), Heparan Sulfat (H), Rezeptor (R), und Lipoprotein (L); Thrombin Schnittstelle (Thr); Polymorphismus (2/4) (Schulz und Einhäupl, 1996
Abb. 38:	Schema der potentiellen Glypikanlokalisation in glykosphingolipidreichen Domänen der Zellmembran
Abb. 39:	Schema der potentiellen Glypikanaktivierung durch A.
Abb. 40:	Schema der durch A-Glypikan Vernetzung potentiell ausgelösten Signal Transduktion. NRTK, Nicht-Rezeptor Tyrosin Kinasen; PKC, Protein Kinase C; DAG, Diazylglyzerol; RAGE; Rezeptor für fortgeschrittene Glykierungsendprodukte; ROS, reaktive Sauerstoff Spezies; NF-B, nukleärer Faktor B.
Abb. 41:	Schema der potentiellen Interaktion einer internalisierten Kaveola mit einem Mikrotubulus. HS, Heparan Sulfat; A, -Amyloid; AVP, Amyloid Vorläuferprotein.
Abb. 42:	Modell der Pathogenese der Alzheimer’schen Krankheit (AK). PS, Präsenilin; NFB, Neurofibrilläre Bündel.

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