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Kapitel 1. Einleitung

1.1. Alzheimer’sche Krankheit

Alois Alzheimer grenzte 1898 die senile Demenz von den gefäßbedingten Demenzformen ab und beschrieb 1906 erstmals einen Fall von präseniler Demenz bei einer 51-jährigen Frau. Der Begriff der Alzheimer’schen Krankheit wurde von Kraepelin 1910 geprägt. Im Jahre 1911 faßte auch Alzheimer präsenile und senile Demenz aufgrund fehlender klinischer oder morphologischer Unterschiede als ein Krankheitsbild zusammen, das seitdem als Alzheimer’sche Krankheit (AK) bezeichnet wird (Alzheimer, 1898 ; Alzheimer, 1906 ).

Die AK ist die häufigste degenerative Erkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS), die häufigste Ursache von Demenz und nach Herzinfarkt, Krebs und Schlaganfall ist die AK die vierthäufigste Todesursache in Ländern mit hoher Lebenserwartung. Die Zahl der Patienten in Deutschland beträgt momentan zirka 800.000, wobei in den nächsten 40 Jahren aufgrund der demographischen Entwicklung eine Steigerung um über 50% erwartet wird. Die Erkrankung ist momentan nicht heilbar und endet nach mehreren Jahren geistigen und später auch körperlichen Zerfalls tödlich, meist im Rahmen einer Pneumonie als Folge der Pflegebedürftigkeit.

In der überwiegenden Mehrzahl der Fälle ist die AK eine komplexe multifaktorielle Erkrankung, bei der mehrere Gene und Umweltfaktoren eine Rolle spielen. Wichtigster Risikofaktor ist das Alter, mit einer Prävalenz-Verdopplungszeit von zirka 5 Jahren: Von den 65-jährigen sind 1% erkrankt, von den 70-jährigen 2%, usw. (Jorm et al., 1987 ). Umstritten ist, ob bei ausreichend langer Lebenszeit jeder betroffen ist (Wernicke und Reischies, 1994 ). Weitere wichtige Risikofaktoren sind positive Familienanamnese für die AK, Trisomie 21, Schädel-Hirn-Trauma, Apolipoprotein \|[epsiv ]\|4 (APO \|[epsiv ]\|4), koronare Herzerkrankung sowie geringe Schulbildung (van Duijn et al., 1991 ; Mortimer et al., 1991 ; Strittmatter et al., 1993 ; Zhang et al., 1990 ; Aronson et al., 1990 ). Wichtige protektive Faktoren sind Langzeitbehandlung mit Östrogenen oder nichtinflammatorischen Antiphlogistika (Henderson et al., 1994 ; Breitner et al., 1994 ).

5-10% aller AK-Fälle werden durch eine autosomal-dominante Mutation eines einzelnen Gens verursacht. Drei Gene, die wahrscheinlich die Mehrzahl dieser nach Mendel’schen Regeln vererbten familiären Alzheimer-Erkrankung ausmachen, sind

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Die klinische Diagnose einer wahrscheinlichen AK stützt sich auf: 1. Vorliegen einer Demenz; 2. Defizite in zwei oder mehr kognitiven Bereichen; 3. zunehmende Verschlechterung des Gedächtnisses und anderer kognitiver Funktionen; 4. klares Bewußtsein; 5. Beginn zwischen 40 und 90 Jahren; 6. Ausschluß anderer Erkrankungen, die einen zunehmenden kognitiven Verfall bewirken könnten. Die wichtigsten kognitiven Fähigkeiten hierbei sind: räumliche und zeitliche Orientierung; Sprache; Rechenfertigkeit; Fähigkeit, praktische Dinge und soziale Aufgaben zu verrichten; visuelle Wahrnehmung und Aufmerksamkeit. Neurologische Symptome wie Myoklonien, Bradykinese und Rigidität, primitive Reflexe (z.B. Palmomentalreflex), Pyramidenbahnzeichen und

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Die Degeneration im Rahmen der AK ist durch den Verlust von Synapsen und neuronalen Zellen in verschiedenen Hirnarealen gekennzeichnet. Betroffen sind vorallem die großen Projektionsneuronen im limbischen Kortex (Hippocampus, Area entorhinalis), limbischen Kerngebieten (Amygdala, Septum, Teile des Thalamus), cholinergen, noradrenergen und serotoninergen Kernen im Vorderhirn und Hirnstamm (Nucleus basalis Meynert, Locus coeruleus, Raphekerne), sowie frontalen, parietalen und temporalen Neokortex (Katzman 1986 ; Mann 1991 ). Der Grad der Demenz korreliert mit dem Verlust von Synapsen im frontalen Kortex (DeKosky und Scheff, 1990 ; Terry et al., 1991 ).

Neben der neuronalen Degeneration sind extra- und intraneuronale Ablagerungen von fibrillärem Material für die pathologische Diagnose der AK definierend. Die intrazellulären Ablagerungen, sogenannte neurofibrilläre Bündel (NFB) (Alzheimer, 1906 ), sind hauptsächlich aus 20nm starken gepaarten helikalen Filamenten (GHF) aufgebaut, die in erster Linie aus dem Mikrotubulus-assoziierten Protein Tau bestehen (Goedert et al., 1988 ; Wischik et al., 1988 ). Tau wird durch ein Zusammenspiel von Kinasen und Phosphatasen phosphoryliert bzw. dephosphoryliert. In den NFB liegt Tau in hyperphosphorylierter Form vor, und kann die Mikrotubuli nicht mehr binden und damit stabilisieren. Obwohl bislang geglaubt wurde, daß die Hyperphosphorylierung von Tau für die Bildung von GHF entscheidend ist, wurde kürzlich gezeigt, daß Heparan Sulfat die Bildung von GHF aus Tau induziert, und Tau dadurch seine Fähigkeit, Mikrotubuli zu binden, verliert, ohne daß Tau hyperphosphoryliert ist (Goedert et al., 1996 ). Tatsächlich ist Heparan Sulfat Bestandteil der NFB im AK-Gehirn und könnte für deren Entstehung verantwortlich sein. Da ein Großteil der Zellen, die im AK-Gehirn absterben, Neurone mit NFB sind, könnte dies entscheidende Bedeutung für die Pathogenese der AK haben. NFB bei der AK scheinen sich nur in einer spezifischen Zellpopulation und in einer vorgegebenen Reihenfolge zu bilden. Die ersten NFB werden in der prä- Schicht des transentorhinalen Kortex gefunden (Braak und Braak, 1991 ). Spezifisch für die AK ist die Ablagerung von

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Die zweite, ebenso definierende aber extrazelluläre Ablagerung im AK-Gehirn sind die senilen Plaques (Redlich, 1898 ). Senile Plaques sind nahezu ausschließlich im Gehirn lokalisiert und werden bei vielen, aber nicht allen gesunden älteren Menschen gefunden (Davies et al., 1988 ). Eine mögliche Interpretation ist, daß sie ähnlich atherosklerotischen Plaques eine notwendige aber nicht hinreichende Bedingung für die Entstehung pathologischer Prozesse sind. Man unterscheidet verschiedene Reifegrade, je nach Morphologie, Bindungseigenschaften bezüglich des Farbstoffes Kongo Rot und der Assoziation zellulärer Elemente wie Neuriten oder Mikroglia. Allen Stufen jedoch gemeinsam ist jedoch der Hauptbestandteil, -Peptid (P) (Glenner und Wong, 1984 ). Es handelt sich um ein 40-43 Aminosäuren langes Fragment des sogenannten -Amyloid Vorläuferproteins (AVP) (Kang et al., 1987 ). P wird physiologischerweise aus AVP freigesetzt und somit im Liquor und anderen Körperflüssigkeiten gefunden (Haass et al., 1992a ; Seubert et al., 1992 ; Shoji et al., 1992 ). Bislang konnte nicht bewiesen werden, daß die senilen Plaques eine kausale Rolle für die Pathogenese der AK spielen, zumal weder die klinische Symptomatik noch die Neurodegeneration mit ihrem Auftreten korreliert. Auch unterliegt ihre Ablagerung, im Gegensatz zu der der NFB, starken interindividuellen Unterschieden. Eine Rolle des AVP und dessen Fragment P scheint jedoch aufgrund von genetischen, Zellkultur- und Tiermodell-Daten unzweifelhaft (siehe 1.1.1.).

Eine weitere AK-typische Veränderung ist die -Amyloid Angiopathie. Auch dabei wird P abgelagert. Betroffen ist die äußere Basalmembran kleiner und größerer leptomeningealer Arterien, perforierender kortikaler Arterien und Kapillaren. Venen sind selten betroffen (Yamaguchi et al., 1992 ). Der Zusammenhang zwischen parenchymalen und vaskulären -Amyloid Ablagerungen konnte bislang nicht geklärt werden, sowohl von Hirnzellen als auch von anderen Körperzellen wie z.B. Thrombozyten wird P freigesetzt. Eine vorherrschende Rolle für den Krankheitsverlauf spielt die -Amyloid Angiopathie bei der seltenen heriditären zerebralen Amyloid Angiopathie mit Hämorrhagien vom holländischen Typ. Eine autosomal dominante AVP- Mutation (E693Q) ist Ursache dieser Erkrankung (van Broeckhoven et al., 1990 ; Levy et al., 1990 ).

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Bereits von Alzheimer und dessen Schülern wurde die Aktivierung von Mikroglia im AK-Gehirn beschrieben, was in den letzten Jahren bei der AK aber auch bei anderen Erkrankungen des ZNS zunehmend hervorgehoben wurde (McGeer und McGeer, 1995 ). Mikrogliazellen sind immunologisch kompetente Zellen des ZNS und sezernieren nach Aktivierung Zytokine, proteolytische Enzyme, Komplementfaktoren, Sauerstoffradikale und andere Toxine (Giulian et al., 1996 ). Diese Substanzen sind toxisch für Neuronen und stellen eine Entzündungsreaktion dar. Tatsächlich werden sie im AK-Gehirn vermehrt produziert und die Gabe entzündungshemmender Substanzen vom Typ der nichtsteroidalen Antiphlogistika (Indomethazin) konnte die Symptomatik bei AK-Patienten verbessern. Für die Tatsache, daß die Mehrzahl der reifen Plaques aber kaum unreife Plaques, von aktivierter Mikroglia umgeben sind, gibt es zwei Interpretationsmöglichkeiten. Entweder führt die Mikroglia selbst eine Umwandlung herbei, oder nur reife Plaques können Mikroglia aktivieren.

1.1.1. -Amyloid Vorläufer Protein und -Peptid

Das -Amyloid Vorläuferprotein (AVP) ist Mitglied einer Familie von in der Evolution konservierten integralen Membranproteinen, das durch die Sequenzierung des -Peptids (P) in den Amyloidablagerungen des AK-Gehirns identifiziert und danach benannt wurde (Glenner und Wong, 1984 ; Kang et al., 1987 ). Auf Chromosom 21 kodieren 19 alternativ zusammengesetzte Exone für ein bis zu 770 Aminosäuren langes und 140 kDa großes, N-/ O-glykosyliertes, phosphorylierbares und tyrosinsulfatierbares Protein. Es wird ubiquitär und in verschiedenen Isoformen exprimiert, besitzt ein langes extrazelluläres/intravesikuläres N-terminales sowie ein kurzes zytoplasmatisches C-terminales Ende und durchspannt die Membran einmal (siehe Abb. 1). Alle Isoformen enthalten die volle P Sequenz, während diese Region bei den verwandten Familienmitgliedern fehlt.

Die Expression von AVP wird unter anderem durch eine AP-1 Bindungsstelle im Promotorbereich reguliert (Salbaum et al., 1988 ). Dementsprechend wird eine AVP-Überexpression in Folge verschiedener Stimuli wie z.B. Ischämie, Trauma oder

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Bei der alternativen Zusammensetzung der AVP-Exone zu den verschiedenen AVP-Isoformen heben sich Neuronen in zweierlei Hinsicht von anderen Zellen ab. Die vorherrschende Isoform ist die 695 Aminosäuren lange (AVP695), der Exon 7 und 8 fehlen. Das Exon 7 trägt eine Kunitz-Proteasen-Inhibitor (KPI) Domäne, Exon 8 eine Domäne mit MRC OX2 Antigen-Homologie. Außerdem kommen AVP-Isoformen, die eine Chondroitinsulfat-Seitenkette tragen, in Neuronen nicht vor, da diesen als Vorraussetzung für eine Chondroitinsulfat-Anheftung Exon 15 fehlen müßte, was in Neuronen nicht der Fall ist (Sandbrink et al., 1994 ).

Mehrere AVP-Funktionen wurden vorgeschlagen, wie z.B. Beteiligung an Zell-Zell und Zell-Matrix Kontakten oder Neuroprotektion. Die sezernierte Ektodomäne von AVP ist identisch mit Protease Nexin II, einem Inhibitor des Koagulationsfaktors XIa (Van Nostrand et al., 1989). Bestimmte Sequenzen von AVP lassen auf potentielle Funktionen schließen, wie z. B. eine Serinproteaseninhibitordomäne (KPI-Domäne) oder eine Integrin-Bindungssequenz (Ghiso et al., 1992 ). In vitro bindet AVP Kollagen, Laminin und Heparan Sulfat sowie Kupfer und Zink (Narindrasorasak et al., 1991 und 1992, Multhaup et al., 1996 , Bush et al., 1993 ). Der Verlust des AVP-Gens bei Mäusen führt zu fruchtbaren aber untergewichtigen Tieren mit verminderter motorischer Aktivität und zerebraler Gliose (Zheng et al., 1995 ). Ob der Verlust von bestimmten Funktionen von AVP mit der AK in Zusammenhang stehen ist fraglich, da die Mutationsform eher auf den Zugewinn pathologischer Eigenschaften hinweist (siehe oben).

Abb. 1: Schema von AVP mit möglichen Bindungsstellen. Gezeigt ist die Maximalvariante mit 19 Exonen und 770 Aminosäuren. Das Anheften der Chondroitin Sulfat Seitenkette kommt nur bei Fehlen von Exon 15 zustande

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Neusynthetisiertes AVP wird in Neuronen zum Großteil im Golgiapparat zurückgehalten, aber zum Teil auch durch schnellen anterograden Transport zum statischen Teil der axonalen Zellmembran verschickt (Storey et al., 1996 ). Dort ist es mit dem heterotrimeren GTP-Bindungsprotein G_o und dem Zytoskelett assoziiert (Refolo et al., 1991 ; Nishimoto et al., 1993 ). AVP kann vermutlich durch Rezeptor-vermittelte Endozytose in Klathrin-beschichteten Vesikeln komplett reinternalisiert werden (Haass et al., 1992 ). Danach wird AVP entweder in lysosomale Vesikel oder retrograd ins Zellsoma und bis in die Dentriten transportiert. Ob AVP wieder auf die präsynaptische Zelloberfläche gelangt, ist momentan noch unklar (Simons et al., 1995 ; Yamazaki et al., 1995 ; Marquez-Sterling et al., 1997 ).

Die P-Region von AVP ragt mit 28 Aminosäuren nach extrazellulär/intraveskulär aus der Membran und steckt mit 12-15 Aminosäuren in der Membran. AVP kann an verschiedenen Stellen proteolytisch gespalten werden, die Stellen der Spaltung werden mit , , und \|[dgr ]\| bezeichnet (siehe Abb. 2). Der -Schnitt findet auf der Zelloberfläche statt, liegt innerhalb der P-Sequenz von AVP, und hat die Sezernierung des extrazellulären Teils von AVP sowie die Destruktion der P-Region zur Folge. Der -Schnitt am N-terminalen Ende und der -Schnitt am C-terminalen Ende der P-Sequenz von AVP bewirken im Zusammenspiel das Heraustrennen von P aus AVP. P wird entweder von der Zelle sezerniert wird oder verbleibt in der Zelle (Anderson et al., 1991 ; Seubert et al., 1993 ; Haass et al., 1992b ). Voraussetzung für die Sezernierung von P durch Neuronen ist die Endozytose von AVP in Zellkompartimente mit saurem pH (Tienari et al., 1997 ). Zuerst findet der -Schnitt und danach der -Schnitt statt (Seubert et al., 1993 ). Als mögliche /-Sekretase kommt Cathepsin D in Frage, die in verschiedenen Zellkompartimenten mit AVP kolokalisiert, und in vitro sowohl den N- als auch auch den C-Terminus von P produzieren kann (Ladror et al., 1994 ). Eine Hemmung der P-Produktion in vitro wird durch Aktivierung von Protein Kinase C oder Hemmung der Protein Phosphatasen 1 und 2a erreicht (Buxbaum et al., 1993 ).

Im Liquor hat P normalerweise eine Konzentration von zirka 600pM und ist an Apolipoprotein J gebunden, welches P in Lösung hält (Seubert et al., 1992 ; Ghiso et al., 1993 ). Apolipoprotein J ermöglicht P den Transport über die Blut-Hirn-Schranke, wobei

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Punktmutationen an vier verschiedenen Stellen von AVP führen autosomal dominant jeweils zur AK. Diese Mutationen betreffen zwar nur wenige Familien und nicht das Gros der Alzheimer-Patienten, lassen aber einerseits Einblicke in die Pathomechanismen der AK zu, und schaffen andererseits die Möglichkeit eines Alzheimer-Tiermodells.

Mutationen der Aminosäuren 670/1, 692, 716 oder 717 von AVP verursachen die AK mit vorzeitigem Beginn im sechsten Lebensjahrzehnt. Im Serum von präsymptomatischen Trägern all dieser bekannten familiären AK-Mutationen von AVP, nicht aber bei Patienten mit sporadischer AK, wird eine erhöhte Konzentration von P 1-42/43 bzw. 1-40 gefunden. Das könnte daran liegen, daß sich alle Mutationen um die P Sequenz von AVP bzw. um die AVP-Schnittstellen herum gruppieren und die Verarbeitung von AVP beeinflussen: Die ”Schwedische” Mutation am N-terminalen Ende, die Mutationen ”London” und ”Florida” am C-terminalen Ende, und die ”Flämische” in der Mitte der P Region (Goate et al., 1991 ; Hendriks et al., 1992 ; Mullan et al., 1992 ) (siehe Abb. 2). Die ”Holländische” Mutation, die auch in der Mitte der P Sequenz liegt (Aminosäure 693) und zu -Amyloid (A) Ablagerungen führt nicht zur AK, sondern zu zerebralen Hämorrhagien (siehe oben). Auch bei Patienten mit familiärer AK aufgrund einer Mutation von Präsenilin lassen sich erhöhte P Spiegel im Serum bestimmen. Der Zusammenhang mit AVP ist unbekannt, es werden jedoch AVP-Präsenilin Komplexe im endoplasmatischen Retikulum von transfizierten Zellen gefunden, was auf eine direkte Interaktion beider Proteine schließen läßt (Weidemann et al., 1997 ). Es wird vermutet, daß die vermehrte Freisetzung von P und die aufgrund der Konzentrationsabhängigkeit damit verbundene erhöhte Wahrscheinlichkeit der A-Bildung ursächlich an der Entstehung der AK beteiligt sind.

Über Alzheimer-Tiermodelle in Form von AVP-transgenen Mäusen wurde mehrfach berichtet (Quon et al., 1991 ; Kammesheidt et al., 1992 ; Games et al., 1995 ; LaFerla et al., 1995 ; Hsiao et al., 1995 ). Sie exprimieren das komplette AVP als Wildtyp oder in mutierter Form, oder nur den 100-Aminosäuren C-Terminus. Zum Teil zeigen die Modelle P-Ablagerungen, neuronalen bzw. synaptischen Verlust, Gliaaktivierung, neurologische

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Abb. 2: Schema der -Peptid Region von AVP mit dominant vererbten Alzheimer Mutationen und Enzymschnittstellen.

1.1.2. -Amyloid Toxizität

Den Begriff ”Amyloid” führte Virchow für stärkeähnliche Substanzen ein, die im Körper ablagert werden (Virchow, 1853 ). Aufgrund der typischen Farbreaktion mit Jod war er davon überzeugt, daß es sich dabei um Kohlenhydrat handelt. Heute weiß man, daß der Hauptbestandteil von Amyloid Protein ist, das aufgrund seiner Konformation Jod bindet und eine Farbänderung hervorruft. Verschiedene Proteine können zu Amyloid aggregieren und besitzen dann bestimmte histochemische und ultrastrukturelle Eigenschaften, die für alle Amyloidformen gleich sind. Das jeweilige Protein liegt in -Faltblatt Konformation vor, kann Fibrillen bilden und bindet z.B. nur dann den Farbstoff Kongorot so, daß er unter polarisiertem Licht durch Doppelbrechung grün erscheint.

P ist das Protein, das bei der ”Amyloidose” AK das sogenannte -Amyloid (A) bildet. Es könnte sowohl Ursache oder pathogenetischer Faktor als auch Folge oder Epiphänomen der Erkrankung sein. Verschiedene Hinweise sprechen für eine Beteiligung an der Pathogenese: (1) AVP-Mutationen können zur AK führen (siehe oben). (2) Neuronale Zellen, Endothelzellen und Mikroglia können durch A getötet bzw. letztere auch aktiviert werden (Yankner et al., 1989 ; Meda et al., 1995 ; Thomas et al., 1996 ;

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Von einem im Gehirn abgelagerten Pathogen würde man erwarten, daß das umgebende Gewebe proportional der Nähe zum Pathogen geschädigt ist. Dies jedoch scheint auf die P-Ablagerungen im Gehirn von Alzheimer-Patienten nicht zuzutreffen (Roses, 1994 ). Da schon frei flottierende A-Mono-, Di- oder Trimere in vitro zytotoxisch sein können, sind die extrazellulären und statischen und sehr großen Plaques vielleicht nur Speicher, während lösliches A die primäre Rolle als Pathogen spielt.

Ob der Grad der Demenz mit dem Ausmaß der P-Ablagerungen korreliert, wird kontrovers diskutiert. Mehrere Studien fanden keine Korrelation zwischen Zahl der Plaques und Grad der Demenz (Wilkock and Esiri, 1982; Arriagada et al., 1992 ). In einer Studie, in der erstmals nicht die Zahl der Plaques sondern die von ihnen eingenommene Fläche quantifiziert wurde, fand sich eine Korrelation zwischen der P-immunopositiven Fläche im entorhinalen Kortex und dem Grad der Demenz (Cummings und Cotman, 1995 ).

Der Umbau von P in A ist vermutlich Voraussetzung für die pathogene Wirkung. Dafür gibt es mehrere Gründe: (1) Die P Konzentration im Liquor von Patienten mit sporadischer AK und von Kontrollpersonen ist gleich, während unlösliches A in Gehirnen von Alzheimer-Patienten mindestens hundertfach mehr vorkommt als in Kontrollgehirnen (Ida et al., 1996 ; Kuo et al., 1996 ). (2) A aber nicht P ist neurotoxisch in vitro (Pike et al., 1993 ). (3) A-haltige primitive, klassische oder neuritische Plaques sind von Neuriten und zu 80% von aktivierter Mikroglia umgeben, während P-haltige diffuse Plaques nur zu 2% von aktivierter Mikroglia umgeben sind und keine Neuriten enthalten (Rozemuller et al., 1989 ; Giulian et al., 1995 ). (4) In frühen Stadien der AK sind diffuse P Ablagerungen aber noch keine dystrophen Neuriten, klinische Symptomatik oder A Ablagerungen vorhanden (Giaccone et al., 1989 ).

Mehrere Faktoren können diesen Umbau beeinflussen, der wahrscheinlich durch eine Konformationsänderung von P zustande kommt, die von der Sekundärstruktur des N-Terminus (Aminosäuren 10-24) abhängt (Soto et al., 1995 ). Ein vergleichbares Phänomen

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Verschiedene Szenarien für die A-Bildung aus P sind denkbar: (1) Mikroglia phagozytiert die diffusen P-Ablagerungen, um sie abzubauen, und in den sauren Verdauungskompartimenten entsteht unverdaubares A, das von der Mikrogliazelle wieder freigesetzt wird und dann Neuronen schädigt. (2) Kofaktoren wie z.B. Glykosaminoglykane, 1-Antichymotrypsin, Azetylcholinesterase oder ApoE führen extrazellulär zur Umwandlung von P in A, das erst dann mit den Zellen interagiert. (3) A wird bereits in Neuronen gebildet.

Der Mechanismus der A Toxizität ist nicht bekannt. Sie hängt vom Zelltyp ab (Gschwind und Huber, 1996 ; Pike et al., 1993 ) und sowohl apoptotischer als auch nekrotischer Tod wurden beschrieben, was darauf schließen läßt, daß weitere Umstände und nicht A per se über die Todesform entscheiden (Loo et al., 1993 ; Behl et al., 1994a ). Voraussetzung für die Toxizität ist, daß zuvor lösliches P in A umgewandelt wurde, welches dann in der Lage ist, Fibrillen zu bilden und dann mit der Zellmembran in Berührung kommt (Mattson und Rydel, 1992 ; Pike et al., 1993 ; Lorenzo und Yankner, 1994 ). Ob A von der Zelle internalisiert werden muß, um sie zu schädigen, ist nicht bekannt. Exzitotoxizität ist höchstens indirekt beteiligt, da die A Toxizität zwar zur Erhöhung des intrazellulären Kalziums und der Sensitivität für Glutamatrezeptoragonisten führt, aber der NMDA Antagonist MK-801 die Toxizität nicht blockt (Mattson et al., 1992 ;

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Indirekte Neurotoxizität von A könnte durch Stimulation von Mikroglia und daraus folgender Toxinproduktion oder Inflammation (Araujo und Cotman, 1992 ; Giulian et al., 1995 ) oder durch Aktivierung des Komplementsystems einen weiteren Beitrag zur Pathogenese der AK leisten.

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1.2. Biologie von Heparan Sulfat bei der AK

In Amyloid-Ablagerungen verschiedener Genese sind Heparan Sulfat und andere PG beteiligt. In experimentellen Ansätzen wurde beobachtet, daß Heparan Sulfat genauso früh wie das Amyloid-bildende Protein abgelagert wird und eine Überexpression der Ablagerung von Amyloid sogar vorangeht (Stenstad et al., 1994 ; Snow und Kisilevsky, 1985 ). Auch in diffusen Plaques, A-Plaques und NFB bei der AK werden PG gefunden. Allerdings sind Dermatan Sulfat, Keratan Sulfat und Chondroitin Sulfat (Snow et al., 1992 ; DeWitt et al., 1993 ; Snow et al., 1996 ) im Gegensatz zu Heparan Sulfat nur in deren Peripherie lokalisiert, was auf einen späten Ablagerungszeitpunkt schließen läßt. Ob HSPG ursächlich an der Amyloidbildung beteiligt ist, kann bisher nur vermutet werden. Allerdings konnte in vitro und in vivo gezeigt werden, daß es zumindest den Abbau verzögert (Snow et al., 1994a ; Gupta-Bansal et al., 1995 ). Die Zusammenlagerung von Molekülen des Proteins Tau zu gepaarten helikalen Filamenten, wie sie in NFB vorkommen, läßt sich durch Heparan Sulfat in vitro induzieren (Goedert et al., 1996 ).

AVP bindet Heparan Sulfat mit hoher Affinität (Kd=0.9nM für AVP695), vergleichbar mit der Bindung von Heparan Sulfat an Fibronektin. Verantwortlich sind mindestens drei Abschnitte von AVP: Die KPI-Domäne, die Region 98-104 und die Region 684-687 (bzgl. AVP770; Narindrasorasak et al., 1991 ). Letztere entspricht P 13-16 (siehe Abb. 1). Dementsprechend konnte auch eine Bindung von P/A an Heparan Sulfat (Brunden et al., 1993 ) und eine Hemmung der A-Wirkung in Zellkultur durch Zugabe von PG gezeigt werden (Pollack et al., 1995 ).

Die unverzweigten Polysaccharide Heparan Sulfat, Chondroitin Sulfat, Dermatan Sulfat, Keratan Sulfat und Hyaluronsäure werden als Glykosaminoglykane (GAG) bezeichnet. Heparin ist eine Mastzellvariante von Heparan Sulfat. Jedes GAG besteht aus repetitiven Disacchariden, die aus aus GluS, Gal, GalNAz und GluNAz zusammengesetzt und - oder -glykosidisch miteinander verbunden sind (siehe Abb. 3). Hinzu kommen Modifikationen: GAG werden mit Ausnahme von Hyaluronsäure N- und/oder O-sulfatiert und bei Dermatan und Heparan Sulfat wird Glukuronsäure zum Teil bzw. vollständig zu Iduronsäure (IduS) C5-epimerisiert verknüpft (Hardingham und Fosang, 1992 ; Salmivirta et al., 1996 ).

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Eine oder mehrere GAG-Ketten können über einen Oligosaccharid-Anker mit einem Protein kovalent zu einem Proteoglykan (PG) verbunden werden. Heparan Sulfat, Chondroitin Sulfat und Dermatan Sulfat sind O-glykosidisch über Xyl-Gal-Gal-GluS mit Serin, Keratan Sulfat ist entweder O-glykosidisch über GalNAz-GluNAz-Gal mit Serin oder N-glykosidisch über GluNAz-GluNAz-Man-Man-GluNAz mit Asparagin verknüpft. Nur Hyaluronsäure wird nicht kovalent mit einem Protein. Die Menge an Hyaluronsäure, Heparan Sulfat oder Chondroitin Sulfat beträgt im adulten Rattenhirn 102, 62 oder 302 nMol Glukosamin/Galaktosamin pro Gramm Feuchtgewicht (Margolis et al., 1975 ).

Abb. 3: Schema des repetitiven Disaccharidaufbaus der fünf GAG (modifiziert, nach Hardingham und Fosang, 1992

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Der Zusammenbau von Heparan Sulfat Proteoglykanen (HSPG) beginnt mit der Verknüpfung des Tetrasaccharidankers mit einem bestimmten Serin des entsprechenden Proteins. Anschließend werden nacheinander Monosaccharide mit dem Kettenende verknüpft. Je nach dem, ob es sich um GluNAz oder GalNAz handelt, entsteht ein Glukosaminoglykan (Heparan Sulfat) oder ein Galaktosaminoglykan (Chondroitin/ Dermatan Sulfat). Normalerweise wird GalNAz angehängt und es entsteht ein Galaktosaminoglykan, es sei denn, eine bestimmte Peptidsignalsequenz in der Nähe des Serins verhindert dies, und das Glukosaminoglykan Heparan Sulfat entsteht. Als nächstes werden in abwechselnder Reihenfolge die Monosaccharide GluS und GluNAz aus UDP-Monosaccharidverbindungen an das Ende der Kette gehängt. Im Anschluß werden bestimmte GluNAz-Einheiten der Kette deazetyliert und N-sulfatiert, mit 3’-Phosphoadenosin-5’-Phosphosulfat als Sulfatdonor. Dieser Schritt entscheidet auch, welche GluS-Einheiten zu IduS C5-epimerisiert und welche Einheiten O-sulfatiert werden, da für die entsprechenden Enzyme N-Sulfatierung in einem bestimmten Abstand nötig ist (Salmivirta et al., 1996 ).

Heparan Sulfat Proteoglykane (HSPG) werden in matrixassoziierte und membranständige Proteine eingeteilt. Letztere werden auf der Basis von Homologie und Art der Membranverankerung ihres Proteinrestes in zwei Familien eingeteilt, die Syndekan-ähnlichen integralen Membranproteoglykane und die Glypikan-ähnlichen Glykosylphosphadidylinositol-verankerten Membranproteoglykane (David 1993 ). Sechs Mitglieder der Glypikan-Familie wurden bislang beschrieben, Glypican (GPC1) in der Ratte und beim Menschen (David et al., 1990 ; Karthikeyan et al., 1992 ), Cerebroglycan (GPC2) in der Ratte (Stipp et al., 1994 ), GPC3 beim Menschen (Pilia et al., 1996 ), K-Glypican (GPC4) in der Maus (Watanabe et al., 1995 ), OCI-5 in der Ratte (Filmus et al., 1995) und DALLY in Drosophila melanogaster (Nakato et al., 1995 ). Der Proteinanteil hat jeweils eine ähnliche Zahl von Aminosäuren (557-626), eine Sequenz von 13 Zysteinresten, einen hydrophoben N- und C-Terminus, und ein SGXG-Signal zur Verknüpfung mit GAG-Seitenketten. GPC3 ist eine Ausnahme in Bezug auf diese Seitenkette, denn es enthält Chondroitin Sulfat und nicht Heparan Sulfat.

Heparan Sulfat bindet eine ganze Reihe von Makromolekülen, schützt sie vor dem Abbau und dient ihnen als Reservoir. Heparan Sulfat ist an der Zell-Matrix und Zell-Zell Adhäsion beteiligt und beeinflußt auch die Proliferation von Zellen. Für die FGF-Rezeptor-

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1.3. Biologie der Glykosylphosphatidylinositol-verankerten Proteine

Neben dem klassischen Durchspannen der Membran durch die hydrophobe Proteindomäne gibt es eine weitere Variante der Protein-Membran Assoziation, die sogenannte Lipidierung. Vier Klassen dieser kovalenten ko-oder posttranslationalen Modifikation werden unterschieden: Die gesättigte 14-Kohlenstoff Azylgruppe am N-terminalen Glyzin (N-Myristoylierung); die Azylgruppe, zumeist Palmitoyl, an der Zysteingruppe innerhalb des Proteins (S-Azylierung bzw. S-Palmitoylierung); die ungesättigte 15- bzw. 20-Kohlenstoff Isoprenoidgruppe am C-terminalen Zystein innerhalb einer C-A-A-X Konsensussequenz (S-Prenylierung bzw. Farnesylierung/Geranylgeranylierung); und der Glykosylphophatidylinositol-Anker (GPI-Anker) (Casey et al., 1995 ).

Das Grundgerüst des GPI-Ankers ist in allen Eukaryoten gleich. Die Synthese beginnt im endoplasmatischen Retikulum mit der Bindung von GlkNAz an Phosphatidylinositol. Dann wird GlkNAz deazetyliert und Phosphatidylinositol azyliert. Dreimal nacheinander wird dann Mannose von Dolichol-Phosphoryl-Mannose auf GlkN bzw. das Mannoseende übertragen. An das dritte Mannosemolekül wird dann Phosphatidylethanolamin gebunden und daran das C-terminale Ende des entsprechenden Proteins geknüpft, von dem zuvor eine hydrophobe GPI-Anker Signalsequenz abgespalten wurde (Ferguson und Williams, 1988 ; Englund, 1993 ).

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Abb. 4: Schema des Grundgerüsts eines GPI-verankerten Proteins. FS, Fettsäure; Ino, Inositol.

Die Lokalisation von GPI-verankerten Proteinen in der Zellmembran wurde bislang in Kaveolae vermutet. Kaveolae oder Plasmalemnavesikel sind flaschenförmige Membraninvaginationen mit einem Durchmesser von zirka 50nm, die sich durch ihre Unlöslichkeit in nichtionischen Detergenzien aufgrund ihres hohen Anteils an Glykosphingolipiden auszeichnen. Neuere Arbeiten zeigen jedoch, daß GPI-verankerte

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Eine gemeinsame Funktion der GPI-verankerten Proteine ist nicht bekannt, dem gemeinsamen GPI-Anker allerdings werden mehrere Funktionen zugeschrieben. Er beeinflußt den polarisierten Transport, die Membrandiffusion und die Internalisierung des GPI-verankerten Proteins, nimmt an der Signaltransduktion teil und kann z.B. in T-Lymphozyten, Makrophagen oder Neutrophilen eine Zellaktivierung vermitteln. Die Signaltransduktion ist über zwei Mechanismen denkbar: Interaktion des Ankers mit signaltransduzierenden Proteinen wie z.B. Tyrosinkinasen, oder Abspaltung von Ankerkomponenten, die selbst als Botenstoffe wirken, wie z.B. Diazylglyzerin (Tachado et al., 1997 ; Robinson et al., 1991 ).

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