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Kapitel 3. Material und Methoden

3.1. Material

Produkt	Herkunft
Albumin	Sigma, Deisenhofen
Amyloid -Protein 1-40	Bachem, Heidelberg
l-Arginin	Sigma, Deisenhofen
Chondroitin Sulfat	Sigma, Deisenhofen
Chondroitinase ABC	Sigma, Deisenhofen
Dimethylsulfoxid	Sigma, Deisenhofen
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Gibco, Eggenstein
EDTA	Sigma, Deisenhofen
ELISA-Platten 96-Loch	Falcon, Heidelberg
Gewebekulturschalen 25cm2	Falcon, Heidelberg
Glukosamin-6-Sulfat	Sigma, Deisenhofen
Glutamax	Gibco, Eggenstein
N-Glykanase	Genzyme, Cambridge
Heparan Sulfat	Sigma, Deisenhofen
Heparin	Sigma, Deisenhofen
Heparinase I	Sigma, Deisenhofen
Hyaluronsäure	Sigma, Deisenhofen
Fötales Kälberserum	Gibco, Eggenstein
Keratan Sulfat	Sigma, Deisenhofen
Keratanase	Sigma, Deisenhofen
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Biochrom, Berlin
Kollagen G	Gibco, Eggenstein
MTT	Sigma, Deisenhofen
Natrium Chlorat	Fluka, Neu-Ulm
Natrium Dodezyl Sulfat	Sigma, Deisenhofen
Natrium Sulfat	Sigma, Deisenhofen
22 para-Nitrophenyl--D-N-Azetylgalaktosaminid	Sigma, Deisenhofen
para-Nitrophenyl--D-N-Azetylglukosaminid	Sigma, Deisenhofen
para-Nitrophenyl--D-Glukopyranosid	Sigma, Deisenhofen
para-Nitrophenyl--D-Xylopyranosid	Sigma, Deisenhofen
para-Nitrophenyl--D-Xylopyranosid	Sigma, Deisenhofen
PC12 Zellinie	Dr. T. Dyrks, Schering AG
Penizillin/Streptomyzin	Sigma, Deisenhofen
Pferdeserum	Gibco, Eggenstein
Phosphatidylinositol-spezifische Phospholipase C	Sigma, Deisenhofen
PMSF	Sigma, Deisenhofen
Polysialinsäure	Sigma, Deisenhofen
Protamin	Sigma, Deisenhofen
Proteinase K	Sigma, Deisenhofen
Sialinsäure	Sigma, Deisenhofen
Sulfatase	Sigma, Deisenhofen
Trypsin	Sigma, Deisenhofen
Tunicamyzin	Sigma, Deisenhofen

3.2. Zellkultur

Die Zellinie PC12 wurde von Greene und Tischler aus dem Nebennierenmarktumor (Pheochromozytom) einer Ratte isoliert (Greene und Tischler, 1976 ). Danach fand sie weltweite Verbreitung. Dr. T. Dyrks war so freundlich, uns die Zellinie zur Verfügung zu stellen. In unserer Stammkultur wurden die Zellen in 25 cm²-Gewebekulturflaschen kultiviert und für die Versuche in 96-Loch ELISA-Platten umgesetzt.

Die Zellen verdoppelten sich zirka alle zwei Tage und wuchsen zu einer konfluierenden Einzelschicht zusammen. Dafür mußten die Zellen beim Umsetzen durch zehnmaliges Ziehen der gesamten Zellsuspension durch eine feine Plastikpasteurpipette ausreichend vereinzelt werden. Wenn die Zellen nicht ausreichend vereinzelt wurden oder über das Stadium der Konfluenz hinaus wuchsen, entstanden Zellhaufen. Die vereinzelten Zellen wurden bei erreichter Konfluenz 1:4 verdünnt in die neue Stammkultur gegeben. Mit

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Das Zellkulturmedium bestand aus 85% Dulbecco’s Modified Eagle Medium, 10% Pferdeserum und 5% fötalem Kälberserum. Penizillin/Streptomyzin sowie Glutamax wurden aus einer zellkulturgerechten 100-fach konzentrierten Stammlösung dazugegeben. Anschließend wurde das Medium durch Filter mit einer Porengröße von 0.2µm steril-filtriert. In der Stammkultur wurde alle zwei Tage ein Mediumwechsel durchgeführt, indem zwei Drittel der alten Mediums verworfen und durch frisches ersetzt wurden. Für die Versuche wurden die Zellen in frischem Medium verdünnt. Die Zellen wurden bei 37oC, 95%Luft, 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit inkubiert.

In Stamm- und Versuchskultur wurde die Plastikoberfläche der Kulturflasche bzw. der ELISA-Plattenvertiefung mit Kollagen G (0,5 mg/ml in 2mM HCl) benetzt und zweifach mit PBS ohne Kalzium/Magnesium gespült. Die darauf erreichte Zelladhäsion der Zellen war so groß, daß sie mit dem Pipettenstrahl leicht abgespült werden konnten. Ohne Kollagenbeschichtung adherierten die Zellen nicht und bildeten Zellhaufen.

Abb. 4: PC12 Zellen in Kultur

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3.3. Meßprinzip

Als Assay für die A Toxizität diente der MTT-Test. Es handelt sich um einen kolorimetrischen nicht-radioaktiven Test, der auf der Reduktion des gelben Tetrazoliumsalzes 3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromid (MTT) zu lila Formazankristallen durch zelluläre Dehydrogenasen beruht. Die Absorption des entstandenen Formazans wird spektrophotometrisch bei einer Wellenlänge von 550-600nm bestimmt, wo MTT nicht absorbiert. Da Dehydrogenasen nur in lebenden Zellen aktiv sind, dient die Umwandlung von MTT als Maß für die Viabilität der Zellen (Mosmann et al., 1983 ).

Abb. 5: Reduktion von MTT zu Formazan.

Shearman et al. konnten mit PC12 Zellen zeigen, daß der Test sich dafür eignet, A-Toxizität zu bestimmen (Shearman et al., 1994 ). P hatte keinen Einfluß auf die MTT Reduktion. Im Gegensatz zur sofortigen Wirkung der Glutamattoxizität ging der Verlust der Fähigkeit der Zelle, MTT zu reduzieren, bei der A Toxizität dem Zelltod um einige Stunden bis Tage voraus. Dies läßt auf ein apoptotisches Geschehen bei der A-Toxizität schließen, was mittlerweile von einer anderen Gruppe bestätigt wurde (Gschwind und Huber 1995 ).

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Welche Dehydrogenasen in ihrer Funktion aufgrund der A-Toxizität eingeschränkt sind, ist bislang unklar. Durch den Vergleich mit anderen Redoxfarbstoffen, die MTT ähnlich sind und auch zur Zelltoxizitätsbestimmung eingesetzt werden, z.B. XTT (Natrium 3’-[1-[(Phenylamino)Karbonyl]-3,4-Tetrazolium]-bis(4-Methoxy-6-Nitro) Benzensulfonsäurehydrat), konnte gezeigt werden, daß die Voraussetzung für die Sensitivität des Redoxfarbstoffes für A-Toxizität seine Zellpermeabilität ist. Das läßt darauf schließen, daß A-Toxizität nicht auf einer Wirkung als Kalziumkanalbildner an der Zelloberfläche beruht, da z.B. das Kalziumionophor A23187 keine Selektivität bezüglich des Redoxfarbstoffes zeigt. Auch war A23187 in PC12 Zellen nicht in der Lage, Apoptose zu erzeugen. Die intrazelluläre Lokalisation der A-sensitiven Dehydrogenase(n) wurde in HeLa-Zellen als vorrangig perinukleär beschrieben. Da selbst hohe Dosen A keine hundertprozentige Hemmung der MTT-Reduktion erreichen, und da die A-Empfindlichkeit zelltypenspezifisch ist, könnten mehrere Dehydrogenasen betroffen sein. A selbst hat keinen direkten Einfluß auf die Reduktion von MTT (Shearman et al., 1995 , Hawtin et al., 1995 , Gschwind und Huber 1995 ).

Das Protokoll meines MTT-Tests war :

1. Zugabe von MTT (Stammlösung 5mg/ml in H2O_dd), 10µl pro Schale.
2. 3 bzw. 4 Stunden Inkubation bei 37oC.
3. Beenden der MTT-Reduktion und Auflösen der gebildeten Formazankristalle durch Zugabe von 100µl Lösungsmittel (10% Natriumdodezylsulfat in 10mM HCl).
4. Inkubation für 12-24 Stunden bei 37oC, damit sich die Kristalle auflösen können und Luftblasen an der Flüssigkeitsoberfläche verschwinden.
5. Messung der Absorption bei 550nm.

3.4. -Amyloid Behandlung

Nach Angaben des Herstellers zum Erreichen der Fibrillenbildung und Toxizität wurde P1-40 nach dem Verfahren von Lorenzo und Yankner, 1994 behandelt (siehe Abb. 6). P wurde 700µM in H2O_dd gelöst und in Aliquots bei -80^oC eingefroren. Für den Gebrauch

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Abb. 6: Elektronenmikroskopischer Nachweis derA Fibrillen. 350µM A wurde mit 2% Uranylazetat für 15 Minuten negativ kontrastiert, getrocknet und im Transmissionselektronenmikroskop 60000-fach vergrößert (Balken entspricht 100nm).

Für die Kompetitionsstudien wurden die PC12 Zellen zusammen mit der kompetitiven Substanz für 20 Stunden mit 100nM A inkubiert und anschließend der MTT-Test für 4 Stunden durchgeführt. Für Studien mit vorbehandelten Zellen wurde für 3 Stunden mit 400nM A inkubiert und anschließend der MTT-Test für 3 Stunden durchgeführt. A wurde sofort nach Zugabe der kompetitiven Substanz, Zugabe der vorbehandelten Zellen in

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3.5. Kompetitionstudien

Alle kompetitiven Substanzen wurden unmittelbar vor A in das Medium gegeben. Die Synaptosomen wurden nach dem Protokoll von Dodd et al., 1981 prepariert. Erwachsene männliche Wistarratten wurden durch Zervikalfraktur getötet und die zerebralen Kortices (zirka 1g) wurden innerhalb von einer Minute entnommen und in 10ml eiskalte 320mM Sukroselösung gebracht. Das Gewebe wurde in einem Potter Plastik-Teflon Homogenisator durch acht manuelle und acht maschinelle Hübe homogenisiert. In einer Beckman Ultrazentrifuge (Rotor 70.1 Ti) wurden die Synaptosomen in drei Zentrifugationsschritten bei 4oC isoliert:

1. 10 Minuten 5100 U/min ergaben einen zellkernhaltigen Bodensatz und einen ersten Überstand.
2. Zirka 8ml des Überstands wurden vorsichtig mit einer Pipette abgenommen und auf 4ml 1,2M eiskalte Sukrose in einem weiteren Zentrifugationsröhrchen langsam geschichtet, ohne daß sich beide Schichten vermischten. Im selben Rotor wurde für 15 Minuten bei 50000 U/min bei 4oC zentrifugiert.
3. Der resultierende untere Bodensatz enthält Mitochondrien, während Synaptosomen und Myelin am Boden der oberen Schicht sind. Zirka 2ml vom Boden der oberen Schicht wurden abgenommen, mit 5ml 320mM eiskalter Sukrose gemischt und auf 4ml 0,8mM eiskalter Sukrose in einem Zentrifugationsröhrchen langsam geschichtet, ohne daß sich beide Schichten vermischten. Im selben Rotor wurde für 15 Minuten bei 50000 U/min bei 4^oC zentrifugiert. Der resultierende untere Bodensatz enthält die Synaptosomen, während Myelin den Bodensatz der oberen Schicht bildet. Lösliche Bestandteile und Mikrosomen befinden sich im oberen Überstand. Obere Schicht und Überstand der unteren Schicht wurden verworfen und der untere Bodensatz in eiskaltes PBS aufgenommen. Durch Zentrifugation in einer Tischzentrifuge bei 15000 U/min wurden die Synaptosomen

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   gewaschen und von Sukrose befreit. Der Proteingehalt der Synaptosomen wurde nach der Methode von Bradford bestimmt (Bradford, 1976 ).

Die Hitzebehandlung der Synaptosomen wurde für 10 Minuten bei 90^oC durchgeführt. Die Proteasebehandlung der Synaptosomen ( 6µg Proteinanteil/µl) wurde mit 1mg/ml Proteinase K für 4 Stunden bei 50^oC durchgeführt. Anschließend wurde die Reaktion mit 1mM PMSF und Erhitzen (90^oC, 10 Minuten) gestoppt. In der Kontrolle wurde Proteinase K direkt in die erhitzte Probe mit PMSF gegeben. Die so behandelten Synaptosomen wurden nach Abkühlung 1:10 ins Medium gegeben. Die Trennung in lösliche und feste Bestandteile wurde durch Zentrifugation in einer Tischzentrifuge für 3min mit 10000 U/min durchgeführt.

Die PC12 Membranen wurden durch Lyse in H2O_dd , Hitzeinaktivierung für 10 Minuten bei 90^oC, und Waschen in PBS durch Zentrifugation für 3min mit 10000 U/min in einer Tischzentrifuge isoliert.

Die Trennung von Lipiden und Proteinen wurde nach der Methode von Folch vorgenommen (Folch et al., 1957 ). Die Synaptosomen bzw. Membranen wurden in eine 2:1 Mischung aus Chloroform und Methanol gegeben und gut geschüttelt. Zur Phasentrennung wurden 0,2 Vol 0,1M KCl gegeben und bei 15000 U/min für 3 Minuten in einer Tischzentrifuge zentrifugiert. Die einzelnen Phasen wurden in einer Vakuumzentrifuge getrocknet, in PBS aufgenommen und in einem Wasserbad für 5 Minuten beschallt.

Die Liposomen wurden aus den vier wichtigsten Lipiden der neuronalen Zellmembran im physiologischen Verhältnis 36mg Dipalmitoylphosphatidylcholin, 36mg Dipalmitoylphosphatidylethanolamin, 10mg Dioeylphosphatidylserin und 18mg Cholesterin in 1ml PBS durch Beschallen hergestellt (Good und Murphy, 1995 ).

3.6. Vorbehandlung der Zelloberfläche

Die GAG-spaltenden Enzyme Heparinase, Chondroitinase/Dermatanase und Keratanase, das Sulfat-abspaltende Enzym Sulfatase, die Protease Trypsin, das N-Glykosylierungen spaltende Enzym N-Glykanase oder das GPI-spaltende Enzym Phosphoinositolspezifische Phospholipase C wurden in Anlehnung an van Putten and Paul

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3.7. Manipulation spezischer Zellsynthesewege

Eine Hemmung der Verbindung der GAG-Kette mit dem Proteingrundgerüst im Golgi wurde durch Inkubation der PC12 Zellen mit para-Nitrophenyl--d-Xylopyranosid (pNP--Xyl) für 20 Stunden bei 37^oC durchgeführt und eine Dosiswirkungskurve für die Hemmung der Toxizität von 3 Stunden 400nM A erstellt. Als Kontrolle für die Spezifität von -Xyl wurden alle bekannten Arten der Glykosylierung mit verschiedenen para-Nitrophenyl-Monosacchariden einschließlich pNP--Xyl gehemmt, indem diese in einer Konzentration von 4mM für 3 Stunden bei 37^oC in die Zellkultur gegeben wurden und 400nM A für 3 Stunden ausgesetzt wurden. Als Kontrolle dafür, daß pNP--Xyl seine Wirkung nicht durch vermehrte Freisetzung von GAG-Ketten ins Medium erzielt und diese A dort vermehrt binden, wurden die Medien von Zellen nach 20 Stunden Vorinkubation mit oder ohne -Xyl vertauscht und dann A zugegeben. Eine Hemmung der N-Glykosylierung wurde zusätzlich mit Tunikamyzin durchgeführt. Tunikamyzin wurde mit der maximalen nichttoxischen Dosis von 1µg/ml für 20 Stunden ins Zellkulturmedium gegeben.

Eine Hemmung der zellulären Sulfatierung wurde mit 20 Stunden Vorinkubation mit Natriumchlorat durchgeführt und eine Dosis-Wirkungskurve erstellt.

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3.8. Statistik

Alle Experimente wurden als Vierfach-Bestimmungen durchgeführt und davon jeweils der Mittelwert gebildet. Von den Absorptionswerten bei 550nm wurde jeweils der Nullwert abgezogen, der dem Wert von Medium ohne MTT-Reduktion (A0) entsprach. Als Ausgangstoxizität diente jeweils die prozentuale Toxizität von A bei unbehandelten Zellen (%ToxizitätKontrolle). Die A-Toxizität nach Behandlung entweder mit kompetitiven Substanzen im Medium oder Vorbehandlung der PC12 Zellen (% ToxizitätBehandlung) entsprach dem Prozentwert, der aus derbehandelten Gruppe ohne A (AB) und der behandelten Gruppe mit A ((AB+A) errechnet wurde (siehe Formel). Daraus resultiert der prozentuale Block der Toxizität (%BlockToxizität). Wenn A und AB differierten, gab es zwei Möglichkeiten: Die Substanz selbst oder ein von ihr induziertes Stoffwechselprodukt adsorbierte bei 550nm, was zu einem Anstieg der Absorption von AB gegenüber A führte. Dies konnte durch Austausch des Mediums in der unbehandelten Gruppe (und in der behandelten Gruppe zur Herstellung gleicher Bedingungen) vor Beginn des MTT-Tests oder durch Subtraktion des Anstiegs von AB und AB+A vor Berechnung von % ToxizitätBehandlung ausgeglichen werden (z.B. Synaptosomen). Die zweite Möglichkeit war der Abfall der Absorption von AB gegenüber A. Hierbei konnte es sich um eine Interaktion der Behandlung mit MTT oder um Toxizität der Behandlung handeln, was durch Kontrolle der Zellmorphologie ermittelt werden konnte. Bei Toxizität wurden die Dosis reduziert und die maximale nicht-toxische Dosis verwendet (z.B. Tunikamyzin). Eine Interaktion mit MTT trat nicht auf.

Bei Experimenten mit enzymatischer Vorbehandlung wurden die unbehandelten Zellen parallel zur behandelten Gruppe mit der Pufferkontrolle unter gleichen Bedingungen vorinkubiert und dann gleichzeitig in die Versuchsschalen transferiert. Für die Kontrolle der Trypsin oder Proteinase K Behandlung wurde die Protease in gleicher Konzentration mit einer Inkubationszeit von 0 Minuten zugegeben.

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%Toxizität_Kontrolle=100*(A-A_o)-(A_A-A_o)/(A-A_o)

% Toxizität_Behandlung=100*(A_B-A_o)-(A_B+A-A_o)/(A_B-A_o)

%Block_Toxizität=100* %Toxizität_Behandlung/%Toxizität_Kontrolle

A:	Absorption der unbehandelten Zellen bei 550nm
Ao:	Absorption des Medium bei 550nm
AA:	Absorption der mit A inkubierten Zellen bei 550nm
AB:	Absorption der behandelten Zellen bei 550nm
AB+A:	Absorption der behandelten und mit A inkubierten Zellen bei 550nm

Alle Experimente wurden mindestens dreimal in vierfacher Bestimmung durchgeführt, es sei denn, eine abweichende Zahl ist in der Legende benannt. Mittelwert und Standardabweichung sowie Signifikanz wurden mit Hilfe des gepaarten T-Testes berechnet (* für p<0.05; ** für p<0.01).

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