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Kapitel 4. Ergebnisse

4.1. Evaluierung des Systems

Zunächst wurden die wichtigsten Parameter zur Durchführung des MTT-Tests untersucht. Dazu gehören Zelldichte und Dauer der Inkubation mit MTT. Als MTT-Konzentration wurde, wie vom Hersteller empfohlen, 0,5 mg/ml MTT eingesetzt.

Zwischen Zelldichte und MTT Reduktion bestand ein linearer Zusammenhang (Abb. 7). Dies galt mindestens für einen Bereich von 25% bis 800% der in den übrigen Experimenten gewählten Zelldichte von 100 Zellen/µl. Da der maximale Effekt von A eine Verminderung auf 40% des Ausgangswertes an MTT Reduktion betrug, waren die Absorptionswerte bei 550nm proportional den Toxizitätsraten in diesem Bereich.

Abb. 7: Abhängigkeit der Reduktion von 0,5mg/ml MTT von der Zelldichte. Die Daten stammen von einem einzelnen Experiment in Vierfachbestimmung.

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Wie man am linearen Verlauf der Kurve in Abb. 8 sieht, war auch eine Inkubationszeit von 2-4 Stunden im linearen Bereich, d.h. die MTT Konzentration ausreichend, um PC12 Zellen bei der Zelldichte von 100 Zellen/µl mehrere Stunden zu inkubieren. Mit zunehmender Dauer trat eine Sättigung ein. Da die MTT-Inkubationszeit für Kontrolle und behandelte Gruppe in allen Experimenten gleich war, war diese Linearität aber nicht erforderlich.

Abb. 8: Zeitverlauf der Reduktion von 0,5mg/ml MTT durch 100 PC12 Zellen/µl. Die Daten stammen von einem einzelnen Experiment in Vierfachbestimmung.

Um die Wirkung von A auf die MTT Reduktion zu bestimmen, und darüber hinaus einen Bereich zu ermitteln, in dem A einen mittleren Effekt erzielt, wurde eine Dosis-Wirkungskurve von 20 Stunden A-Vorinkubation der Zellen angefertigt (Abb. 9). Die kleinste wirksame Dosis betrug 1nM, was der doppelten Konzentration von P im Liquor entspricht. Eine Sättigung stellte sich bei 1µM ein, wobei die verbleibende MTT Reduktion 40% betrug. Diese Daten sind gut mit den bisher publizierten vereinbar (Behl et al., 1994 ; Shearman et al., 1994 ). Die Restaktivität könnte durch A-unempfindliche Zellen zustande

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Einen halbmaximalen Effekt erzielten wir mit 100nM. Diese Dosis ließ zu, sowohl Steigerung als auch Abschwächung von Toxizität zu messen und wurde in den folgenden Experimenten verwendet.

Abb. 9: A Dosisabhängigkeit von 4 Stunden MTT Reduktion durch 100 PC12 Zellen/µl. Die Zellen wurden 20 Stunden mit A vorinkubiert. Für alle Datenpunkte wurden mindestens drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt (* für p<0,05; ** für p<0,01: gepaarter t-Test).

Das lösliche oder amorph aggregierte P erzielte bei einer Konzentration von 10µM und 20 Stunden Vorinkubation mit den Zellen keinen Effekt auf die MTT Reduktion (Abb. 10), was den konformationsabhängigen Effekt von P/A auf die MTT Reduktion bestätigt (Lorenzo und Yankner, 1994 ; Pike et al., 1993 ).

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Abb. 10: Effekt von 20h Vorinkubation mit 10µM A oderP auf die MTT Reduktion von 100 PC12 Zellen/µl. Für A wurden zwei, für P drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt (* für p<0,05: gepaarter t-Test).

Intakte Zellen sind Voraussetzung für die MTT Reduktion. Die Verteilung der durch Reduktion aus MTT gebildeten Formazankristalle ist vorwiegend perinukleär, d.h. intrazellulär (Nikkhah et al., 1992 ; Shearman et al., 1995 ; Abb. 11). Andere Tetrazoliumverbindungen, wie z.B. Natrium 3'-[1-[(Phenylamino) Carbonyl]-3,4-Tetrazolium]-bis-(4-Methoxy-6-Nitro) Benzensulfonsäure (XTT), die nicht wie MTT zellpermeabel sind, werden sehr viel weniger von PC12 Zellen umgesetzt , was sich aber durch Zugabe der zellpermeablen Elektronenkopplungssubstanz Phenazin Ethosulfat auf einen mit MTT vergleichbaren Wert steigern läßt. Hemmstoffe der Atmungskette, die an der inneren mitochondrialen Membran angreifen, können die MTT Reduktion von intakten PC12 Zellen oder deren isolierten Mitochondrien allerdings nicht hemmen. Es ist also unwahrscheinlich, daß der Effekt von A auf die MTT Reduktion über Dehydrogenasen der inneren Mitochrondrienmembran zustande kommt (Shearman et al., 1995 ; Hawtin et al., 1995 ).

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Abb. 11a: 40-fache Vergrößerung von PC12 nach 20 Stunden Vorinkubation ohne A und danch anderthalbstündiger Stunde MTT-Reduktion.

Abb.11b: 40-fache Vergrößerung von PC12 Zellen nach 20 Stunden Vorinkubation mit 1µM A und danach anderthalbstündiger MTT-Reduktion.

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Durch den Einfluß von A wird vor allem die intrazelluläre MTT Reduktion verhindert, während die Zellmembran-gebundene Reduktion nicht abnimmt, vielleicht sogar eher zunimmt. Dies liegt eher daran, daß das intrazelluläre MTT nicht reduziert wird, als daß die Aufnahme von MTT in die Zelle gehemmt wird, da auch die Zugabe von Phenazin Ethosulfat den A Effekt nicht nimmt (Shearman et al., 1995 ). Abb. 11 zeigt den Effekt der A-Vorinkubation auf die Formazanbildung.

Nachdem gezeigt wurde, daß die MTT-Reduktion pro Zelle über einen großen Bereich der Zelldichte konstant ist (Abb. 1), konnte die Abhängigkeit der A Toxizität von der Zelldichte bestimmt werden (Abb. 12).

Abb. 12: Abhängigkeit der Toxizität von 100nM A von der Zelldichte. Für alle Datenpunkte wurden mindestens drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt.

Obwohl eine zehnfache Konzentration von A im Bereich 1-100nM eine deutliche Steigerung der Toxizität zur Folge hatte (Abb. 9), war dies für eine zehnfache Dosis von A pro Zelle nicht der Fall (Abb. 12). Dies bedeutet einerseits, daß die Dosisabhängigkeit des A-Effekts auf die MTT-Reduktion nicht durch "Verbrauch" von A durch die Zellen

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Die Geschwindigkeit, mit der die Zellen auf A ansprechen spielt in zweierlei Hinsicht eine Rolle. Als Information über den Mechanimus, mit dem A zur Hemmung der MTT Reduktion führt, und für die Durchführung von Experimenten, bei denen eine enge zeitliche Begrenzung aufgrund transitorischer Veränderungen der Zelle notwendig ist.

Aus Abb. 13 ist ersichtlich, daß bereits nach einer Stunde 40% des 24 Stunden Effekts erreicht sind und die Steigung der Kurve zunehmend abfällt. Dahinter könnte man eine zelloberflächennahe Wirkung von A vermuten.

Abb. 13: Zeitverlauf der Toxizität von 1µM A. Die Datenpunkte beziehen sich auf ein Experiment mit Vierfachbestimmungen und entsprechen dem prozentualen Anteil an der 24 Stunden Toxizität.

Als Vergleich für die Stärke des Effekts von A auf die MTT-Reduktion von PC12 Zellen wurde H2O2 herangezogen, dem eine Rolle bei der A-Toxizität zugeschrieben

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Abb. 14: H2O2-Dosisabhängigkeit von 4 Stunden MTT Reduktion durch 100 PC12 Zellen/µl. Die Zellen wurden 20 Stunden mit H2O2 vorinkubiert. Für alle Datenpunkte wurden mindestens drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt (* für p<0,05; ** für p<0,01: gepaarter t-Test).

Zusammenfassend läßt sich sagen, daß mein System geeignet ist, A-Toxizität in vitro zu messen. Es reagiert schnell und sensibel, d.h. innerhalb weniger Stunden auf nanomolare Dosen von A, nicht aber von P. Die Toxizität ist im getesteten Bereich unabhängig von der Zelldichte und proportional zur Absorption des aus MTT entstandenen Formazans.

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4.2. Kompetition zwischen PC12 Zellen und zellulären Membranen um A

Der erste Schritt bei der Identifikation eines möglichen A-Rezeptors bestand darin, zu überprüfen, ob isolierte Membranen mit der PC12 Zelle um A kompetitieren. Dies wäre z.B. nicht der Fall gewesen, wenn es eines aktiven Transports von A in die Zellmembran bedarf. Da dies der Fall war, ermöglichte es dieser Ansatz weitere Aussagen über die Art der Membranbestandteile zu treffen, die an der Kompetition beteiligt sind. Da es sich hierbei nicht um ein intakte Zelle handelt, konnten wir mit biochemischen Methoden arbeiten. Als Ausgangsmaterial wählten wir Rattenhirnsynaptosomen, weil diese dem Zielort von A im Alzheimergehirn am nächsten kommen und mit der Spezies der PC12 Zellinie übereinstimmen.

In Abb. 15 ist der Effekt von logarhithmisch ansteigenden Synaptosomen-Dosen im Medium auf die A Toxizität angegeben. Die Die Synaptosomen wurden aufgrund ihres Proteingehalts quantifiziert und enthielten in etwa dieselbe Menge an Lipiden. Ein 50%iger Block der A-Toxizität wurde mit zirka 100ng Synaptsomen pro Mikroliter Medium erreicht, was in etwa dem zehnfachen Proteingehalt der PC12 Zellen in der Schale (100 Zellen/µl) entspricht. 1,2µg Synaptosomen pro Mikroliter Medium blockten die A-Toxizität vollständig. Bei der Berechnung der prozentualen Toxizität in mit Synaptosomen behandelten Gruppen wurde zuvor die Eigenabsorption der Synaptosomen bei 550nm subtrahiert.

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Abb. 15: Dosisabhängiger Block der Toxizität von A durch vorherige Zugabe von Rattenhirnsynaptosomen ins Medium von 100 PC12 Zellen/µl. Für alle Datenpunkte wurden mindestens drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt (* für p<0,05; ** für p<0,01: gepaarter t-Test).

Der Bindungspartner für A auf der Membran könnte sowohl ein Lipid als auch aus Protein sein. Es wurde berichtet, daß sich A direkt in künstliche Membranen aus Lipid eingebauen kann (Arispe et al., 1993 ). Andererseits ragen Proteine weit aus aus der Lipidmembran der Zelloberfläche hinaus und kommen früher mit extrazellulären Substanzen zusammen. Um einen direkten Vergleich zwischen beiden Anteilen zu ziehen, wurden die Synaptosomen nach der Methode von Folch in Protein- und Lipidanteile getrennt und diese jeweils einzeln ins Medium gegeben (Folch et al., 1957 ).

Abb. 16 zeigt, daß alle drei Komponenten in der Lage waren, A zu binden und dessen Toxizität zu blocken. Um auszuschließen, daß Protein die Lipidfraktionen verunreinigt, habe ich diese auf ihren Proteingehalt untersucht. Er betrug zirka 1% des ursprünglichen Proteingehalts der Synaptosomen für die geladene Lipidfraktion und war unterhalb der messbaren Mindestmenge für die neutrale Lipidfraktion.

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Abb. 16: Block der Toxizität von A durch vorherige Zugabe der nach Folch preparierten Protein- (Prot) bzw. Lipidbestandteile (NLip=Glykolipide mit vier Sacchariden, Phospholipide und neutrale Lipide; CLip=Neutrale Lipide mit vier und mehr Sacchariden und Ganglioside) von Rattenhirnsynaptosomen (Syn; 600ng/µl) ins Medium. Für alle Datenpunkte wurden mindestens drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt (* für p<0,05; ** für p<0,01: gepaarter t-Test).

Dieses Ergebnis konnte unter Verwendung von PC12 Zellmembranen an Stelle der Synaptosomen bestätigt werden (Abb. 17). Diese bzw. deren Protein/Lipidbestandteile wurden in einem Verhältnis Membranen: lebende PC12 Zellen von 33:1 zugegeben.

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Abb. 17: Block der Toxizität von A durch vorherige Zugabe der nach Folch preparierten Protein-(Prot) bzw. Lipidbestandteile (Lip) von PC12 Zellmembranen (PCMem; 3300 Zellen/µl) ins Medium. Für alle Datenpunkte wurden mindestens drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt (* für p<0,05; ** für p<0,01: gepaarter t-Test).

Um weiter zu ermitteln, welchen Anteil Proteine an der A-Bindung von Synaptosomen ausmachen, wurden diese entweder Hitze oder Proteolyse und Hitze ausgesetzt, wodurch unspezifisch Protein denaturiert bzw. in kürzeste Bruchstücke zerlegt wird. Danach wurden die Synaptosomen ins Zellkulturmedium gegeben und die A Toxizität gemessen (Abb. 18).

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Abb. 18: Beständigkeit der A-Bindungsfähigkeit von Synaptomen (Syn) gegen Hitze (Syn+Hitze; 90oC, 10 Minuten) oder Hitze und Proteolyse (Syn+PK; 1mg/ml Proteinase K). Nach der Behandlung der Synaptosomen wurde Proteinase K inaktiviert, die Synaptosomen ins Medium gegeben und die A Toxizität bestimmt. Für alle Datenpunkte wurden mindestens drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt (* für p<0,05; ** für p<0,01: gepaarter t-Test).

Obwohl die von den Synaptosomen nach Folch abgetrennte Proteinfraktion eine deutliche A Bindung aufwies (Abb. 16 und 17), hatte überraschenderweise weder Proteolyse noch Hitze einen Effekt auf diese Bindung (Abb. 18).Eine mögliche Erklärung ist, daß Protein zwar nicht direkt an der A-Bindung beteiligt ist, aber eine indirekte Rolle für die A Bindung spielt.

Um zu testen, ob Proteine Träger für andere, nicht proteinhaltige Substanzen sind, die A an die Membranen binden, wurden die mit Protease-behandelten Synaptosomen durch Zentrifugation von den dadurch gelösten Molekülen getrennt. Nun war ein Effekt der Proteolyse sichtbar. Die Synaptosomen verloren einen Teil ihrer A-Bindung und gleichzeitig taucht diese Bindungskapazität im löslichen Überstand auf (Abb. 19).

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Abb. 19: Freisetzung löslicher A-bindender Bestandteile aus Synaptosomen durch Proteolyse. Synaptosomen wurden mit Proteinase K (1mg/ml) inkubiert, die Proteinase inaktiviert, die Synaptosomenbestandteile durch Zentrifugation getrennt, ins Medium gegeben, und die A Toxizität bestimmt. Pe, zentrifugierbare Synaptosomenbestandteile nach 0 Stunden Inkubation mit Proteinase K; PK-Pe, zentrifugierbare Synaptosomenbestandteile nach 4 Stunden Inkubation mit Proteinase K; Sol, lösliche Synaptosomenbestandteile nach 0 Stunden Inkubation mit Proteinase K; PK-Sol, lösliche Synaptosomenbestandteile nach 4 Stunden Inkubation mit Proteinase K. Für alle Datenpunkte wurden mindestens drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt (* für p<0,05; ** für p<0,01 bezüglich der jeweils unbehandelten Fraktion: gepaarter t-Test).

Eine mögliche Erklärung ist, daß die Kohlenhydratanteile der Proteine durch den Verlust ihres Proteinankers freigesetzt wurden und A banden. Die nach Proteolyse verbleibende A-Bindung der Synaptosomen könnte durch den Kohlenhydratanteil der Glykolipide zustande kommen, was zu der Ergebnissen der Folch-Fraktionierung (Abb. 16 und 17) paßt. Eine andere Möglichkeit besteht darin, daß durch Proteinase K Peptidfragmente freigesetzt werden und diese A binden. Allerdings ist die Aminosäurenspezifität von Proteinase K so gering, daß die aus der Proteolyse resultierenden Bruchstücke wahrscheinlich zu klein dafür sind. Außerdem weist die Hitzeunempfindlichkeit der A-Bindung von Synaptosomen (Abb. 18) auch auf die Beteiligung von Kohlenhydraten und nicht von Proteinen hin.

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Die restliche Bindungsaktivität der Synaptosomen nach Proteolyse könnte auch durch Lipide ohne Kohlenhydratanteil oder durch noch vorhandene membrannahe und damit eventuell proteasenunzugängliche Proteinreste zustande kommen. Letzteres kann mit diesem Ansatz nicht ausgeschlossen werden. Um auszuschließen, daß Lipide ohne Kohlenhydratanteil für die A-Bindung in der Zellmembran verantwortlich sind, haben wir Liposomen aus den vier wichtigsten Lipiden der neuronalen Zellmembran in einem physiologischem Verhältnis ins Medium gegeben und dann die A Toxizität getestet (Abb. 20). Bis zu einer toxischen Dosis von 3µg/µl Medium, also dem fünffachen der Lipiddosis, die aus Synaptosomen extrahiert einen 50%igen Block der A-Toxizität erreichte (Abb. 16), war kein Effekt zu erkennen.

Zusammengefaßt weisen diese Daten indirekt auf eine Beteiligung von an Protein oder Lipid gebunden Kohlenhydraten, nicht aber von Protein oder Lipid allein, an der Bindung von A auf der Zellmembran hin.

Abb. 20: Dosis-Wirkungskurve von Liposomen (36% Phosphatidylcholin, 36% Phosphatidylethanolamine, 10% Phosphatidylserin und 18% Cholesterin) auf die PC12 Zellviabilität ohne (geschlossener Kreis) oder mit (offener Kreis) 100nM A. Die Datenpunkte entsprechen Werten aus Vierfachbestimmungen in einem einzelnen Experiment.

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4.3. Kompetition um -Amyloid zwischen PC12 Zellen und Kohlenhydraten im Medium

Um direkt zu zeigen, daß Kohlenhydrate in Lage sind, A zu binden und dessen Toxizität zu blocken, wurden verschiedene Kohlenhydrate ins Zellkulturmedium gegeben und darauf hin die A Toxizität gemessen. Drei Polysaccharide haben sich als besonders wirkungsvoll erwiesen: Heparin, Heparan Sulfat und Chondroitin Sulfat (Abb. 21-23). Die Konzentration, die für eine Reduktion der Toxizität von 100n A um fünfzig Prozent nötig war, betrug 50pg/µl, 1ng/µl und 50ng/µl für die drei Substanzen. Ähnliche Polysaccharide, wie z.B. Keratan Sulfate, Polysialinsäure und Hyaluronsäure waren selbst in hohen Dosen ohne Wirkung. Auch die Monosaccharide Glukosamin-6-Sulfat und Sialinsäure oder Sulfat-Ionen waren bis 10mM ohne Wirkung (siehe Übersicht in Tabelle 1).

Abb. 21: Dosis-Wirkungskurve von Heparin im Medium auf die PC12 Toxizität vonA. Für alle Datenpunkte wurden mindestens drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt (* für p<0,05; ** für p<0,01: gepaarter t-Test).

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Abb. 22: Dosis-Wirkungskurve von Heparan Sulfat im Medium auf die PC12 Toxizität von A. Für alle Datenpunkte wurden mindestens drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt (* für p<0,05; ** für p<0,01: gepaarter t-Test).

Abb. 23: Dosis-Wirkungskurve von Chondroitin Sulfat im Medium auf die PC12 Toxizität von A. Für alle Datenpunkte wurden mindestens drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt (* für p<0,05; ** für p<0,01: gepaarter t-Test).

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Abb. 24: Dosis-Wirkungskurve von Keratan Sulfat im Medium auf die PC12 Toxizität von A. Für alle Datenpunkte wurden mindestens drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt (* für p<0,05; ** für p<0,01: gepaarter t-Test).

Abb. 25: Dosis-Wirkungskurve von Hyaluronsäure im Medium auf die PC12 Toxizität von A. Für alle Datenpunkte wurden mindestens drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt (* für p<0,05; ** für p<0,01: gepaarter t-Test).

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Abb. 26: Dosis-Wirkungskurve von Polysialinsäure im Medium auf die PC12 Toxizität von A. Für alle Datenpunkte wurden mindestens drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt (* für p<0,05; ** für p<0,01: gepaarter t-Test).

Abb. 27: Dosis-Wirkungskurve von Protamin im Medium auf die PC12 Toxizität von A. Für alle Datenpunkte wurden mindestens drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt (* für p<0,05; ** für p<0,01: gepaarter t-Test).

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Abb. 28: Wirkung von 10mM Sialinsäure (NANA), Natiumsulfat (SO4), l-Arginin (l-Arg) oder Glukosamin-6-Sulfat (Gln-6-S) im Medium auf die PC12 Toxizität von A. Für alle Datenpunkte wurden mindestens drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt (* für p<0,05: ** für p<0,01; gepaarter t-Test).

Eine Gemeinsamkeit der drei Substanzen mit A-Bindung ist, abgesehen von ihrer Eigenschaft als Polysaccharid, die Sulfatierung. Sie beträgt 11,9% für Heparin, 10,2% für Heparan Sulfat und 5,1% für Chondroitin Sulfat. Die Substanz mit der stärksten Sulfatierung band also auch A am stärksten, und umgekehrt. Hyaluronsäure, wie die drei anderen Substanzen ein stark negativ geladenes unverzweigtes Polysaccharid vom Typ der Glykosaminoglykane, besitzt keinerlei Sulfatgruppen und war auch nicht wirksam. Dasselbe gilt für Polysialinsäure, welche zwar kein Glykosaminoglykan, aber stark negativ geladen und unverzweigt ist. Eine Ausnahme von dieser Regel ist Keratan Sulfat, ein sulfatiertes Glykosaminoglykan, das A-Toxizität bis zu Dosen von 250ng/µl nicht blocken konnte. Eine mögliche Erklärung für diese Diskrepanz wäre ein Einfluß der Saccharide selbst, die sich für die einzelnen Glykosaminoglykane unterscheiden. Der Heparin Antagonist Protamin war ebenfalls in der Lage, A-Toxizität zu blocken; vermutlich durch Bindung an

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Zusammenfassend läßt sich sagen, daß sulfatierte unverzweigte Polysaccharide aber nicht unsulfatierte Polysaccharide, sulfatierte Monosaccharide oder Sulfat-Ionen allein in der Lage sind, A zu binden und dessen Toxizität zu blocken. Ob diese auch tatsächlich auf der Zellmembran an der Vermittlung von A Toxizität beteiligt sind, muß aber direkt durch Manipulation der durch A zu schädigenden Zelle gezeigt werden, da A diese Moleküle eventuell gar nicht bindet oder diese keinen Toxizitätseffekt vermitteln.

Tabelle 1: Übersicht der Substanzen, die ins Medium gegeben wurden, um A zu binden. Angegeben sind die Dosen, die ungefähr einen halbmaximalen Block von 20 Stunden 100nM A Toxizität erzielten. Der Schwefelanteil bezieht sich auf die Angaben des Herstellers.

Substanz	EC 50	% SO4
Heparin	50pg/µl	11.9
Heparan Sulfat	1ng/µl	10.2
Chondroitin Sulfat	50ng/µl	5.1
Keratan Sulfat	>250ng/µl	6.3
Hyaluronsäure	>500ng/µl	0
Polysialinsäure	>1000ng/µl	0
Protamin	0.4ng/ml	0
Glucosamine-6-Sulfat	>10mM
NaSO4	>10mM
Sialinsäure	>10mM
l-Arginin	>10mM

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4.4. Sulfatierung der PC12 Zelle und -Amyloid Toxizität

Die Sulfatierung von Kohlenhydraten der Glykoproteine oder Glykolipide und von Tyrosinresten bestimmter Proteine findet im Golgiapparat statt. Chlorat hemmt die Bildung der aktiven Form von Sulfat, 3'-Phosphoadenylylphosphosulfat und somit den Sulfateinbau in diese Makromoleküle (Baeuerle und Huttner, 1986 ).

Vorinkubation der PC12 Zellen mit 25 oder 50mM Natriumchlorat hatte einen 65 bzw. 80-prozentigen Block der A Toxizität zur Folge (Abb. 29). Da wir nicht mit sulfatfreiem Medium arbeiteten, Serum aber beträchtliche Mengen an Sulfat enthält und es sich um eine kompetitive Hemmung handelt, ist anzunehmen, daß die zelluläre Sulfatierung nicht vollständig verhindert wurde.

Abb. 29: Wirkung der Hemmung der zellulären Sulfatierung durch Vorinkubation der PC12 Zellen mit Natriumchlorat fur 20 Stunden in den angegebenen Dosen auf die A Toxizität. Für alle Datenpunkte wurden mindestens drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt (* für p<0,05; ** für p<0,01: gepaarter t-Test).

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Eine Möglichkeit der Quantifizierung von zellulärer Sulfatierung besteht darin, den Einbau von radioaktivem [35S] Sulfat zu verfolgen, wofür die technischen Vorrausstzungen aber nicht gegeben waren. Humpries und Sibert erreichten durch 16-stündige Inkubation mit 30mM Natriumchlorat in normalem Medium (0,4mM Sulfat, 20% Serum) eine 90- bzw. 65- prozentige Hemmung der Chondroitin bzw. Heparan Sulfat Sulfatierung in Endothelzellen (Humphries und Silbert, 1988 ).

Alternativ zur Hemmung der Neusulfatierung kann mit dem sulfatabspaltenden Enzym Sulfatase bereits bebildetes Sulfat von Molekülen der Zelloberfläche abgespalten werden. Wie aus Abb. 30 hervorgeht, hatte auch dies eine Hemmung der A Toxizität zur Folge. Maximal wurden 40 Prozent Hemmung durch 500mIU/ml erzielt.

Abb. 30: Dosis-Wirkungskurve derHemmung der A Toxizität durch Desulfatierung der PC12 Zelloberfläche. Nach Inkubation der PC12 Zellen (1000 Zellen/µl) mit Sulfatase in den angegebenen Dosen wurden die Zellen 1:10 in Medium verdünnt und die A Toxizität gemessen. Für alle Datenpunkte wurden mindestens drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt (* für p<0,05; ** für p<0,01: gepaarter t-Test).

Dies bestätigt die Ergebnisse aus Abb. 29, wenngleich der Effekt nicht so ausgeprägt war. Grund dafür könnte sein, daß die Enzymdosis noch nicht ausgereizt war, was auch der

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Für Abb. 29 und 30 zusammengefaßt bedeutet dies, daß ein sulfatiertes Zelloberflächenmolekül A Toxizität in der PC12 Zelle vermittelt.

4.5. Kohlenhydrate der PC12 Zelle und -Amyloid Toxizität

Von den drei Möglichkeiten der zellulären Sulfatierung (siehe oben) wurde die der Tyrosinsulfatierung für weitere Studien aus zwei Gründen außer Acht gelassen. Wie bereits gezeigt wurde, sind Kohlenhydrate für die Bindung von A an die Zellmembran nötig, können A binden und so A-Toxizität hemmen.

Kohlenhydrate sind entweder N- oder O-glykosidisch mit Asparagin bzw. Serin/Threonin an Glykoproteinen oder an Glykolipde gekoppelt. Die verschiedenen Verbindungen unterscheiden sich außerdem durch den ersten Zucker der Kohlenhydratkette (siehe Tabelle 2).

Tabelle 2: Übersicht der verankernden Monosaccharide der verschiedenen Glykosylierungsformen.

Glykoprodukt			Ankersaccharid
N-Glykosyliertes Protein			-GalNAz
O-Glykosyliertes Protein
	Nicht-GAG		-GalNAz
	GAG
		Heparan Sulfat	-Xyl
		Chondroitin Sulfat	-Xyl
		Dermatan Sulfat	-Xyl
		Keratan Sulfat	-GalNAz
			-GlcNAz
Glykolipid			-Glu

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Bestimmte modifizierte Monosaccharide sind in der Lage, die Glykosylierung von Lipiden und Proteinen im Golgiapparat zu hemmen, indem sie mit dem Verankerungssaccharid kompetitieren. Sie dienen als Substrat für die Synthese der entsprechenden Kohlenhydratkette, können aber aufgrund einer Modifikation nicht mit dem Protein- bzw. Lipidgrundgerüst verbunden werden. So ist z.B. para-Nitrophenyl--D-Xylopyranosid (pNP--Xyl) in der Lage, die Kopplung von Glykosaminoglykanen (GAG) (Heparan Sulfat, Chondroitin Sulfat und Dermatan Sulfat) an das Proteingrundgerüst spezifisch zu verhindern (Rapraeger, 1989 ). Dasselbe gilt für pNP--GalNAc und die Synthese von O-glykosylierten nicht-GAG Glykoproteinen (Kuan et al., 1989 ). Für Glykolipide haben sich pNP--Xyl und pNP--Xyl durch die Hemmung der Glukosylceramidsynthese als wirksam herausgestellt (Freeze et al., 1993 ).

Aus Abb. 31 ist ersichtlich, daß die Vorinkubation von PC12 Zellen mit pNP--Xyl einen dosisabhängigen und fast vollständigen Block der A-Toxizität hervorrief. Dies läßt sich gut mit den Daten von Rapraeger (1989) in Einklang bringen, der fand, daß pNP--Xyl die Heparan Sulfat Synthese im Bereich 0,5-5mM hemmt.

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Abb. 31: Dosis-Wirkungskurve der Hemmung der Toxizität von A durch Hemmung der zellulären Glykosaminoglykan-Glykosylierung durch para-Nitro--D-Xylopyranosid (pNP--Xyl). pNP--Xyl wurde in den angegebenen Dosen für 20 Stunden ins Medium der PC12 Zellen gegeben. Dann wurde die A Toxizität gemessen. Für alle Datenpunkte wurden mindestens drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt (* für p<0,05; ** für p<0,01: gepaarter t-Test).

Die Spezifität der Synthesehemmung mit pNP--Xyl wurde dadurch überprüft, daß alle anderen pNP-modifizierte Monosaccharide, die ein Ankersaccharid darstellen können (siehe Tabelle 2), auf ihre Wirkung bezüglich der A Toxizität überprüft wurden. Erwartungsgemäß war keines außer pNP--Xyl in der Lage, die A Toxizität zu hemmen (Abb. 32).

Abb. 32: Einfluß verschiedener pNP-Monosaccharide auf die A Toxizität. pNP-Monosaccharide wurden in einer Konzentration von 4mM für 4 Stunden ins Medium der PC12 Zellen gegeben. Dann wurde die A Toxizität gemessen. Für alle Datenpunkte wurden mindestens drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt (* für p<0,05; ** für p<0,01: gepaarter t-Test).

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Um auszuschließen, daß die Hemmung der A-Toxizität dadurch zustande kommt, daß unter der pNP--Xyl Inkubation vermehrt GAG-Ketten ins Medium abgegeben werden und diese A binden, wurden die Medien der pNP--Xyl behandelten und unhandelten Zellen ausgetauscht und anschließend A zugegeben. Abb. 33 zeigt, daß der Effekt von pNP--Xyl auf die A Toxizität eindeutig auf die fehlenden GAG auf der PC12 Zellmembran zurückzuführen ist.

Abb. 33: Effekt auf die A Toxizität durch: pNP--Xyl Vorinkubation der PC12 Zellen ohne Mediumtausch (Zell+Med), Zellkulturmedium von pNP--Xyl vorinkubierten Zellen auf unbehandelten PC12 Zellen (Med), und Zellkulturmedium von unbehandelten PC12 Zellen auf pNP--Xyl vorinkubierten PC12 Zellen (Zell). pNP--Xyl wurde in einer Konzentration von 4mM für 20 Stunden zu den PC12 Zellen ins Medium gegeben. Dann wurde die entsprechenden Medien ausgetauscht und die A-Toxizität gemessen. Für alle Datenpunkte wurden mindestens drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt (* für p<0,05; ** für p<0,01: gepaarter t-Test).

Für Abb. 29-33 bedeutet dies, daß die Kohlenhydrate, die die A Toxizität auf der Zellmembran der PC12 Zelle vermitteln, vom Typ der Glykosaminoglykane (GAG) sind, und zwar Heparan Sulfat, Chondroitin Sulfat oder Dermatan Sulfat, da diese über -Xylose an ihr Trägerprotein gekoppelt sind.

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Für alle drei GAG gibt es spezifische Enzyme, die im folgenden dazu eingesetzt wurden, jeweils eines davon von der PC12 Zelloberfläche zu entfernen. Abb. 34 zeigt, daß Vorinkubation der PC12 Zellen mit Chondroitinase, Dermatanase und Keratanase ohne Effekt blieben, während Heparinase eine Reduktion der A Toxizität von zirka 30 Prozent brachte. Daß dieser Effekt nicht vollständig war, kann, wie bereits für Sulfatase erläutert, an der mangelnden Zugänglichkeit der Zelloberfläche für das Enzym oder an der raschen Neusynthese nach Nachlassen der Enzymwirkung liegen. Außerdem ist Heparinase nicht in der Lage, jede glykosidische Bindung innerhalb von Heparan Sulfat zu lösen (Nader et al., 1987). Das Ergebnis diese Experiments bestätigt jedoch, daß ein GAG (HS) tatsächlich A Toxizität in der PC12 Zelle vermittelt, und zeigt, daß von den verschiedenen GAGen ausschließlich Heparan Sulfat für eine Vermittlung der A-Toxizität auf PC12 Zellen in Frage kommt. Dies wurde bereits durch die höchste A Affinität von Heparan Sulfat im Vergleich zu den anderen GAG bei Zugabe ins Zellkulturmedium) angedeutet Tabelle 1).

Abb. 34: Effekt enzymatischer Abspaltung verschiedener Glykosaminoglykane von der PC12 Zelloberfläche auf die A Toxizität. Nach Inkubation der PC12 Zellen (1000 Zellen/µl) mit Chondroitinase/Dermatanase (C'ase/D'ase, 666mIU/ml), Heparinase (H'ase, 133mIU/ml), oder Keratanase (K'ase, 75mIU/ml) wurden die Zellen 1:10 in Medium verdünnt, und die A Toxizität gemessen. Für alle Datenpunkte wurden mindestens drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt (* für p<0,05; ** für p<0,01: gepaarter t-Test).

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Da 99 Prozent der Glykoprotein-Kohlenhydrate in PC12 Membranen (90 Prozent im Gehirn) N-glykosidisch verknüpft sind (Margolis et al., 1983 ), und gute technische Voraussetzungen dafür vorhanden sind, wurde trotz der negativen Ergebnisse mit pNP--GalNAz und der fast vollständigen Hemmung der A Toxizität mit Hemmstoffen der Sulfatierung und Proteoglykansynthese nochmals der Einfluß von N-Glykosylierung auf die A-Toxizität getestet. Wie aus Abb. 34 hervorgeht, hat weder eine Synthesehemmung noch Entfernung von oberflächlichen N-glykosylierten Kohlenhydraten einen Effekt auf die A Toxizität.

Abb. 35: Effekt der Hemmung der zellulären N-Glykosylierung durch Tunikamyzin (Tun, 1µg/ml) oder enzymatischer Abspaltung N-glykosylierter Kohlenhydrate durch N-Glykanase (N-Gly'ase, 333mIU/ml) von der PC12 Zelloberfläche auf die A Toxizität. Nach Inkubation der PC12 Zellen (100 Zellen/µl) mit Tunikamyzin, oder nach Inkubation der PC12 Zellen (1000 Zellen/µl) mit N-Glykanase und 1:10 Verdünnung in Medium, wurde die A Toxizität gemessen. Für alle Datenpunkte wurden mindestens drei Experimente in Vierfachbestimmung durchgeführt (* für p<0,05; ** für p<0,01: gepaarter t-Test).

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Aus den in Abb. 29-35 gezeigten Ergebnissen kann man folgern, daß Heparan Sulfat, nicht aber andere GAG oder andere Kohlenhydrate auf der Zelloberfläche der PC12 Zelle, A-Toxizität vermittelt.

4.6. Membranverankerung des PC12 Rezeptors für -Amyloid

Zwei Familien von zellmembranverankerten Heparan Sulfaten sind bekannt, Syndekane und Glypikane. Sie unterscheiden sich in ihrem Proteingrundgerüst, was u.a. eine unterschiedliche Membranverankerung zur Folge hat. Syndekane sind integrale Membranproteine mit einer membranspannenden Domäne, während der Proteinanteil der Glypikane über einen Glykosylphosphatidylinositol-Anker an ein membranspannendes Lipid gekoppelt ist (siehe Einleitung). Diesen Unterschied habe ich mir für eine weitere und letzte Differenzierung zunutze gemacht.

Abb. 36: Effekt unspezifischer enzymatischer Abspaltung von Protein durch Trypsin (Trp; 60IU/ml, 3000 Zellen/µl) oder spezifischer enzymatischer Abspaltung

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Das Enzym Phosphatidylinositol-spezifische Phospholipase C (PIPLC) spaltet spezifisch Glykosylphosphatidylinositol-Anker und zeigte einen Effekt von fast 40% Hemmung der A-Toxizität (Abb. 36). Da andere enzymatische Zelloberflächenbehandlungen in unseren Experimenten keinen größeren Effekt erzielten (Abb. 30 und 34) und selbst eine grobe Behandlung der Zelloberfläche mit Trypsin bei nur 60% lag, kann man von einer Beteiligung von Glypikan und nicht Syndekan bei der Vermittlung der A-Toxizität in der PC12 Zelle ausgehen, zumal das vorherrschende Heparan Sulfat in diesem Zelltyp eine Größe von 65 kD im Western Blot hat, was der Größe von Glypikan entspricht (Gowda et al., 1989 ). Obwohl auch andere GPI-verankerte Proteine abgespalten werden, bestätigt der Effekt von PIPLC die bisherigen Ergebnisse einer Beteiligung von Heparan Sulfat bei der A-Toxizität.

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