Molekulare Charakterisierung der -Thalassämie bei Probanden deutscher Herkunft

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor medicinae
(Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von

Frau Claudia Schwarz-Muche ,
geb. am 08. September 1970 in Erfurt

Dekan: Prof. Dr. med. M. Dietel

Gutachter:
Prof. A. E. Kulozik (Charité, Campus Virchow-Klinikum, Kinderklinik)
Prof. Sperling (Charité, Campus Virchow-Klinikum, Genetik)
Prof. E. Kohne (Universitätsklinikum Ulm, Kinderklinik)

Datum der Einreichung: 31.03.1998

Datum der mündlichen Prüfung: 26.10.1998

Zusammenfassung

Die -Thalassämie gehört weltweit zu den häufigsten monogenen Erbkrankheiten. Die Thalassämien treten endemisch in der Bevölkerung des Mittelmeerraumes, in Westafrika und in weiten Teilen Asiens auf. In der einheimischen Bevölkerung der Bundesrepublik Deutschland gehört die homozygote Form der -Thalassämie zu den seltenen Erkrankungen. Häufiger ist das Auftreten der heterozygoten Form, die als Differentialdiagnose der mikrozytären, hypochromen Anämie eine besondere Rolle spielt. Blutproben von 214 deutschen Personen mit einer heterozygoten -Thalassämie wurden mittels Allel-spezifischer Oligonukleotid-Hybridisierung, Restriktionsanalyse und direkter Sequenzierung PCR-amplifizierter DNA analysiert. Insgesamt konnten 96,3 % (206/214) der Proben molekular charakterisiert werden. Die mediterranen Mutationen stellen einen Anteil von etwa 2/3 aller identifizierten Veränderungen, häufig sind insbesondere NS 39, IVS1-110 G A und IVS1-1 G A. Das übrige Mutationsspektrum setzt sich aus sehr seltenen Mutationen (IVS1-1 G T, IVS1-2 T G, IVS1-2 T C, NS 15 G A, NS 121 G T, FS 8/9 +G, FS 44 -C, FS 51 -C, FS 82/83 -G, Initiations-Kodon-Mutationen ATG ACG/ GTG/ ATA) und einer neuen Mutation (IVS1-129 A G) zusammen. In 6 Fällen konnte nach vollständiger molekularer Analyse kein Gendefekt als Ursache der -Thalassämie gefunden werden. Diese Probanden könnten -Thalassämiedeterminanten tragen, die nicht an den -Globingen-Komplex gekoppelt sind oder regulative Sequenzen außerhalb des -Globingens darstellen. Die erhobenen Daten zeigen, daß der Ursprung der -Thalassämie in der deutschen Bevölkerung in den Mittelmeerländern liegt, ein Drittel der Fälle scheint sich jedoch lokal entwickelt zu haben.

Schlagwörter:
-Thalassämie, Deutschland, -Globingen-Mutationen, Genotyp-Phänotyp-Korrelation

Abstract

The -thalassemia belongs to the most common monogenic disorders worldwide. Endemically in the Mediterranean population, some parts of Asia and Western Africa, -thalassemia is a rare disease in Germany. Nevertheless, heterozygous forms of -thalassemia minor occur more frequently in the German population and should be considered in the differential diagnosis of hypochromic anemia. To investigate the molecular biological background of -thalassemia in Germany, 214 non-immigrant German individuals suffering from heterozygous -thalassemia were characterized by allele-specific oligonucleotid hybridization, restriction analysis and sequencing of the -globin gene. By these techniques, 26 different mutations were identified. Most frequently, the Mediterranean mutations NS 39, IVS1-110 G A, and IVS1-1 G A were detected. Although otherwise rare, the frameshift mutation of codon 83 (FS 83 -G) was also relatively common (5 %) in the analyzed population. Other previously described mutations (IVS1-1 G T, IVS1-2 T G, IVS1-2 T C, NS 15 G A, NS 121 G T, FS 8/9 +G, FS 44 -C, FS 51 -C, initiation codon mutation ATG ACG/ GTG/ ATA) were demonstrated in < 10 individuals. Interestingly, sequence analysis identified a novel mutation affecting position -2 of the splice acceptor site (IVS1-129 A G). In 6 individuals diagnosed as heterozygous -thalassemia, a mutation of the -globin gene could not be demonstrated. The data indicate the -thalassemia to be introduced from the Mediterranean population into Germans in two-thirds of the cases whereas the remaining third probably is of local origin.

Keywords:
-thalassemia, Germany, -globin gene mutations, genotype-phenotype-correlation

Inhaltsverzeichnis
Titelseite	Molekulare Charakterisierung der -Thalassämie bei Probanden deutscher Herkunft
Abkürzungsverzeichnis	Abkürzungsverzeichnis
1	Einleitung und Problemstellung
1.1.	Überblick
1.1.1.	Historisches
1.1.2.	Struktur und Funktion des normalen und anomalen Hämoglobins
1.1.2.1.	Ontogenese des Hämoglobins
1.1.2.2.	Molekulare Anatomie und Physiologie des -Globingen-Komplexes
1.1.2.3.	Molekulare Pathologie
1.1.3.	Klinisches Bild, Diagnostik und Therapie der -Thalassämie
1.1.3.1.	Pathophysiologie der -Thalassämie
1.1.3.2.	Klinisches Bild
1.1.3.3.	Diagnostik
1.1.3.4.	Therapie
1.1.3.4.1.	Konventionelle Behandlungsverfahren
1.1.3.4.2.	Neue Strategien der Therapie: Supportiv und kurativ.
1.1.4.	Geographische Verteilung der Erkrankung und populations-genetische Aspekte
1.1.5.	Die -Thalassämie in der deutschen Bevölkerung
1.2.	Problemstellung
2	Material und Methoden
2.1.	Untersuchungsmaterial
2.1.1.	Untersuchungsmaterial
2.1.2.	Auswahl der Probanden
2.1.3.	Geräte
2.1.4.	Chemikalien
2.2.	Methoden
2.2.1.	DNA-Extraktion
2.2.2.	PCR
2.2.2.1.	Prinzip der Methode
2.2.2.2.	Primerauswahl
2.2.2.3.	PCR-Optimierung
2.2.2.4.	Agarosegelelektrophorese
2.2.3.	Allel-spezifische Oligonukleotid-Hybridisierung
2.2.3.1.	Prinzip der Methode
2.2.3.2.	Markierung der Oligonukleotide
2.2.3.3.	Blotting
2.2.3.4.	Hybridisierung
2.2.3.5.	Waschen der Filter
2.2.3.6.	Detektion
2.2.3.6.1.	Prinzip der Detektion
2.2.4.	Sequenzierung
2.2.4.1.	Sequenzierung nach der Didesoxymethode
2.2.4.2.	PCR mit biotinmarkierten Primern
2.2.4.3.	Sequenzierung einzelsträngiger DNA mit der T7-Polymerase
2.2.5.	Restriktionsanalyse
3	Ergebnisse
3.1.	Screening auf häufige -Thalassämie-Mutationen der Endemiegebiete
3.1.1.	Auswahlkriterien
3.1.2.	ASO und Restriktionsverdau
3.1.3.	Häufigkeiten der Mutationen bei Probanden deutscher Herkunft
3.2.	Identifikation seltener -Thalassämie Mutationen
3.2.1.	Sequenzanalyse
3.2.2.	Seltene Mutationen und ihre Häufigkeiten in der einheimischen deutschen Bevölkerung
3.3.	Identifizierung einer seltenen und einer neuen Mutation
3.3.1.	Restriktionsanalyse
3.3.2.	Darstellung eines ungewöhnlichen Restriktionsmusters nach DdeI-Verdau
3.3.3.	Nachweis der Mutationen mittels Sequenzanalyse
3.3.4.	IVS1-129 A G: Eine neue Mutation.
3.4.	Zusammenfassung aller identifizierten Mutationen
4	Diskussion
4.1.	Die -Thalassämie in der einheimischen deutschen Bevölkerung
4.1.1.	Vergleich zwischen dem Mutationsspektrum in der einheimischen deutschen Bevölkerung und anderen Populationen der Nicht-Endemie-gebiete
4.2.	Seltene -Thalassämie-Gene
4.2.1.	Die Frameshift-Mutation am Übergang vom Kodon 82/83.
4.2.2.	Die Nonsense-Mutation im Kodon 121.
4.3.	Die neue IVS1-129 A G-Mutation
4.4.	-Thalassämie ohne Mutation im -Globingen
5	Zusammenfassung und Thesen
5.1.	Zusammenfassung
5.2.	Thesen
Bibliographie	Literaturverzeichnis
Danksagung
Selbständigkeitserklärung
Lebenslauf
Anhang A	Publikationen

Tabellenverzeichnis
Tab. 1:	Die physiologischen menschlichen Hämoglobine, nach Weatherall & Clegg, 1981.
Tab. 2:	Durch -Thalassämiemutationen gestörte Schritte der Genexpression, modifiziert nach Kulozik, 1991c.
Tab. 3:	Hämatologische Daten zur Diagnosesicherung, modifiziert nach Galanello et al., 1981.
Tab. 4:	Ergebnisse des Zentrums für KMT; Pesaro, Italien [Giardini et al., 1995]. (1 retrospektive Zuordnung zur Klasse III, 2 prospektive Zuordnung zur Klasse III)
Tab. 5:	Geographische Heterogenität der molekularen Anatomie der -Thalassämie, modifiziert nach Kulozik, 1991c.
Tab. 6:	Empirisch ermittelte Hybridisierungs- und Waschtemperaturen für ASO-Filter.
Tab. 7:	ASO-Screening deutscher Heterozygoter auf häufige -Thalassämie-Mutationen der Endemiegebiete.
Tab. 8:	Darstellung der ASO-Ergebnisse bei Probanden deutscher Abstammung im Vergleich zur Häufigkeit der -Thalassämie-Mutationen in der italienischen Bevölkerung. (1 [Rosatelli et al., 1992]; 2 ohne Angabe)
Tab. 9:	Mittels Sequenzanalyse identifizierte Mutationen.
Tab. 10:	Gesamtübersicht aller identifizierten Mutationen.
Tab. 11:	Genotypenkonstellation der Thalassaemia intermedia in der einheimischen britischen Bevölkerung, modifiziert nach Hall et al., 1992
Tab. 12:	Übersicht der bisher veröffentlichten NS 121 G T-Mutationen. (1 ohne Angabe; 2 nur Splenomegalie; 3 11 Mitglieder aus 3 Familien)
Tab. 13:	Übersicht der bisher identifizierten Mutationen des 3´ AG-Spleißakzeptors.

Abbildungsverzeichnis
Abb. 1:	Die Präsenz verschiedener Polypeptidketten während der Ontogenese, modifiziert nach Weatherall & Clegg, 1981.
Abb. 2:	Schematische Darstellung der Pathogenese der -Thalassämie, modifiziert nach Kulozik, 1991c.
Abb. 3:	Sequenzierung nach der Didesoxymethode, modifiziert nach Wink & Wehrle, 1994.
Abb. 4:	PCR mit biotinmarkierten Primern, modifiziert nach Wink & Wehrle, 1994.
Abb. 5:	Sequenzierprimer.
Abb. 6:	Darstellung PCR-amplifizierter DNA auf einem Ethidiumbromid gefärbten 1,5 %igen Agarosegel. Links: Amplifikate mit einer Länge von 863 bp (1-5), Negativkontrolle (K), Marker X 174 HAE III (M). Rechts: Amplifikate mit einer Länge von 623 bp (1-3), Negativkontrolle (K), Marker X 174 HAE III (M).
Abb. 7:	DdeI-Verdau PCR-amplifizierter DNA zum Nachweis der FS 6 -A-Mutation. Durch den Basenverlust (-A) im Kodon 6 ist die Erkennungssequenz CTNAG für das Restriktionsenzym DdeI nicht mehr vorhanden. Entsprechend entsteht ein längeres Fragment von 381 bp wie bei der Sichelzellmutation. Die Sichelzellmutation befindet sich ebenfalls im Kodon 6 des -Globingens, hat jedoch den Austausch des Adenins durch ein Thymin zur Folge. A dokumentiert den relevanten Teil des -Globingens mit den als Winkelpfeile dargestellten PCR-Primern und den Restriktionsstellen des Enzyms DdeI (). Gleichzeitig werden die Veränderungen des Restriktionsmusters durch die FS 6- A-Mutation (T, ) markiert. B zeigt ein Ethidiumbromid gefärbtes Agarosegel mit DdeI verdauten PCR-Fragmenten. Die Spuren enthalten von links nach rechts: zwei heterozygote Probanden für dei FS 6 -A-Mutation (AT), die Kontroll-DNA eines Gesunden (AA), einen an Sichelzellanämie homozygot Erkrankten (SS), unverdaute DNA (U) und den Marker X 174 HAE III (M).
Abb 8:	DNA-Sequenz des humanen -Globingens einschließlich Lokalisation der 11 ausgewählten Mutationen für das ASO-Screening.
Abb. 9:	Allel-spezifische Oligonukleotid-Hybridisierung zum Nachweis der Mutationen im -Globingen. PCR-amplifizierte -Globingen-Fragmente von deutschen Probanden mit einer heterozygoten -Thalassämie wurden als Dot-Blot auf einer Nylonmembran fixiert. Der Wildtypfilter hybridisiert mit dem Wildtyp-Oligonukleotid; der Mutationsfilter mit dem Oligonukleotid, welches die Mutation trägt. Bei "Wt" und "M" handelt es sich um Kontrollproben mit den jeweiligen Wildtypsequenzen oder Mutationen. A: Proben 1, 2 und 6 hinterlassen jeweils ein Signal auf dem Wildtyp- und dem Mutationsfilter. Per definitionem erfüllen sie damit das Kriterium, heterozygot für die Nonsense-Mutation im Kodon 39 C T zu sein. B: Probe 1 hinterläßt jeweils ein Signal auf dem Wildtyp- und dem Mutationsfilter und ist somit heterozygot für den G A-Basenaustausch an Position 110 des ersten Introns.
Abb. 10:	Allel-spezifische Oligonukleotid-Hybridisierung zum Nachweis der IVS1-1 G A-Mutation. PCR amplifizierte -Globingen-Fragmente von deutschen Probanden mit einer heterozygoten -Thalassämie wurden als Dot-Blot auf einer Nylonmembran fixiert. Der Wildtypfilter hybridisiert mit dem Wildtyp-Oligonukleotid; der Mutationsfilter mit dem Oligonukleotid, welches die Mutation trägt. Bei "Wt" und "M" handelt es sich um Kontrollproben mit den jeweiligen Wildtypsequenzen oder Mutationen. Probe 6 hinterläßt jeweils ein Signal auf dem Wildtyp- und dem Mutationsfilter und ist heterozygot für den GA-Basenaustausch an Position 1 des ersten Introns.
Abb. 11:	Sequenzierung PCR-amplifizierter DNA zur direkten Diagnose einer -Thalassämie. An Position -87 wird das Cytosin durch ein Guanin ersetzt. Der Basenaustausch betrifft das proximale CACCC -Promotorelement. Die Sequenzierung zeigt hier sowohl das normale C als auch die Mutation (Pfeil), die sich nur auf einem Allel befindet. Das andere Allel ist gesund. Der Proband ist heterozygot für die Mutation an Position -87.
Abb. 12:	Sequenzierung PCR-amplifizierter DNA zur direkten Diagnose einer -Thalassämie. An Position 705 des zweiten Introns wird das Thymin durch ein Guanin ersetzt, wodurch eine neue 5` Spleißsequenz entsteht. Die Sequenzierung zeigt hier sowohl das normale T als auch die Mutation (Pfeil), die sich nur auf einem Allel befindet. Das andere Allel ist gesund. Der Proband ist heterozygot für die IVS2-705 TG-Mutation.
Abb. 13:	Sequenzierung PCR-amplifizierter DNA zur direkten Diagnose einer -Thalassämie. Durch den G zu T-Basenaustausch im Kodon 121 des -Globingens entsteht das Stopkodon TAA. Basensubstitutionen, die einen vorzeitigen Stop der Translation verursachen, bezeichnet man als Nonsense-Mutationen. Die Sequenzierung zeigt hier sowohl das normale G als auch die Mutation (Pfeil), die sich nur auf einem Allel befindet. Das andere Allel ist nicht betroffen. Der Proband ist heterozygot für die Nonsense-Mutation im Kodon 121 (G T).
Abb. 14:	Durch den Verlust eines Guanins am Übergang vom Kodon 82/83, entsteht eine Frameshift-Mutation. Hier ist das typische Nukleotidmuster eines heterozygot betroffenen Probanden festgehalten, dem nur auf einem Allel das Guanin fehlt. Dieser Umstand läßt die Nukleotidabfolge beider Allele gegeneinander verschieben, sodaß sich an manchen Positionen zwei Basen auf gleicher Höhe befinden.
Abb. 15:	Sequenzierung PCR-amplifizierter DNA zur direkten Diagnose einer -Thalassämie. Der Ersatz eines Adenins durch ein Guanin verändert die normale Sequenz des Initiationskodons ATG. Die Initiation der Translation wird verhindert. Die Sequenzierung zeigt hier sowohl das normale A als auch die Mutation (Pfeil), die sich nur auf einem Allel befindet. Das andere Allel ist nicht mutiert. Der Proband ist heterozygot für diese genetische Veränderung.
Abb. 16:	Restriktionsanalyse PCR-amplifizierter DNA am Beispiel der Sichelzellmutation sowie zweier -Thalassämiemutation am Übergang von Intron 1 zu Exon 2. A dokumentiert den relevanten Teil des -Globingens mit den als Winkelpfeile dargestellten PCR-Primern und Restriktionsstellen des Enzyms DdeI (). Gleichzeitig werden die Veränderungen des Restriktionsmusters durch die Sichelzell-Krankheit (S,) und der IVS1-130 G C bzw. IVS1-129 G A (T,) markiert. zeigt ein Ethidiumbromid gefärbtes Agarosegel mit DdeI-verdauten PCR-Fragmenten. Die Spuren beinhalten von links nach rechts: Marker X 174 HAE III (M), unverdautes PCR-Fragment (U), Kontroll-DNA eines Gesunden (AA), einen homozygoten (SS) und einen heterozygoten (AS) Träger einer Sichelzellmutation, einen heterozygoten Träger der IVS1-129 A G (1), einen Homozygoten (2) und zwei Heterozygote (3, 4) für die IVS1-130 G C-Mutation.
Abb. 17:	Ausschnitt des -Globingens mit DdeI-Schnittstelle am Übergang von Intron 1 zu Exon 2 (Position IVS1-126-130).
Abb. 18:	Gegenüberstellung der G C-Mutation an Position 130 und der A G-Mutation an Position 129 des ersten Introns. Diese Mutationen beeinträchtigen über die Veränderung des AG-Spleißakzeptors die Effektivität des Spleißvorganges. Beide Probanden tragen die dargestellten Sequenzänderungen im -Globingen auf einem Allel und sind somit heterozygot für die entsprechende -Thalassämie-Mutation.
Abb. 19:	Sequenzierung PCR-amplifizierter DNA zur direkten Diagnose einer -Thalassämie. Der A zu G-Basenaustausch an Position 129 des ersten Introns betrifft den AG-Spleißakzeptor am Übergang von Intron 1 zu Exon 2. Die Sequenzierung zeigt hier sowohl das normale A als auch die Mutation (Pfeil), die sich nur auf einem Allel befindet. Das andere Allel ist nicht mutiert. Der Proband ist heterozygot für diese genetische Veränderung.
Abb. 20:	Modell des Spleißvorgangs, modifiziert nach Lewis, 1994.

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