Schwarz-Muche, Claudia: Molekulare Charakterisierung der -Thalassämie bei Probanden deutscher Herkunft



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Kapitel 1. Einleitung und Problemstellung

1.1. Überblick

1.1.1. Historisches

Die erste Beschreibung der beta-Thalassämie geht auf Thomas B. Cooley aus Detroit zurück. Seine Beobachtungen veröffentlichte er 1925 unter dem Titel “A Series of Cases of Splenomegaly in Children, with Anemia and peculiar Bone Changes". Der Erstbeschreiber ging davon aus, daß es sich zwar um eine angeborene, jedoch nicht um eine vererbbare Erkrankung handelt. Der Begriff ”Thalassämie“ wurde 1932 durch Whipple und Bradford das erste Mal benutzt [Weatherall & Clegg, 1981]. Das Wort ist dem griechischen ”thalassa“, das Meer, entlehnt und spiegelt das häufige Vorkommen dieser Erkrankung in den Ländern des Mittelmeerraumes wider. Erst 1938 publizierte der griechische Arzt Caminopetros, daß die Thalassämien genetisch determinierte Erkrankungen sind.

1959 lieferten Ingram und Stretton ihr Modell der genetischen Basis der Thalassämien und zeigten, daß es zwei Hauptklassen der Thalassämien gibt, die alpha- und beta-Thalassämie. Kurz darauf konnte die komplette Aminosäurensequenz für die alpha-, beta- und gamma-Ketten des Hämoglobins bestimmt werden [Kacian et al., 1973].

In den darauffolgenden Jahren wurde deutlich, daß es sich um eine heterogene Gruppe genetischer Erkrankungen handelt, deren Existenz sich nicht auf die mediterrane Region beschränkt. Die Entdeckung des Enzyms Reverse Transkriptase spielte eine Vorreiterrolle auf dem Weg zur molekularen Charakterisierung der Thalassämien. Somit war die Möglichkeit gegeben, die mRNA von Thalassämiepatienten mittels molekularer Hybridisierung zu analysieren und zu erkennen, daß die Erkrankungen auf einer verringerten Globin-mRNA-Produktion basieren. [Housman et al., 1973].

1.1.2. Struktur und Funktion des normalen und anomalen Hämoglobins

Das Hämoglobin ist ein tetrameres Protein, bestehend aus 2 Paaren von 4 Globinketten mit je einer Farbstoffkomponente, dem Häm. Das Molekulargewicht beträgt ca. 64.500. Je 2 Globinketten sind identisch und ihr Vorkommen ist abhängig vom Entwicklungsalter (Tab. 1). So wird das adulte Hämoglobin aus 2 alpha-Ketten mit je 141 Aminosäuren und 2 beta-Ketten aus je 146 Aminosäuren gebildet.

Tab. 1: Die physiologischen menschlichen Hämoglobine, nach Weatherall & Clegg, 1981.

Namenskürzel

Globinketten

Vorkommen

HbA

alpha2beta2

\|[ap ]\|97 % des normalen Hb des Erwachsenen

HbA2

alpha2delta2

\|[ap ]\| 2,5 % des normalen Hb beim Erwachsenen

HbF

alpha2gamma2

fetales Hb, \|[ap ]\| 0,5 % beim Erwachsenen

Hb Gower-1

zeta2epsilon2

Embryonales Hb

Hb Gower-2

alpha2epsilon2

Embryonales Hb

Hb Portland

zeta2gamma2

Embryonales Hb


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Die Hauptfunktion des Hämoglobins besteht im Transport des Sauerstoffs aus der Lunge in die Gewebe, der sich reversibel an das Häm bindet. Um die Effizienz dieses Transportes bestimmen zu können, bedient man sich der Sauerstoffbindungskurve und ermittelt den P50 (Wert, bei dem 50 % des Sauerstoffs gebunden vorliegen). Der normale Wert bei pH 7,4 und 37° liegt um 26 mmHg. Im typischen sigmoiden Verlauf der O2-Bindungskurve eines tetrameren Hämoglobins kommt die veränderte O2-Affinität bei verschiedenen Sauerstoffdrücken zum Ausdruck. Sie reflektiert die Kooperativität der Untereinheiten, die einerseits von der heterotetrameren Struktur des Hämoglobins und andererseits von den intramolekularen strukturellen Veränderungen abhängig sind, die während der Oxygenation und Desoxygenation ablaufen.

Faktoren wie Temperatur, pH, pCO2, 2,3 Diphosphoglyzerat (DPG) und der Austausch von Aminosäuren können die O2-Affinität charakteristisch verändern. Dabei kommt dem 2,3 DPG eine Sonderrolle zu. Das auf einem Nebenweg der Erythrozyten-Glykolyse entstehende Produkt [Rapoport et al., 1968], hat die Eigenschaft, sich bevorzugt an die beta-Ketten des Hb zu binden und dadurch Einfluß auf O2-Aufnahme und -Abgabe zu nehmen. Durch Anlagerung des 2,3 DPG an das desoxygenierte Hb-Molekül wird die O2-Affinität herabgesetzt. Das erleichtert die O2-Abgabe in die periphere Zirkulation und gewährleistet eine bessere O2-Versorgung des Gewebes [Benesch & Benesch, 1969; Perutz, 1970]. Über die Struktur-und Funktionsbeziehungen ist folgendes bekannt: Im reduzierten Hämoglobin haben sich die beiden beta-Globinketten soweit voneinander entfernt, daß das 2,3 DPG genau in diese Lücke paßt, durch seine Bindung an die Proteinstrukturen die Desoxyform stabilisiert und dadurch die O2-Affinität herabsetzt. Das HbF (alpha2gamma2) unterscheidet sich vom HbA durch seine verminderte 2,3 DPG-Bindungsfähigkeit, wodurch die O2-Affinität der fetalen Erythrozyten steigt. Das weniger ausgeprägte Bindungsvermögen des HbF für 2,3 DPG ermöglicht deshalb einen optimalen O2-Transfer vom mütterlichen zum fetalen Organismus [Bauer et al., 1968; Benesch & Benesch, 1969].

Durch Austausch einer Aminosäure innerhalb der Globinkette kann die Löslichkeit (z.B. HbS [beta6 GlurarrVal]), Stabilität (z.B. Hb Köln [beta98 ValrarrMet]) oder die O2-Affinität (selten, z. B. Hb Kansas [beta102 AsnrarrThr]) des Hämoglobins verändert werden. Solche Abweichungen werden durch sogenannte Missense-Mutationen hervorgerufen und stellen strukturelle Abnormitäten des Hb dar. Nur ein geringer Teil der 693 (März 1996) [Huisman et al., 1996] bekannten Hb-Anomalien gehen mit klinischen Symptomen einher, diese werden Hämoglobinopathien genannt. Anfangs bezeichnete man die verschiedenen anomalen Hämoglobine mit den Großbuchstaben des Alphabets, als die Zahl rasch zunahm, wurde auf den Entdeckungsort bzw. den Geburtsort des Patienten zurückgegriffen. Als häufigste und weitverbreitetste Hämoglobinopathie ist das 1949 von Pauling et al. entdeckte HbS bekannt. Seine molekulare Aufarbeitung zeigte einen Aminosäurenaustausch (Glutaminsäure zu Valin) an Position 6 der beta-Kette.

Die Bezeichnung Hämoglobinopathie erstreckt sich im weiteren Sinne auf Strukturanomalien mit normaler Syntheserate und die Thalassämien mit einer quantitativen Störung der Hämoglobinsynthese. Ein typisches Beispiel für den ambivalenten Gebrauch des Begriffes Hämoglobinopathie ist das HbE (beta26 GlurarrLys). Beim HbE handelt es sich um eine Hämoglobinanomalie durch die Missense-Mutation im Kodon 26, die eine Änderung der Aminosäurensequenz zur Folge hat. Andererseits bewirkt die Aktivierung einer kryptischen Spleißstelle gleichzeitig die Bildung einer qualitativ und quantitativ abnormen mRNA [Orkin et al., 1982 a].


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1.1.2.1. Ontogenese des Hämoglobins

Die embryonalen Hämoglobine werden in der 3.- 8. Schwangerschaftswoche im Dottersack produziert. Um die 8. Woche übernimmt die Leber die Produktion des HbF. Gegen Mitte der Schwangerschaft löst die Milz und dann das Knochenmark die Leber ab und gewährleisten die Bildung der Blutzellen. Ab der 6. Woche nach der Geburt ist das Knochenmark das einzig normale Gewebe der Blutzellenbildung. HbA wird in kleinen Mengen schon sehr früh in der Entwicklung gebildet, so daß es in der 6. SSW 7 % des gesamten Hb ausmacht. Allmählich steigt dann die HbA-Synthese bis zur Geburt an, bis es zu einem plötzlichen Umschalten der bis dahin dominierenden HbF- zur HbA-Synthese kommt. Die Umschaltung von HbF auf HbA ist jedoch erst nach dem 6. Lebensmonat abgeschlossen, der HbF-Spiegel fällt exponentiell, im Alter von 4 Jahren liegt er normalerweise unter 1 %.

Abbildung 1 zeigt das Auftreten der verschiedenen Polypeptidketten während der Ontogenese.

Abb. 1: Die Präsenz verschiedener Polypeptidketten während der Ontogenese, modifiziert nach Weatherall & Clegg, 1981.

1.1.2.2. Molekulare Anatomie und Physiologie des beta-Globingen-Komplexes

Die Globingene werden in zwei Gruppen unterteilt: die alpha-Globingene liegen auf Chromosom 16 und umfassen einen Genkomplex von 50 kb, während die beta-Globingene in einer 60 kb Region auf dem kurzen Arm des Chromosom 11 liegen. Das beta-Globingen selbst ist nur ein Teil des 60 kb Genkomplexes und liegt mit dem embryonalen epsilon-, den fetalen gamma-Globingenen und dem adulten delta-Globin in folgender Anordnung: 5´ -epsilon Ggamma Agamma \|[PSgr ]\|beta delta beta- 3´. Dabei sind die fünf funktionellen Gene in der Reihenfolge angeordnet, in welcher sie während der Ontogenese exprimiert werden.


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Das beta-Globingen ist mit 1,6 kb ein kleines Gen. Die kodierende Information findet sich auf drei Exonen, die durch 2 Introns getrennt sind. Die Funktion der Introns ist im wesentlichen unbekannt. Der ”Kopf“ und der ”Schwanz“ des ersten und dritten Exons bestehen aus nichttranslatierten Sequenzen, die aus diesem Grund den Namen 5´UTR (untranslated region) und 3´UTR tragen [Bunn & Forget, 1986]. Die 5´UTR umfaßt 50 bp und die 3´UTR 131 bp.

Der unmittelbar 5´ vom Transkriptionsbeginn (CAP-Stelle) liegende Promotor reguliert die Genaktivität. Dieser Globingen-Promotor beinhaltet 4 wichtige Sequenzelemente, die essentiell für die Induktion der Transkription und deren Effizienz sind. Das der CAP-Stelle am nächsten liegende Element (26-31 bp upstream) ist die sogenannte TATA-Box, eine AT-reiche Sequenz, die die Stelle der Transkriptionsinitiation determiniert. Weiter 5´ finden sich die konservierte CAAT-Box (72-76 bp upstream vom CAP) und zwei CACCC-Boxen (86-90 bp und 101-105 bp upstream vom CAP), welche die Effizienz der Transkription erhöhen, indem sie der Bindung ubiquitärer und erythroid spezifischer Transkriptionsfaktoren dienen [Ikuta et al., 1996]. Zusätzlich gibt es 5´ vom epsilon-Globingen eine Region, die man als Lokus-Kontroll-Region (LCR) bezeichnet. Die beta-LCR ist charakterisiert durch ein Reihe DNase I-hypersensitiver Stellen, HS1, 2, 3 und 4, verteilt über ca. 15 kb upstream des epsilon-Globingens. Ihre funktionelle Bedeutung wurde deutlich, als es mit ihrer Hilfe gelang, die Expression des menschlichen beta-Globingens gewebespezifisch und zum richtigen ontogenetischen Zeitpunkt in transgenen Mäusen zu induzieren. In Abwesenheit der beta-LCR wurde das menschliche beta-Globingen in vermindertem Maße exprimiert [Grosveld et al., 1987]. Zusätzlich stellte man fest, daß die Bindung spezifischer Proteine notwendig für die Funktion dieser Regionen sind [Ikuta & Kan, 1991]. Nach neuesten Erkenntnissen favorisiert man folgendes Modell: ein chromosomales looping ermöglicht die physische Interaktion der beta-LCR mit dem Globingen-Promotor und erlaubt dadurch die Expression der downstream gelegenen Gene [Orkin, 1995]. Die LCR ist unerläßlich für die Aktivierung des beta-Globingens und spielt gleichzeitig eine wichtige Rolle bei der spezifischen Expression der einzelnen beta-Globingene während der Entwicklung [Ikuta et al., 1996].

Die Genexpression umfaßt mehrere Schritte, wobei der erste die Transkription der DNA in die Vorläufer-RNA (pre-RNA) beinhaltet. Dazu ist die Bindung verschiedener Transkriptionsfaktoren an den Promotor und die LCR notwendig. Liegt das Transkript vor, wird sein 5´-Ende modifiziert, d.h. ein methyliertes Guanosin (CAP) angefügt. Ebenfalls wird das 3´-Ende über das Anfügen einer Reihe von Adenosin-Resten (Poly-A Schwanz) verändert. Dieser Vorgang wird durch ein sogenanntes Poly-A-Signal gesteuert, welches circa 25 bp 5´ vor der Transkriptionstermination lokalisiert ist.

Im Anschluß werden die noch enthaltenen Introns der pre-mRNA herausgeschnitten. Dieser aktive Vorgang wird als Spleißen bezeichnet und läßt eine reife mRNA entstehen, deren einzelne Exone zusammengefügt vorliegen. Der beschriebene Mechanismus erfordert Signalsequenzen an der 5´(Donor) und 3´(Akzeptor) Exon/Intron Grenze sowie innerhalb des Introns. Diese Sequenzen werden als Konsensussequenzen bezeichnet, da sie im Laufe der Evolution konserviert wurden. Der Konsensus an der Donor-Spleißstelle umfaßt 9 Nukleotide, 3 im Exon und 6 im Intron. Position 1 und 2 im Intron werden dabei meist durch ein GT gebildet (splice junction), die anderen Nukleotide sind weniger stringent konserviert und dadurch variabler. Der Konsensus der Akzeptor-Spleißstelle weist regelmäßig ein AG Dinukleotid am 3´-Ende des Introns auf und ein weniger stringent konserviertes Pyrimidin an Position -3 [Mount et al., 1982]. Der Spleißvorgang wird durch ein Ribonukleoprotein-Komplex, das Spleißosom vermittelt [Lewis, 1994]. Die reife mRNA wird ins Zytoplasma transportiert, um dort in Protein translatiert zu werden.


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1.1.2.3. Molekulare Pathologie

Die meisten Formen der beta-Thalassämie sind Punktmutationen des beta-Globingens. Deletionen dahingegen sind selten, spielen jedoch klinisch eine Rolle, wenn sie zur hereditären, postnatal persistierenden HbF-Synthese (HPFH) führen. Es sind mehr als 180 verschiedene Mutationen bekannt, die eine beta-Thalassämie hervorrufen [Baysal & Carver, 1995]. Dabei kann die Expression des beta-Globingens auf jedem Schritt des Weges von der DNA zum Protein gestört werden: (s. auch Tab. 2)

DNA-Ebene

Bei ganz oder teilweise deletiertem beta-Globingens fehlt den betroffenen Chromosomen die genetische Information zur Synthese des beta-Globins. Das klinische Bild ist abhängig von der Aktivität der gamma-Globingene und der damit verbundenen HbF-Synthese. Kleine Deletionen erhöhen die HbF-Produktion nur in geringem Maße oder gar nicht und bewirken im homozygoten Zustand ein schwer verlaufendes Krankheitsbild. Im Gegensatz dazu verursachen größere Deletionen eine HPFH und somit einen milderen Phänotyp [Bunn & Forget, 1986].

Transkriptionsebene

Um eine effiziente Bindung der Transkriptionsfaktoren zu gewährleisten ist ein intakter Promotor Vorraussetzung. Dementsprechend vermindern Punktmutationen wichtiger Promotorsequenzen die Transkriptionseffizienz; sind z. B. die TATA- oder CACCC-Boxen betroffen, beträgt die Restaktivität des Gens noch 20-50 % [Orkin et al., 1984; Antonarakis et al., 1984; Kulozik et al., 1991a]. Diese verbleibende hohe Aktivität läßt einen relativ milden Phänotyp zu (beta++-Thal., dabei stellt das + ein Maß der Restaktivität dar), so daß homozygot betroffene Patienten nicht regelmäßig transfundiert werden müssen.

Zusätzlich gibt es Deletionen der HS2-4 der LCR, die das beta-Globingen vollständig inaktivieren, obwohl es strukturell unangetastet bleibt [Vanin et al., 1983; Curtin & Kan, 1988; Driscoll et al., 1989]. Eine isolierte Deletion der HS1 wirkt sich dagegen funktionell nicht aus [Kulozik et al., 1991b].

Ebene der RNA-Verarbeitung

Mutationen der CAP-Stelle oder des Poly A-Signals beeinträchtigen die RNA-Stabilität, die Effizienz der weiteren RNA-Verarbeitung und die Proteinsynthese. So verursacht eine A rarr C-Mutation des CAPs einen milden Phänotyp, denn die Restaktivität des Gens beträgt 50 % [Myers et al., 1986; Wong et al., 1987]. Im anderen Fall weisen Mutationen des Poly A-Signals eine verbleibende Aktivität von nur 10-20 % auf [Orkin et al., 1985].

Ein anderer Mutationstyp stört den Vorgang des Spleißens, indem eine Änderung der physiologischen Konsensussequenzen erfolgt. Sind die hochkonservierten GT/AG-Nukleotide betroffen, kann keine normale RNA-Reifung stattfinden. Das Gen ist vollständig inaktiviert und somit funktionslos, eine beta°-Thalassämie resultiert [Treisman et al., 1983]. Homozygot betroffene Patienten erleiden eine schwere, transfusionsbedürftige Thalassaemia major. Sind jedoch die weniger stringent konservierten Konsensussequenzen verändert, trifft man auf eine beta+- oder beta++-Thalassämie [Wainscoat et al., 1983 a; Lapoumeroulie et al., 1986]. Beispiele hierfür sind die G rarr A-Mutation an Position 5 (IVS1-5 G rarr A) und die Trarr C-Mutation an Position 6 des ersten Introns (IVS1-6 T rarr C). Im Gegensatz dazu bewirken die G rarr T- und G rarr C-Mutationen an Position 5 des ersten Introns (IVS1-5) eine Restaktivität von weniger als 5 %, was sich klinisch in einer schweren Form der Thalassämie niederschlägt, ein Beispiel für die unterschiedliche Relevanz der genannten Mutationen [Treismann


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et al., 1983; Kazazian et al., 1984; Atweh et al., 1987].

Bei einem weiteren Mutationstyp entstehen pathologische Konsensussequenzen, die eine abnorme RNA-Verarbeitung zur Folge haben. Hierzu zählen die G rarr A-Mutation an Position 110 des ersten Introns (IVS1-110 G rarr A) und die C rarr G-Mutation an Position 745 des zweiten Introns (IVS2-745 C rarr G). Erstgenannter Basenaustausch verändert die normale TTGG-Sequenz zu TTAG, die identisch mit der physiologischen Spleißakzeptorstelle 20 bp weiter 3´ ist. Infolgedessen werden 90 % der pre-RNA an diesem kryptischen Spleißsignal falsch gespleißt. Die Restaktivität des Gens macht sich im Vergleich zu einer beta°-Thalassämie (keine Restaktivität des beta-Globingens) klinisch kaum bemerkbar, homozygote Patienten sind regelmäßig transfusionsbedürftig [Spritz et al., 1981; Westaway & Williamson, 1981]. Analog verhält es sich mit der IVS2-745 C rarr G-Mutation, die eine pathologische Spleiß-Donorsequenz entstehen läßt [Treismann et al., 1983].

Vergleichbare Mutationen sind auch in den Protein-kodierenden Bereichen zu finden, erwähnenswert sind das HbE und das Hb-Knossos, die außer der Veränderung der Aminosäurensequenz des beta-Globingens noch eine Aktivierung verborgener Spleißsignale zur Konsequenz haben [Orkin et al., 1982 a; Bunn & Forget, 1986].

Translationsebene

Dem physiologischen Ablauf entsprechend wird die Nukleotidsequenz in Protein translatiert. Dabei signalisieren die Kodons UAA, UAG und UGA das Ende der Proteinsynthese, sie fungieren als Stopkodons. Pathologische Stopkodons entstehen durch Basensubstitutionen oder durch Deletionen bzw. Insertionen, die das normale Leseraster verschieben. Erstere bezeichnet man als Nonsense-Mutationen und letztere als Frameshift-Mutationen; beide setzen das Gen vollständig außer Kraft (beta°-Thalassämie).

Posttranslationale Ebene

Ein Teil der Mutationen, die die Aminosäurensequenz ändern (Missense-Mutationen), verursachen den vorzeitigen Abbau der beta-Globinketten im Knochenmark, da diese eine starke Instabilität aufweisen [Kazazian & Boehm, 1988]. Andere Mutationen führen zur Synthese instabiler Ketten, die nicht vorzeitig abgebaut werden, sondern in den Erythrozyten ausfallen und so eine Innenkörper-beta-Thalassämie hervorrufen. Diese seltene Form der beta-Thalassämie folgt dem autosomal dominanten Erbgang [Thein et al., 1990].

Die klinische Variabilität der homozygoten beta-Thalassämie erklärt sich einerseits durch die verschiedenen Mutationen, die ihrerseits die Genexpression unterschiedlich stark beeinflussen. Dadurch entsteht ein breites Spektrum an beta-Globingen Restaktivitäten.

Andererseits spielen auch Veränderungen der alpha- oder gamma-Globingenexpression eine entscheidende Rolle für die klinische Variabilität der homozygoten beta-Thalassämie. So kann der für die homozygote beta-Thalassämie pathogenetisch entscheidende Überschuß an alpha-Ketten durch eine alpha-Thalassämie, bei der 2 der 4 alpha-Gene inaktiviert sind, so vermindert werden, daß eine Thalassaemia intermedia entsteht. Im umgekehrten Fall jedoch kann aus einer asymptomatischen heterozygoten beta-Thalassämie ein schweres Krankheitsbild entstehen, wenn überschüssige alpha-Globingene vererbt werden [Wainscoat et al., 1983 b; Kanavakis et al., 1982; Thein et al., 1984].

Einen ebenfalls günstigen Effekt auf den Verlauf einer homozygoten beta-Thalassämie hat die zusätzliche


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genetisch bedingte Bildung von gamma-Globinketten, wie im Falle der HPFH (Hereditäre Persistenz fetalen Hämoglobins). Bei dieser Konstellation können sich die überschüssigen alpha-Globinketten mit den vermehrt produzierten gamma-Ketten zu HbF verbinden (s. auch Übersicht S. 14) [Wood et al., 1977; Giglioni et al., 1984; Kulozik et al., 1988 ].

Das Verständnis der molekularen Pathologie der beta-Thalassämie ist für den Kliniker von besonderem Interesse, da es als praktische Konsequenz die Möglichkeit einer spezifischen Diagnostik, einschließlich der pränatalen Krankheitserkennung, und nicht zuletzt eine prognostische Abschätzung der Erkrankung ermöglicht [Kulozik, 1991c].

Tab. 2: Durch beta-Thalassämiemutationen gestörte Schritte der Genexpression, modifiziert nach Kulozik, 1991c.

 




Ebene der Genexpression

Mutationstyp

Beispiele

Phänotyp









DNA

Deletion

619 bp

beta°

Transkription

Promotormutation

-28 A rarr C

beta++



-87 C rarr G

beta++


Deletion der HS2-4


beta°

RNA-Verarbeitung




Capping

Mutation der CAP-Stelle

ACA rarr CCA

beta++

Spleißen

Mutation der splice junction

IVS1-1 G rarr A

beta°


Mutation der weniger stringenten

IVS1-5 G rarr A

beta++


Konsensussequenzen

IVS1-6 T rarr C

beta++


Aktivierung verborgener Spleißsignale

IVS1-110 G rarr A

beta+



IVS2-745 C rarr G

beta+



Codon 26 GAG rarr AAG

beta+/HbE

Polyadenylierung

Mutation des Poly A-Signals

AATAAArarr AATGAA

beta+

Translation

Frameshift-Mutationen

FS 8 AAG rarr --G

beta°


Nonsense-Mutationen

NS 39 CAG rarr TAG

beta°


Initiations-Kodon-Mutationen

ATG rarr ATA

beta°

Gen-Produkt

instabile beta-Ketten

HbTerre Haute

beta+, autosomal dominant vererbte beta-Thal.

1.1.3. Klinisches Bild, Diagnostik und Therapie der beta-Thalassämie

1.1.3.1. Pathophysiologie der beta-Thalassämie

Die beta-Thalassämie ist durch eine verminderte Bildung von beta-Globinketten geprägt (Abb. 2). Zunächst ergibt sich aus dem mangelnden Angebot an beta-Ketten eine gestörte Hämoglobinisierung der Erythrozyten, was sich als mikrozytäre, hypochrome Anämie bemerkbar macht. Pathophysiologisch besonders wirksam erweist sich jedoch der Überschuß an freien alpha-Ketten. Diese Ketten haben die Eigenschaft, schlecht wasserlöslich zu sein und somit schon in den erythroiden Vorläuferzellen des Knochenmarks zu präzipitieren. Sie schädigen die Zellmembran, bedingen einen vorzeitigen Untergang dieser Zellen und bewirken letztendlich eine ineffektive Erythropoese mit meist transfusionsbedürftiger Anämie. Die Anämie ihrerseits führt zu einer Erythropoetin-vermittelten Hyperplasie des Knochenmarks und damit verbundenen Skelettdeformitäten (sog. Facies thalassaemica), sowie zum gesteigerten Folat- und Energiebedarf. Die häufigen Transfusionen


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und die erhöhte intestinale Eisenresorption lassen eine Hämosiderose entstehen, in deren Folge Kardiomyopathie, Leberfibrose und multiple endokrine Ausfälle auftreten [Kulozik, 1994 a].

Abb. 2: Schematische Darstellung der Pathogenese der beta-Thalassämie, modifiziert nach Kulozik, 1991c.

1.1.3.2. Klinisches Bild

Die beta-Thalassämie ist eine autosomal rezessiv vererbte Erkrankung; heterozygote Überträger sind klinisch gesund. Im Blutbild fällt jedoch eine ausgeprägte Mikrozytose und Hypochromie der Erythrozyten auf, ohne oder mit geringer Anämie. Bei der heterozygoten beta-Thalassämie spricht man von der Thalassaemia minor, eine der wichtigen Differentialdiagnosen des Eisenmangels und anderer Ursachen der Hypochromie. Die Diagnose ist durch das obligat erhöhte HbA2 bei heterozygoten Probanden einfach zu stellen. Das erhöhte HbA2 erklärt sich folgendermaßen: Normalerweise besitzen die delta- im Vergleich zu den beta-Globinketten eine geringere Affinität zu den alpha-Globinketten. Liegt jedoch eine beta-Thalassämie vor, sind weniger beta-Globinketten verfügbar und das Angebot an freien alpha-Ketten steigt. Die Bildung des HbA1 (alpha2beta2) verschiebt sich zugunsten der Bildung von HbA2 (alpha2delta2). Eine Erhöhung des HbF ist im Falle der heterozygoten beta-Thalassämie nicht obligat.


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Die Mikrozytose ist das Resultat des Überschusses an präzipitierenden alpha-Globinketten, die das erythrozytäre Zytoskelett oxidativ schädigen.

Ein weiteres typisches hämatologisches Kriterium im Vergleich zur Eisenmangelanämie ist die Erythrozytose bei nur gering erniedrigter Hämoglobinkonzentration. Wichtige morphologische Hinweise auf das Vorliegen einer heterozygoten beta-Thalassämie sind eine Anisozytose, eine ganz geringe Poikilozytose sowie eine Hypochromasie und eine basophile Tüpfelung [Galanello et al., 1981; Joishy et al., 1986; Kutlar et al., 1990].

In manchen Fällen der heterozygoten beta-Thalassämie kann es zur stärkeren Ausbildung der Erkrankung kommen, wie sich anhand der Pathophysiologie bzw. dem alpha-Globinkettenüberschuß leicht herleiten läßt. Solche Patienten besitzen fünf oder sechs statt der normalen vier alpha-Globingene, die den schon vorhandenen alpha-Ketten- Überschuß noch verstärken [Galanello et al., 1983; Sampietro et al., 1983; Kulozik et al., 1987].

Homozygote Patienten der beta-Thalassämie bilden eine Thalassaemia major aus. Dieser Phänotyp ist von einer lebenslang transfusionsbedürftigen Anämie geprägt, die unbehandelt schon im frühen Kindesalter zum Tode führt. Jedoch kann die homozygote Form den milderen Typ der Thalassaemia intermedia ausbilden, wenn der alpha-Globinkettenüberschuß weniger ausgeprägt ist. Diese Patienten haben den Vorteil, nicht dem Zwang einer regelmäßigen Transfusion zu unterliegen, in besonders günstigen Fällen kann auf Transfusionen ganz verzichtet werden. Die Pathogenese der Thalassaemia intermedia kann der nachfolgenden Übersicht entnommen werden [Kulozik, 1994 a].

Pathogenese der Thalassaemia intermedia bei

  1. homozygoter beta-Thalassämie
    Thalassämiemutationen mit einer hohen Restaktivität des beta-Globingens
    HPFH-Mutationen
    alpha-Thalassämiemutationen
  2. heterozygoter beta-Thalassämie
    triplizierte alpha-Globingene
    autosomal vererbte beta-Thalassämie
    instabile beta-Globinketten

1.1.3.3. Diagnostik

Die Diagnose einer Thalassaemia major wird meist im 1. Lebensjahr gestellt. Gedeihstörungen, zunehmende Blässe, Infektneigung und eine Auftreibung des Abdomens infolge der Hepatosplenomegalie sind die ersten Symptome. Entscheidendes klinisches Kriterium für die Definition der Thalassaemia major ist die permanente Transfusionsabhängigkeit.

Das Blutbild zeigt eine schwere Anämie mit Anisozytose und Poikilozytose, Targetzellen und Erythroblasten treten in Erscheinung. Gesichert wird die Diagnose durch das erhöhte HbF in der Hämoglobinanalyse. In Tab. 3 sind die hämatologisch wichtigen Daten der heterozygoten und homozygoten Thalassämie zusammengefaßt.


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Tab. 3: Hämatologische Daten zur Diagnosesicherung, modifiziert nach Galanello et al., 1981.





Kriterien

Referenzwerte

heterozygote beta-Thal.

homozygote beta-Thal.












Hb

w: 12-15 g/dl

7,5-10 mmol/l

~10g/dl

~ 6 mmol/l

< 8g/dl

< 5 mmol/l


m: 14-18 g/dl

9,0-11 mmol/l





MCV

80-96 fl


60-70 fl




MCH

28-33 pg

1,8-2,0 fmol

20-25 pg


darr


MCHC

31-37 g/dl

4,8-5,8 mmol/ l



darr


HbA1 (alpha2beta2)

97 %




0 oder darrdarrdarr


HbA2 (alpha2beta2)

2,50 %


3,5-6,0 %


normal oder uarr


HbF (alpha2gamma2)

0,50 %


< 1-(5) %


uarruarr









Von großer Bedeutung für die genetische Beratung und die Pränataldiagnostik ist die Identifikation der Thalassämiemutationen und die damit verbundene Familienuntersuchung [Kulozik, 1994 a]. Durch genaue Kenntnis der molekularen Basis des genetischen Defekts lassen sich individuelle Prognosen abschätzen, die der großen klinischen Variabilität Rechnung tragen.

1.1.3.4. Therapie

1.1.3.4.1. Konventionelle Behandlungsverfahren

Die beta-Thalassämie ist eine chronische Erkrankung, deren Behandlung zum gegenwärtigen Zeitpunkt ein Überleben bis in die vierte Lebensdekade hinein gewährleisten kann [Piomelli, 1993]. Große Studien ergaben jedoch, daß nur 60-70 % der Patienten das 20. Lebensjahr erreichen, lediglich 40 % davon ohne wesentliche Komplikationen [Gabutti et al., 1989; Ehlers et al., 1991]. Die Therapie der Thalassaemia major hat sich über einen Zeitraum von mehr als 30 Jahren entwickelt und zu einer wesentlichen Verbesserung der Lebenserwartung und -qualität beigetragen. Die Therapie stützt sich auf folgende Pfeiler: Transfusionen, Therapie mit Chelatbildnern, Splenektomie und Knochenmarktransplantation.

Für die Standardtherapie steht dem Patienten ein Protokoll zur Verfügung, bestehend aus einer täglichen Gabe von Chelatbildnern und einer in regelmäßigen Abständen durchgeführten Erythrozytensubstitution. Nicht weniger bedeutsam ist die umfassende Überwachungsdiagnostik zur Kontrolle der positiven und negativen Effekte der Therapie (Hämosiderose, Hepatitis oder HIV-Infektion nach Transfusion bzw. Infektionen nach Splenektomie) [Gabutti et al., 1989].

Transfusion

Die Thalassaemia major wird seit Beginn der 60iger Jahre durch Bluttransfusionen behandelt, mit dem Ziel, die endogene Erythropoese zu supprimieren und die Anämie komplett zu korrigieren. Die Bluttransfusionen sollten schon in früher Kindheit zur Anwendung kommen, um Knochenmißbildungen vorzubeugen. Den betroffenen Kindern wird so ein normales Wachstum ermöglicht und die Facies thalassaemica erspart. Vorraussetzung dafür ist jedoch, daß der Hämoglobinwert beständig bei 10,5 g/dl liegt [Rebulla & Modell, 1991]. In praxi müssen die Patienten aller 3-4 Wochen transfundiert werden [Piomelli, 1993].


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Therapie mit Chelatbildnern

Die Nebenwirkungen der Transfusionen bestehen in der Ausbildung einer Hämosiderose, die nach ersten Versuchen 1962 heute mit Deferoxamin (DFO) behandelt wird. Normalerweise liegt der Gesamteisengehalt des Menschen bei 4 g. Die intestinale Resorption reguliert dieses Gleichgewicht, indem nur soviel Eisen resorbiert wird, wie notwendig ist. Durch die Transfusionsbehandlung wird der intestinale Resorptionsblock umgangen, die Eisenüberladung ist vorprogrammiert. Bei einem durchschnittlichen Transfusionsbedarf von 200 ml Erythrozytenkonzentrat pro Jahr und kg Körpergewicht werden einem 30 kg schweren Patienten jedes Jahr 6 g Eisen, also das 1,5 fache des normalen Gesamtkörpereisens zugeführt [Kulozik, 1994 a]. Erschwerend kommt hinzu, daß der menschliche Organismus über keinen Mechanismus der Eisenelimination verfügt. Die Organschäden betreffen in erster Linie das Herz, die Leber und die endokrinen Organe [Aldouri et al., 1990; Vullo et al., 1990]. Häufig kommt es zur Entwicklung eines Diabetes [De Sanctis et al., 1988].

Zur Vermeidung der Hämosiderose wird das derzeit einzig zugelassene Medikament Deferoxamin verabreicht, das als eisenbeladenes Feroxamin ausgeschieden wird. Das Pharmakon ist nur als Dauerinfusion oder nach subkutaner Injektion wirksam, was eine hohe Kooperationsbereitschaft des Patienten und der Familie erfordert. Die Liste der Nebenwirkungen ist lang: Innenohrschwerhörigkeit, Katarakte, Visuseinschränkung, Knochen- und Gelenkschmerzen, Hemmung der Wachstumsgeschwindigkeit [Kulozik, 1994 a].

Splenektomie

Ein Großteil der Patienten leiden an einem Hypersplenismus, der mit einem gesteigerten Transfusionsbedarf (200 ml Erythrozyten/ kg KG und Jahr) assoziiert ist. Ursachen der Milzvergrößerung sind einerseits die extramedulläre Blutbildung und die Aktivierung des RES infolge der Stimulation durch chronische Hämolyse, rezidivierende Infektionen und Phagozytose präzipitierter alpha-Globinketten. Andererseits ist die Speicherung großer Erythrozytenmengen für die Splenomegalie verantwortlich. Nach Splenektomie sinkt der Bedarf an Erythrozytenkonzentraten auf 150-160 ml [Piomelli, 1993]. Ziel des Eingriffs ist die Reduktion der zugeführten Eisenmenge.

Der Langzeiteffekt einer Milzentfernung ist abhängig von der präoperativen Ausgangssituation jedes einzelnen Patienten. Eine retrospektive Studie von 30 splenektomierten Patienten ergab, daß Patienten mit einer Thalassaemia major, die vor dem Eingriff monatlich, nach der Splenektomie nur noch 5-8mal im Jahr transfundiert werden mußten. Leider blieb dieser positive Effekt nur für einen limitierten Zeitraum von 1-2 Jahren bestehen. Demgegenüber konnte bei Patienten mit einer Thalassaemia intermedia (0-4 Transfusionen pro Jahr) ein kontinuierlich verminderter Transfusionsbedarf assoziiert mit einer Erhöhung des Hämoglobinniveaus um 2-3 g/dl erreicht werden [Engelhard et al., 1975].

Knochenmarktransplantation (KMT)

Die erste und erfolgreiche allogene KMT wurde 1981 in Seattle an einem 15 Monate alten Jungen durchgeführt. Bis zu diesem Zeitpunkt hatte es noch keine kurative Behandlung der beta-Thalassämie gegeben. Im gleichen Jahr wurde in Pesaro ein klinisches Programm für die KMT gestartet [Apperley, 1993]. Die Ergebnisse von 546 Transplantationen an Thalassämie erkrankten Patienten, davon 528 von Geschwistern mit identischem HLA-Genotyp und 18 von Eltern mit identischem HLA-Phänotyp, liegen jetzt vor. Dabei handelt es sich in erster Linie um Transplantationen an Patienten unter 16 Jahren, die in drei Risikoklassen unterteilt wurden. Die Einteilung basierte auf folgenden Kriterien: vorliegende Hepatomegalie und/oder Leberfibrose, Qualität der


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Chelatbehandlung vor der Transplantation. Klasse-I-Patienten wiesen keine dieser Kriterien auf, Klasse-II-Patienten wiesen einen oder zwei der Risikofaktoren auf und Klasse-III-Patienten zeigten sowohl eine Hepatomegalie und Leberfibrose als auch eine schlecht geführte Therapie mit Eisenchelatbildnern. Patienten, die älter als 16 Jahre waren, wurden der Klasse III zugeordnet. Tab. 4 faßt die Ergebnisse in Pesaro zusammen [Giardini et al., 1995 a].

Tab. 4: Ergebnisse des Zentrums für KMT; Pesaro, Italien [Giardini et al., 1995]. (1 retrospektive Zuordnung zur Klasse III, 2 prospektive Zuordnung zur Klasse III)







Klasse I

Klasse II

Klasse III

KMT bei Erwachsenen












Anzahl (n)

64

188

551

472

58

Zeitraum

1985-1992

1985-1992

1983-1989

1989-1992

ab 1992

Überlebende (%)

95

86

55

87

78

Abstoßung des Transplantats (%)

5

6

9

29

4

Mortalität, nicht durch Abstoßung hervorgerufen (%)

5

12

42

11

22







Obwohl die KMT die normale Hämatopoese wiederherzustellen vermag und die Patienten von regelmäßigen Transfusionen entbindet, verbleibt die Eisenüberladung für Jahre nach der KMT nachweisbar an einem permanent hohen Serumferritingehalt und histologisch gesicherten Eisenablagerungen in der Leber. Dies gilt in erster Linie für Patienten der Klasse III und teilweise für Klasse-II-Patienten, hervorgerufen durch ihre schlechte Ausgangslage hinsichtlich der Hämosiderose vor der KMT. Demgegenüber ist die Eisenüberladung in Klasse-I-Patienten nach erfolgreicher Transplantation nicht fortschreitend und die Menge des gespeicherten Eisens im Gewebe sinkt [Lucarelli et al., 1992; 1993]. Aus diesen Daten geht hervor, daß bei entsprechenden Patienten eine Eisendepletion fortgeführt werden muß. Neben der Therapie mit DFO kann die Phlebotomie eingesetzt werden, wenn die Blutwerte das erlauben und die Patienten diese Behandlung tolerieren. Ziel der Therapien ist der Stop des chronisch-entzündlichen Prozesses in der Leber und die Verhinderung einer Leberfibrose [Angelucci et al., 1993; Giardini et al., 1995 b].

Ungeachtet der großen Erfolge der KMT bleibt die konventionelle Therapie weiterhin ein wichtiger Baustein im Behandlungsregime der beta-Thalassämie, denn ca. 60 % der Kinder haben keinen HLA-identischen Spender zur Verfügung [Apperley, 1993].

1.1.3.4.2. Neue Strategien der Therapie: Supportiv und kurativ.

Die Erprobung neuer Pharmaka zur Erhöhung des totalen Hb bzw. des HbF erfolgt mit dem Ziel, die Zahl der Transfusionen zu verringern oder diese vollständig zu ersetzen. Getestet wurden unter anderem Erythropoetin, Hydroxyurea, Butyrate und Kombinationen dieser Agenzien [Rund & Rachmilewitz, 1995]. Besonders hoffnungsvoll erschienen Butyratderivate, welche in der Lage sind, die fetale Globinkettensynthese in vivo zu stimulieren. Gegenüber dem Butyrat haben sie den Vorteil, oral verfügbar zu sein und eine längere


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Plasmahalbwertszeit zu besitzen [Perrine et al., 1994; Collins et al., 1995]. Doch die klinischen Ergebnisse waren enttäuschend, da nur ein kleiner Teil der Patienten mit einer geringen Steigerung des HbF reagierte und transfusionsabhängige Patienten gar nicht auf die Therapie ansprachen [Collins et al., 1995; Sher et al., 1995].

Die Therapie mit oralen Chelatbildnern ist ein weiterer Weg zur Verbesserung der Lebensqualität, da sie die Infusionen ersetzen. Hoffnungsvolle Träger dieser Therapie (z. B. L1 1,2 Dimethyl-3-Hydroxypyrid-4-eins) müssen jedoch derzeit als ineffektiv und/oder sehr toxisch eingestuft werden; da Agranulozytose, Thrombozytopenie und Lupus erythematodes als schwere Nebenwirkungen beschrieben wurden [Hoffbrand et al., 1989; Bartlett et al., 1990; Mehta et al., 1991].

Wie schon erwähnt, hat nur ein kleiner Teil der Patienten einen HLA-kompatiblen Spender zur Verfügung. Aus diesem Grund müssen neue Wege gefunden werden, um alternative Quellen hämatopoetischer Stammzellen nutzbar zu machen. Zwei dieser neuen Quellen sind das Nabelschnurblut und die fetale Leber. Das Nabelschnurblut ist reich an hämatopoetischen Stammzellen und hat der KMT gegenüber folgende Vorteile: die Gewinnung der Stammzellen ist einfacher, das Risiko für den Fetus hinsichtlich einer stattgehabten viralen Exposition und des Auftretens von Abstoßungsreaktionen (GvHD) ist geringer [Wagner et al., 1994]. Stammzellen aus der fetalen Leber können von Aborten des ersten Trimesters gewonnen werden. Von Nachteil ist, daß diese Stammzellen intrauterin über eine intraperitoneale Injektion in den Empfänger gelangen müssen und diese Technik einer hohen Mortalitätsrate unterliegt. Der rationale Hintergrund dieser Vorgehensweise ist die immunologische Inkompetenz des Fetus, so daß HLA-nicht-kompatible Spenderzellen genutzt werden könnten [Touraine et al., 1992]. Darüberhinaus sollten neben den rationalen und technischen auch die ethischen Fragen dieser komplizierten Methode erörtert werden.

Das Konzept der Zukunft zur kurativen Behandlung der beta-Thalassämie ist die somatische Gentherapie. Dabei werden die Körperzellen, nicht aber die Keimzellen genetisch verändert, wodurch die genetische Identität des Organismus erhalten bleibt.

Eine effektive Gentherapie setzt einen sicheren, effizienten und stabilen Transfer eines funktionellen beta-Globingens in menschliche hämatopoetische Stammzellen voraus. In einem transgenen Mausmodell konnte der Transfer eines exogenen Globingens das Tier "heilen" [Costantini et al., 1986]. So gab es frühe und erfolgversprechende Ergebnisse bei der Expression von humanen beta-Globingenen im Mäuseknochenmark [Dzierzak et al., 1988]. Kompliziert gestaltete sich jedoch die quantitativ ausreichende Expression des exogenen Gens. Nach Identifikation der LCR war die Ursache der geringgradigen Expression gefunden, denn durch Einbringung dieser wichtigen Sequenz kam es zu einer gewebespezifischen und quantitativ fast physiologischen Expression [Grosveld et al., 1987]. Bis heute ist es jedoch ein ungelöstes Problem, daß retrovirale Vektoren mit einem LCR gekoppelten beta-Globingen strukturell besonders instabil sind [Kulozik, 1994 b; Rund & Rachmilewitz, 1995]. Daraus ergibt sich die eigentliche Schwierigkeit, die in der Entwicklung des geeigneten Vektors liegt. Retroviren benötigen sich teilende Zellen, die menschlichen Knochenmarksstammzellen jedoch, die Zielzellen des beta-Globin Gentransfers, teilen sich nicht aktiv und sind zudem noch sehr selten (1 von 106 Knochenmarkzellen) [Rund & Rachmilewitz, 1995].


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1.1.4. Geographische Verteilung der Erkrankung und populations-genetische Aspekte

Die beta-Thalassämien gehören zu den häufigsten monogenen Erbkrankheiten weltweit. Ihr Vorkommen beschränkt sich nicht auf die Mittelmeerländer, sie sind auch in Westafrika und weiten Teilen Asiens stark vertreten. Etwa 150 Millionen Menschen (3 % der Weltbevölkerung) tragen ein beta-Thalassämie-Gen [Weatherall & Clegg., 1981]. Nicht alle 180 Mutationen sind auch in allen ethnischen Gruppen anzutreffen. So macht die Nonsense-Mutation im Kodon 39 (NS 39 C rarr T) allein in Sardinien etwa 95 % aller Thalassämie-Gene aus. Die Populationsgenetik ist in Tab. 5 zu sehen. Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß in den meisten ethnischen Gruppen ca. 10 Mutationen 90 % aller Thalassämie-Gene repräsentieren. Dadurch erfährt das genetische Screening und die Pränataldiagnostik eine Erleichterung [Kulozik, 1991c].

Tab. 5: Geographische Heterogenität der molekularen Anatomie der beta-Thalassämie, modifiziert nach Kulozik, 1991c.





Land

Anzahl der Mutationen, die > 90 % aller beta-Thalassämie-Gene repräsentieren

häufigste Mutationen

%









Italien




Sardinien

1

NS 39

95

Sizilien

3

NS 39

35



IVS1-6 T rarr C

29

Griechenland

7

IVS1-110 G rarr A

42



NS 39

17

Jugoslawien

10

IVS1-110 G rarr A

45



IVS1-6 T rarr C

19

Bulgarien

10

IVS1-110 G rarr A

24



NS 39

22

Türkei

10

IVS1-110 G rarr A

39



IVS1-6 C rarr T

18

Zypern

4

IVS1-110 G rarr A

70

Libanon

6

IVS1-110 G rarr A

62

Schwarzamerikaner

6

- 29 A rarr G

55

Indien

6

IVS1-5 G rarr C

22



619 bp Deletion

22

Malaysien

8

IVS1-5 G rarr C

49

Indonesien

8

IVS1-5 G rarr C

44

Süd-China

5

FS 41/42

46

Spanien

3

NS 39

64

Portugal

4

NS 39

53





Zwangsläufig stellt sich die Frage, warum in manchen Gebieten die Genfrequenz der beta-Thalassämie so hoch ist, in anderen dagegen nicht. Haldane hatte schon vor über 40 Jahren eine Theorie. Die Thalassämien schützen ihre Träger vor Malaria; somit ist die natürliche Selektion verantwortlich für die Steigerung der Genfrequenz in den Endemiegebieten des Plasmodium falciparum. Dabei haben wiederrum die heterozygoten Träger einen Selektionsvorteil, da die homozygot Betroffenen sterben, bevor sie das reproduktive Alter erreichen. Die Verteilung der beta-Thalassämie koinzidiert mit dem Vorkommen der Malaria und die Genfrequenz korreliert mit dem endemischen Auftreten der Malaria [Flint et al., 1993].


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Luzzi et al. [1991] stellten eine Hypothese auf, die die Resistenz der an Thalassämie Erkrankten gegenüber Plasmodium falciparum erklärt. Sie fanden heraus, daß Plasmodium falciparum infizierte alpha- und beta-thalassämische Blutzellen über eine spezifische Exprimierung von Oberflächenantigenen in der Lage sind, größere Mengen Antikörper zu binden als normale Zellen. Die gesteigerte Immunantwort ermöglicht folglich eine schnellere und effizientere Beseitigung der infizierten Blutzellen.

1.1.5. Die beta-Thalassämie in der deutschen Bevölkerung

Die erste Beobachtung einer Thalassaemia major bei einem deutschen Kind geht auf 1941 zurück. Das Kind zeigte typische Zeichen der Cooley Anämie, jedoch war derzeit eine Diagnosesicherung über die Bestimmung des HbF noch nicht möglich [Graser, 1941]. Über je einen weiteren Fall der Thalassaemia major bei einem deutschen Kind berichteten Flatz et al. 1964 und Teichgräber & Kleihauer 1969. Die molekulare Charakterisierung des homozygoten Falles von Flatz et al., erfolgte 1989 durch Eigel et al., die nach Sequenzierung des Gens eine G rarr T-Transversion an Position 5 des ersten Introns erkannten. Aus dem beobachteten Auftreten der Thalasaemia major mit einer Häufigkeit von 1:4×106 errechneten Weicker und Hauke die Häufigkeit der Thalassaemia minor in der deutschen Bevölkerung mit etwa 1:1000 [Flatz et al., 1964].

Betke & Kleihauer [1962] führten von 1959-1962 Reihenuntersuchungen an der Universitätsklinik Tübingen durch, um zu quantifizieren, wie häufig Hämoglobinanomalien in Deutschland sind. In 384 eingesandten Blutproben deutscher Patienten mit einer unklaren Anämie wurden 35 Fälle einer Thalassaemia minor mit erhöhtem HbA2 gefunden.

Kohne & Kleihauer [1974] führten im Zeitraum von 1963-1973 die Untersuchungen von Betke & Kleihauer systematisch fort. Sie berichteten über die Ergebnisse von 5763 Hämoglobinanalysen bei Patienten deutscher Herkunft. Dabei wurde der 4. Fall einer homozygoten beta-Thalassämie entdeckt und weitere 497 heterozygote Fälle identifiziert. Mit dieser Veröffentlichung wurden frühere Vorstellungen korrigiert, nach denen anomale Hämoglobine und Thalassämien in Deutschland eine Rarität darstellten, mit denen der praktische Arzt bei der einheimischen Bevölkerung kaum zu rechnen habe.

Laig et al. publizierten 1990 eine molekulare Analyse der beta-Thalassämie in der deutschen Bevölkerung. Sie untersuchten 40 Gene deutscher Heterozygoter, die keine verwandtschaftlichen Beziehungen aufwiesen. Es gelang, 26 Gene zu typisieren, die alle mediterrane Mutationen zeigten (20x NS 39, 3x IVS1-110, 2x IVS2-1, 1x IVS1-1 G rarr A). 13 Proben konnten nicht charakterisiert werden. Die Ergebnisse unterstreichen die Annahme, daß die bei Deutschen gefundenen Mutationen ursprünglich aus dem Mittelmeerraum stammen und durch Migration in das Gebiet der heutigen Bundesrepublik Deutschland gelangten. So werden eingewanderte italienische Gastarbeiter, deren Zahl um 1900 70.000 auf 56 Millionen Deutsche [Meyers, 1904] betrug, als "Importeure der mediterranen beta-Thalassämie-Gene" bezeichnet. In der Untersuchung konnten keine regionalen Unterschiede im Verhältnis von mediterranen zu nicht identifizierten Mutationen nachgewiesen werden, weshalb die Hypothese, daß es durch römische Ansiedlungen zur Verbreitung des Thalassämie-Gens in der deutschen Bevölkerung kam, widerlegt zu sein scheint. Diese Schlußfolgerung wird durch die geringe Wahrscheinlichkeit des Überlebens eines Gens über 60-70 Generationen ohne Selektionsdruck unterstützt.


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1.2. Problemstellung

In der Bundesrepublik Deutschland zählt die beta-Thalassämie zu den seltenen Erkrankungen. Dennoch gibt es einzelne Berichte über das Vorkommen homozygoter Fälle in der einheimischen deutschen Bevölkerung (s. unter 1.1.5.). Wesentlich häufiger ist jedoch das Auftreten der heterozygoten beta-Thalassämie, die als Differentialdiagnose der mikrozytären, hypochromen Anämie einen besonderen Stellenwert erlangt.

Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Dokumentation der molekularen Pathologie der beta-Thalassämie bei Probanden deutscher Herkunft, d. h., die Analyse dieser monogenen Erbkrankheit in einem nicht-endemischen Gebiet.

Die gewonnenen Erkenntnisse sollen zur Beantwortung folgender Fragen herangezogen werden:

  1. Woher stammt die beta-Thalassämie in der einheimischen deutschen Bevölkerung?
  2. Welche beta-Globingen-Mutationen sind häufig bei autochthon Deutschen? Kann die Hypothese erhärtet werden, daß die bei Deutschen gefundenen Mutationen ursprünglich aus dem Mittelmeerraum stammen und durch Migration in das Gebiet der heutigen Bundesrepublik Deutschland gelangten?
  3. Können neue, in der Literatur nicht veröffentlichte Mutationen gefunden werden?
  4. Welche populationsgenetischen Aussagen lassen sich treffen? Sind in diesem Zusammenhang Paralellen zu früheren Veröffentlichungen [Laig et al., 1990] zu erkennen?

Im einzelnen ergeben sich daraus folgende Aufgabenstellungen:

  1. Etablierung der molekulargenetischen Basisdiagnostik (Allel-spezifische Oligonukleotid-Hybridisierung) für die beta-Thalassämie.
  2. Etablierung einer PCR mit biotinmarkierten Primern und anschließende radioaktive Sequenzierung mittels [alpha- 35S]dATP.
  3. Vollständige genotypische Charakterisierung der Probanden deutscher Herkunft mittels Allel-spezifischer Oligonukleotid-Hybridisierung und Sequenzanalyse.

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